Medio BBL en placa preparado para pruebas de sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae

Transcripción

1 Medio BBL en placa preparado para pruebas de sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae JAA(01) GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment= = Español USO PREVISTO GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment (agar GC II con enriquecimiento IsoVitaleX) se utiliza para las pruebas de sensibilidad de difusión en disco antimicrobiano 1 de Neisseria gonorrhoeae. RESUMEN Y EXPLICACION Debido al problema creciente de la resistencia de los gonococos a la penicilina y otros agentes antimicrobianos, los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) publicaron en 1987 directrices normativas para la detección, la manipulación y el control de N. gonorrhoeae 1 resistente a antibióticos. El medio recomendado para el método de difusión en disco de pruebas de sensibilidad antimicrobiana, era la base de agar GC, tal como el enriquecimiento IsoVitaleX. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) también recomienda el uso de agar GC con un suplemento definido (equivalente al enriquecimiento IsoVitaleX) para las pruebas de sensibilidad de difusión en disco antimicrobiano de N. gonorrhoeae 2,3. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO GC II Agar Base contiene caseína y peptonas de carne como fuentes de nutrientes, tampón de fosfato para controlar el ph y almidón de maíz para neutralizar los ácidos grasos tóxicos que puedan estar presentes en el agar. IsoVitaleX Enrichment es un suplemento definido que proporciona el factor V (nicotinamida adenina dinucleótido, NAD), vitaminas, aminoácidos, coenzimas, dextrosa, iones férricos y otros factores que favorecen el crecimiento de la Neisseria patógena. REACTIVOS GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Fórmula aproximada* por litro de agua purificada Digerido pancreático de caseína... 7,5 g Peptona de carne seleccionada... 7,5 g Almidón de maíz... 1,0 g Fosfato dipotásico... 4,0 g Fosfato monopotásico... 1,0 g Cloruro sódico... 5,0 g Agar... 12,0 g IsoVitaleX Enrichment... 10,0 ml * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. IsoVitaleX Enrichment Fórmula aproximada* por litro de agua purificada Vitamina B ,01 g L-glutamina... 10,0 g Adenina... 1,0 g Clorhidrato de guanina... 0,03 g Acido p-aminobenzoico... 0,013 g Dinucleótido de nicotinamida adenina... 0,25 g Pirofosfato de tiamina... 0,1 g Nitrato férrico... 0,02 g Clorhidrato de tiamina... 0,003 g Clorhidrato de L-cisteína... 25,9 g L-cistina... 1,1 g Dextrosa ,0 g * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Si se observa humedad en exceso, invertir la parte inferior sobre una tapa desplazada y permitir que se seque al aire para impedir que se forme una barrera estanca entre la parte superior y la inferior de la placa durante la incubación. Emplear una técnica aséptica y seguir las precauciones habituales contra riesgos microbiológicos durante todos los procedimientos. Después de su uso, las placas preparadas, los recipientes de muestra y otros materiales contaminados deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados. 1

