CINÉTICA ENZIMÁTICA. Ecuación de Michaelis-Menten Efecto de inhibidores

Transcripción

1 CINÉTICA ENZIMÁTICA Ecuación de Michaelis-Menten Efecto de inhibidores

2 Producto [P] CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Proporciona información acerca de como ocurren las reacciones y como actúan las enzimas. A una concentración de E fija, es casi linealmente proporcional a [S], cuando [S] es pequeña; pero se vuelve independiente de [S] cuando [S] es grande. Tiempo

3 Modelo de Michaelis-Menten En Leonor Michaelis y Maud Menten propusieron un modelo que se ajustó a estas características cinéticas. Postularon que primero E reacciona de forma reversible con S para formar el complejo ES, el siguiente paso de la reacción comprende la generación de P y la liberación de E. k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 De acuerdo a este modelo, cuando la [S] es suficientemente grande, de manera que toda la E se encuentra formando el complejo ES, el segundo paso de la reacción se convierte en el paso limitante y la velocidad global de la reacción se vuelve insensible al incremento en la [S].

4 Modelo de Michaelis-Menten Para poder ajustar el comportamiento cinético de las enzimas al modelo de Michaelis-Menten, deben tenerse las siguientes consideraciones: Prácticamente no hay P formado. La [S] es mucho mayor que la [E], por lo que se puede asumir que toda la E se encuentra formando el complejo ES. Estas consideraciones permiten tener la certeza de que [S] permanece constante durante la reacción. La varía de manera hiperbólica en relación a la [S], a una [E] fija. (μml/min) [E]= Constante [S] (mm)

5 Modelo de Michaelis-Menten La ecuación de Michaelis-Menten se deriva de las dos consideraciones anteriores: = k 2 [E t ][S] K M +[S] Dado que [E t ]= [E] + [ES] y se asume que toda la enzima se encuentra formando el complejo ES, entonces [E t ]= [ES]. Bajo estas condiciones en las que [E t ]= [ES], se alcanza la velocidad máxima de la reacción ( ) que puede ser definida como = k 2 [E t ]. Sustituyendo en la ecuación: = [S] K M +[S]

6 Modelo de Michaelis-Menten = [S] K M +[S] = k 2 [E t ][S] K M +[S] Donde: = Velocidad al tiempo t, en μm/min. = Velocidad máxima de la reacción a una [E] fija, en μm/min. [S]= Concentración de sustrato, en mm. K M = Constante de Michaelis-Menten, en mm. k 2 = Constante catalítica o número de recambio, en s -1. [E t ]= Concentración de enzima total, en mm.

7 K M K M es conocida como la constante de Michaelis-Menten, la cual está definida como la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es un medio de la. Por lo tanto, K M tiene unidades de concentración. Dividiendo 2 = [S] V 1 K + [S] M 2 = [S] max K + [S] M Despejando K M K M =2[S]-[S] [E]= Constante

8 K M La magnitud de K M varía ampliamente de acuerdo a la naturaleza de la enzima y del sustrato. También es una función de la temperatura y del ph. No depende de [E]! El valor de K M tiene dos significados: 1. Es una medida de cual es [S] requerida para que ocurra una catálisis significante. 2. Es una medida de afinidad de E por el S. k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 K M = k 1 + k 2 k 1 = k 1 k 1 Un valor de K M bajo indica que la unión de ES es muy fuerte (E tiene mucha afinidad por S), mientras que un valor de K M elevado indica que la unión ES es débil (E tiene poca afinidad por S).

9 o velocidad máxima, es la velocidad límite a la que tiende una reacción cuando [S] es muy elevada y E se encuentra saturada, es decir, se encuentra formando el complejo ES. Por lo tanto, tiene unidades de velocidad. [E]= Constante

10 Dado que se define en el estado estacionario, donde se asume que [E t ]= [ES]; entonces sí depende de [E]. =k 2 [Et] Si [E] es baja, entonces la también es baja. Un incremento en [E] provoca un incremento en la sin alterar el valor de K M. E: Malato deshidrogenasa [E]= 3.0 mm (μml/min) [E]= 1.0 mm K M [S] (mm)

11 k cat También conocida como constante catalítica o número de recambio. Este valor solo puede obtenerse cuando se tiene a la enzima pura y por lo tanto se conoce su concentración. Es el número de procesos de reacción (recambios) catalizados por un sitio activo por unidad de tiempo. Es igual a la constante cinética k 2 y tiene unidades de tiempo -1. =k 2 [Et] Despejando k 2 k 2 = [Et] Igualando k 2 a k cat k cat = [Et] Entre mayor sea el valor, quiere decir que la catálisis ocurre en un tiempo menor. Por ejemplo, el valor de k cat de la anhidrasa carbónica es de s -1 lo que quiere decir que cada reacción catalizada ocurre en un tiempo igual a 1/k cat, es decir cada 1.7 μs.