2 Instrucciones para el almacenamiento: Al recibir las placas, almacenarlas en lugar oscuro a una temperatura entre 2 8 C. No congelar ni sobrecalentar. No abrir hasta que vayan a utilizarse. Reducir al mínimo la exposición a la luz. Las placas preparadas almacenadas en su envase original a 2 8 C hasta momentos antes de su utilización, pueden inocularse hasta la fecha de caducidad e incubarse durante los tiempos de incubación recomendados. Dejar que el medio alcance temperatura ambiente antes de realizar la inoculación. Deterioro del producto: No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamiento o cualquier otro signo de deterioro. RECOGIDA Y MANIPULACION DE LAS MUESTRAS Este medio no está diseñado para uso directo con muestras clínicas ni cultivos mixtos. La prueba de sensibilidad por medio del método de difusión en disco está diseñada para uso con cultivos puros. Se requiere tinción de Gram e identificación presunta de N. gonorrhoeae. PROCEDIMIENTO Material suministrado: GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Materiales necesarios pero no suministrados: 1. Caldo de inóculo, en tubos de 5 ml, tal como el caldo Mueller Hinton (tubo de 20 x 112 mm) o caldo Mueller Hinton II (tubo de 16 x 102 mm) para la preparación de un inóculo estándar. 2. Preparar un patrón de sulfato de bario McFarland de 0,5 para ajustar el inóculo (añadiendo 0,5 ml de 0,048 M BaCl 2 [1,175% peso/vol BaCl 2 2 H 2 O] a 99,5 ml de 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% peso/vol]). 3. Un dispositivo fotométrico para comparar el patrón de turbidez del sulfato de bario con la suspensión de inóculo. 4. Cultivo de control: Neisseria gonorrhoeae ATCC Discos de papel impregnados con cantidades específicas de agentes antimicrobianos, tales como los discos de prueba de sensibilidad BBL Sensi-Disc. 6. Dispositivo dispensador de discos, tal como el dispensador de autopisonamiento de 12 posiciones Sensi-Disc. 7. Dispositivo para medir o interpretar diámetros de zona, tales como el equipo de interpretación de zona Sensi-Disc. 8. Un reactivo o dispositivo para la realización de una prueba rápida de β-lactamasa, tal como los discos BBL Cefinase. 9. Un incubador que produce una atmósfera con CO 2 al 5 7% u otro dispositivo que produce una atmósfera aerobia enriquecida con CO Medios de cultivo auxiliar, reactivos y el equipo de laboratorio que se requiera. Procedimiento de análisis Se debe utilizar el método de suspensión de colonias al realizar la prueba de N. gonorrhoeae. Emplear técnicas asépticas. La superficie del agar debe ser lisa y húmeda pero sin humedad en exceso. 1. Preparar una tinción de Gram y realizar una prueba de oxidasa antes de comenzar con la prueba de sensibilidad para confirmar la pureza del cultivo y la posible identificación de N. gonorrhoeae. 2. Utilizar varias colonias bien aisladas extraídas directamente de una placa de agar chocolate del día anterior como origen del inóculo. 3. Se debe utilizar una prueba rápida de β-lactamasa (disco Cefinase) para evaluar la utilidad clínica de penicilina. Esta prueba rápida proporciona al clínico información de sensibilidad antimicrobiana valiosa antes que la prueba de difusión en disco. 4. Con colonias extraídas directamente de una placa de agar chocolate del día anterior, preparar una suspensión del organismo de prueba en caldo Mueller Hinton, caldo Mueller Hinton II o 0,9% y diluir con más caldo o solución salina hasta obtener una turbidez equivalente a la del patrón 0,5 de McFarland (véase Materiales necesarios pero no suministrados). Esta suspensión contendrá aproximadamente entre 1 y 2 x 10 8 UFC/mL. Se deben extremar las precauciones al preparar esta suspensión, dado que una concentración de inóculo más alta puede generar resultados resistentes falsos y un inóculo muy diluido puede generar resultados sensibles falsos. Se deben realizar periódicamente diluciones y recuentos en placa de suspensiones de inóculo para confirmar que el método de ajuste utilizado produce un inóculo de aproximadamente entre 1 y 2 x 10 8 UFC/mL. 5. Dentro de los 15 min de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda estéril en el inóculo correctamente diluido y hacerla rodar firmemente varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el líquido en exceso. 6. Inocular toda la superficie del agar de la placa tres veces, girando la placa 60 grados cada vez para obtener una inoculación uniforme. 7. Volver a colocar la tapa de la placa y mantener la placa a temperatura ambiente durante 3 5 min, pero no más de 15 min, para permitir que la humedad de la superficie se absorba antes de aplicar los discos impregnados de fármaco. 8. Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando técnicas asépticas. La mayoría de los agentes antimicrobianos produce zonas más grandes de inhibición cuando se los analiza con N. gonorrhoeae en comparación con otros organismos, en algunos casos se limita el número de discos a no más de 9 discos por placa de 150 mm. Una vez colocados los discos sobre el agar, presionarlos con una aguja o pinza estéril hasta obtener un contacto completo con el medio. Este paso no es necesario si los discos se han colocado con el dispensador de autoapisonamiento de 12 posiciones Sensi-Disc (no se accionarán los apisonadores de los orificios que no tengan cartuchos). 9. A los 15 min después de aplicar los discos, invertir las placas e incubar durante h a 35 C en atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5 7%. 2

3 Control de calidad del usuario: 1. Examinar si las placas presentan signos de deterioro (como se describe en Deterioro del producto ). 2. En el cultivo de control, Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226, deben incluirse cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad. Los límites de control para las zonas de inhibición se presentan en la Tabla 1 e indican el rendimiento correcto en todo el procedimiento TABLA 1. Límites de control de calidad para N. gonorrhoeae* N. gonorrhoeae Agente antimicrobiano Contenido del disco ATCC Cefepima 30 µg Cefixima 5 µg Cefotaxima 30 µg Cefotetan 30 µg Cefoxitina 30 µg Cefpodoxima 10 µg Ceftacidima 30 µg Ceftizoxima 30 µg Ceftriaxona 30 µg Cefuroxima 30 µg Ciprofloxacina 5 µg Enoxacino 10 µg Gatifloxacino 5 µg Lomefloxacino 10 µg Ofloxacina 5 µg Penicilina 10 unidades Estreptomicina 100 µg Trovafloxacina 10 µg * De la publicación CLSI M100, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; Approved standard. Con permiso. El control de calidad debe llevarse a cabo conforme a la normativa local y/o nacional, a los requisitos de los organismos de acreditación y a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio. Se recomienda consultar las instrucciones de CLSI y normativas de CLIA correspondientes para obtener información acerca de las prácticas adecuadas de control de calidad. RESULTADOS 1. Examinar las placas después de h de incubación. Se debe obtener una extensión confluente de crecimiento. Si sólo crecen colonias aisladas, el inóculo está demasiado diluido y debe repetirse la prueba. 2. Medir el diámetro de las zonas de inhibición completa (observadas a simple vista), incluido el diámetro del disco, hasta el milímetro más cercano, con calibradores, una regla o una plantilla preparada para dicho propósito. El dispositivo de medición se sostiene en la parte posterior de la placa de Petri, que se sostiene sobre un fondo negro no reflectante e iluminado por arriba. El criterio de valoración debe tomarse como el área que no muestre crecimiento visible evidente que pueda detectarse a simple vista. Desestimar el crecimiento leve de colonias diminutas que pueda detectarse con dificultad cerca del borde de la zona evidente de inhibición. 3. Consultar la tabla de normas de interpretación de diámetros de zona (Tabla 2) para obtener información acerca de cómo interpretar la información de resultados obtenidos de N. gonorrhoeae. Los resultados pueden describirse como resistentes, intermedios o sensibles, según los diámetros de zona obtenidos. Los organismos con resultado positivo de producción de β-lactamasa deben considerarse resistentes a la penicilina a pesar de los diámetros de zona obtenidos. 3