12 Eficiencia catalítica: k cat / K M Representa el paso de unión entre E y S. Cuanto mayor sea el valor, más rápida y eficientemente se convierte S en P (siendo los valores más altos M -1 xs -1. Permite comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos (entre mayor sea la eficiencia catalítica, la enzima tiene mayor preferencia por ese sustrato. Sustratos preferidos por la quimiotripsina.

13 Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten A [S] muy elevadas, la se aproxima de manera asintótica a. En la práctica, es muy difícil estimar el valor de directamente de los gráficos de en función de [S]. Por ello, se desarrollaron transformaciones a la ecuación de Michaelis-Menten que facilitan el cálculo de los parámetros cinéticos. Una de estas transformaciones es la de Lineweaver-Burk también conocida como Dobles recíprocos. (min/μm) 1 = K M 1 [S] + 1 Pendiente Este tipo de gráficos, permite identificar diferentes tipos de inhibidores. (1/μM)

14 Inhibición de la actividad enzimática Muchas sustancias pueden alterar la actividad de las enzimas. Las sustancias que reducen la actividad de las enzimas se conocen como inhibidores (I). Los inhibidores pueden clasificarse como: TOTALES. Toda E se encuentra de la forma EI y la velocidad de la reacción es cero. PARCIALES. Aun cuando toda E se encuentre de la forma EI, la velocidad de la reacción catalizada no es cero. IRREVERSIBLES. La formación del complejo EI es irreversible. Por ejemplo, cuando la unión de I con E es de tipo covalente. REVERSIBLES. El complejo EI puede disociarse. ISOSTÉRICOS. Se unen a E en el mismo sito que se une S. ALOSTÉRICOS. Se unen a E en un sitio diferente al que se une S.

15 Inhibición competitiva Muchos I de tipo competitivo son estructuralmente parecidos a S, formando un complejo EI pero sin dar lugar a la catálisis. I se une a E libre en el mismo sitio que S, interfiriendo con la formación del complejo ES. Un inhibidor competitivo actúa disminuyendo la cantidad de E libre disponible para unirse a S.

16 Inhibición competitiva Dado que I se une de manera reversible a E, la competencia puede favorecerse hacia S, añadiendo simplemente mayor [S]. Cuando [S] es mucho mayor que [I], la probabilidad de que una molécula de I se una a E disminuye y la reacción exhibe una normal. Sin embargo, [S] a la cual se logra ½ se incrementa; es decir K M aumenta. La K M observada en presencia de este tipo de inhibidores se denomina K M aparente. Hiperbólica: = [S] αk M +[S] Incremento [I] Lineal: Sin I 1 = αk M 1 [S] + 1 Pendiente

17 Inhibición acompetitiva ó incompetitiva I se une al complejo ES, interfiriendo con la formación del producto. El I se une a un sitio diferente al activo y únicamente al complejo ES, no a la E libre.

18 Inhibición acompetitiva ó incompetitiva A elevadas [S], en presencia de un inhibidor competitivo, se aproxima asintóticamente a / α. Por lo tanto, los efectos de la inhibición no se revierten incrementando [S]. Un inhibidor competitivo disminuye ( aparente), pero también disminuye K M aparente, porque la [S] requerida para lograr ½ disminuye por el factor α. Hiperbólica: = [S] K M + α [S] Incremento [I] Lineal: Sin I 1 = K M 1 [S] + α Pendiente

19 Inhibición mixta I se une tanto a E libre como al complejo ES, interfiriendo con la formación del complejo ES y del producto.

20 Inhibición mixta Se le denomina como mixta dado que el factor α afecta el valor de K M y el factor α afecta el valor de. Los efectos de la inhibición no se revierten incrementando [S]. Un inhibidor de tipo mixto, incrementa el valor de K M y disminuye el valor de Hiperbólica: = [S] αk M + α [S] Incremento [I] Lineal: Sin I 1 = αk M 1 [S] + α Pendiente

21 Inhibición no competitiva Es un tipo de inhibición mixta, es muy particular porque I se une con la misma afinidad a E libre y al complejo ES, interfiriendo con la formación del complejo ES y del producto.

22 Inhibición no competitiva En este caso el factor α= α. En esencia, este tipo de inhibidores lo que hacen es que disminuyen la concentración de E funcional. Los efectos de la inhibición no se revierten incrementando [S]. Un inhibidor de tipo no competitivo disminuye el valor de, sin alterar el valor de K M. Hiperbólica: Lineal: 1 = = α K M [S] α (K M + [S]) Incremento [I] 1 [S] + α Pendiente Sin I

23 Tipo de inhibición Parámetro que cambia α o α Competitiva Acompetitiva ó incompetitiva Mixta No competitiva / αk M αk M / α /K M K M / α / α /αk M αk M / α / α / α K M K M α= 1 + [I] K I α'= 1 + [I] K I α= 1 + [I] K I α'= 1 + [I] K I α'= 1 + [I] K I