4 TABLA 2. Normas de interpretación de diámetros de zona para N. gonorrhoeae* Diámetro de zona, hasta el mm más cercano Agente antimicrobiano Contenido del disco Resistente Intermedio c Sensible Cefipima a 30 µg 31 Cefixima a 5 µg 31 Cefotaxima a 30 µg 31 Cefotetan 30 µg Cefoxitina 30 µg Cefpodoxima a 10 µg 29 Ceftazidima a 30 µg 31 Ceftizoxima a 30 µg 38 Ceftriaxona a 30 µg 35 Cefuroxima 30 µg Ciprofloxacina 5 µg Enoxacino 10 µg Gatifloxacino 5 µg Lomefloxacino 10 µg Ofloxacina 5 µg Penicilina b 10 unidades Estreptomicina 100 µg Trovafloxacina a 10 µg 34 * De la publicación CLSI M100, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; Approved standard. Con permiso. a Para estos agentes antimicrobianos, la ausencia de cepas resistentes excluye la posibilidad de definir otra categoría de resultados que no sea Sensible. Las cepas que proporcionen resultados indicativos de una categoría no sensible deben enviarse a un laboratorio de referencia para un nuevo análisis. b Los gonococos analizados con discos de 10 unidades de penicilina que muestren diámetros de 19 mm probablemente son: cepas productoras de β-lactamasa. Sin embargo, la prueba de β-lactamasa se prefiere a otros métodos de sensibilidad para la determinación rápida y exacta de esta resistencia a la penicilina mediada por plásmidos. c Un resultado intermedio para un agente antimicrobiano indica la existencia de un problema técnico, que debería resolverse mediante repetición de la prueba, o la falta de experiencia clínica en el tratamiento de organismos que producen estas zonas. El último caso parece ser lo que ocurre con el cefotetan, cefoxitina y estreptomicina (véase M2). Las cepas que tienen zonas intermedias con los otros agentes tienen una tasa de curación clínica documentada inferior (85 95%), en comparación con >95% de las cepas sensibles. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Se desconoce la capacidad para detectar la resistencia a la cefixima, cefotaxima, cefotetan, cefoxitina, cefpodoxima, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina, y ofloxacina en Neisseria gonorrhoeae debido a que las cepas resistentes no estaban disponibles en el momento del análisis. Con respecto a algunas combinaciones de organismos-agente antimicrobiano, la zona de inhibición tal vez no tenga un borde claramente demarcado, lo que puede llevar a una interpretación incorrecta. Debido al rendimiento no constante del cefmetazol, y más de 10 errores menores con tetraciclina, el uso de estos dos antimicrobianos en este medio está contraindicado. La concentración incorrecta de inóculo puede producir resultados inexactos. Las zonas de inhibición pueden ser demasiado pequeñas si el inóculo es demasiado denso y pueden ser demasiado grandes y difíciles de medir si el inóculo está muy diluido. El almacenamiento incorrecto de los discos antimicrobianos puede causar pérdida de potencia y resultados resistentes falsos. La sensibilidad in vitro de un organismo a un agente antimicrobiano específico no necesariamente significa que el agente tenga eficacia in vivo. Consultar las referencias correspondientes para obtener instrucciones para la interpretación de resultados 4,5. 4

5 CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Antes de su lanzamiento al mercado, todos los lotes de GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment se analizan para determinar sus características de rendimiento. Se analizan muestras representativas del lote con una suspensión de células de Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069, mediante inoculación con una suspensión de solución normal diluida a una concentración de 1x10 3 1x10 4 UFC/placa. También se analizan muestras Neisseria gonorrhoeae ATCC extendiendo en la superficie del medio una suspensión equivalente a al patrón 0,5 de McFarland. Se añaden discos con cantidades específicas de agentes antimicrobianos. Todas las placas se incuban a ºC durante un día en atmósfera aerobia enriquecida con CO 2. Se observa crecimiento de moderado a denso con N. gonorrhoeae ATCC Se observan zonas de inhibición correctas alrededor de los discos con N. gonorrhoeae ATCC DISPONIBILIDAD Nº de cat. Descripción BBL GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment, pqt. de 100 placas de tamaño 8 (150 x 15 mm) REFERENCIAS 1. Centers for Disease Control Antibiotic-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae: policy guidelines for detection, management, and control. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 36(Suppl.):1S-18S. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk Diffusion Supplemental Tables: M100. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 4. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5. Jorgensen, J.H. and J.D. Turnidge Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods, p In Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5

6 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD USA Benex Limited Pottery Road, Dun Laoghaire Co. Dublin, Ireland ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD 6