SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS

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1 CÁTEDRA: BIOQUÍMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Química Licenciatura en Química Lic. en C. y T. de los Alimentos SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS 1) Suponga que desea purificar por cromatografía de intercambio iónico una enzima del metabolismo del ADN, cuyo sustrato es precisamente ADN. Seleccionaría una resina de intercambio aniónico o catiónico? Por qué? 2) La cromatografía de filtración en gel o de tamiz molecular es un método de separación proteica basado en el tamaño (o, más precisamente, en el radio efectivo en solución, el cual es proporcional, para proteínas esféricas, a la raíz cúbica del peso molecular). Una solución proteica se coloca en una columna empacada con pequeñas esferas de polímeros suficientemente hidratados y entrecruzados (Sephadex). Las proteínas de tamaños diferentes varían en su capacidad de penetrar los poros hidratados de las esferas. Las proteínas pequeñas penetran en estos poros y a medida que bajan en la columna lo hacen más lentamente que las proteínas de mayor tamaño. Una segunda técnica de separación de proteínas es la electroforesis. Las proteínas se someten a un campo eléctrico en un soporte en gel de poliacrilamida. Cuando la electroforesis se lleva a cabo en presencia de un agente desnaturalizante como el dodecil sulfato de sodio (SDS), junto a un agente reductor como el beta-mercaptoetanol ( ME), las moléculas proteicas desnaturalizadas se separan por tamaño, siendo las más pequeñas las que migran más rápidamente. El SDS desnaturaliza las proteínas uniéndose a ellas en forma no específica, pero proporcional a la cantidad de aminoácidos, dándoles una relación constante de carga/masa. Por otro lado, el βme rompe los puentes disulfuro, linealizando las moléculas. Ambos procedimientos separan a las proteínas según el tamaño y utilizan polímeros entrecruzados como medio de soporte. Cómo es posible que en la filtración en gel las moléculas pequeñas se retrasan respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo contrario? 3) Usted tiene una mezcla de tres proteínas A, B y C, con pi de 3,5, 6,5 y 10,0 respectivamente, y quiere separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene un pka = 9,5. Qué ph usaría para la separación? Qué orden de elución esperaría encontrar si agrega un gradiente de KCl entre 0 y 1 M? 4) La carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catiónico con un pka de 4,5. Ud. tiene tres proteínas A, B y C de pi 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y aplicando un gradiente de ph de menor a mayor eluyen en el siguiente orden: B- A- C. Estas mismas proteínas, en una columna de Sephadex G-100 eluyen como de un peso molecular (M r ) de , y y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS A y C presentaron una única banda de M r y B presentó dos bandas de M r y Identifique A, B y C. 1

2 5) Escriba el orden de elución de las siguientes proteínas al aumentar el gradiente salino en columnas de intercambio iónico. a) En una columna de intercambio aniónico se siembran citocromo C (pi = 10,5), lisozima (pi = 11,0), albúmina de huevo (ovoalbúmina, pi = 4,6), mioglobina (pi = 7,0) b) En una columna de intercambio catiónico se siembran citocromo C (pi = 10,5), pepsina (pi = 1,0), ureasa (pi = 5,0) y hemoglobina (pi = 6,8). Explique sus respuestas. 6) Tres proteínas de puntos isoeléctricos 5,2; 7,3 y 6,3 se denominaron con las tres primeras letras del alfabeto griego según su posición en un isoelectroenfoque, siendo alfa la más cercana al ánodo y gamma la más cercana al cátodo. a) Cuál es el pi de cada una? b) Cuál de las proteínas eluirá primero durante una cromatografía en carboximetilcelulosa a ph 6,0? Por qué? c) Si alguna proteína quedara retenida, cuál o cuáles serían y cómo las eluiría? d) Durante una electroforesis en poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes a ph 8,0, beta presentó la mayor movilidad electroforética. Es posible? Por qué? 7) Las proteínas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del ADN. Este se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partículas engarzadas como las cuentas de un collar. Una mezcla de tres proteínas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la siguiente composición de aminoácidos: Proteína Número de Residuos Asp y Glu Arg, Lys e His Otros AA A B C Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoeléctricos de las tres proteínas obteniéndose los siguientes valores: 3,0, 5,5 y 9,5. Las masas moleculares (m) obtenidas por cromatografía de exclusión molecular fueron de 15 kda, 11,3 kda y 21,5 kda. a) lndique el punto isoeléctrico, el peso molecular y el orden de elución en la columna cromatográfica de las tres proteínas. b) En base a sus conocimientos, podría decir cuái de las tres proteínas es H4? Fundamente su respuesta. 8) Usted necesita separar una mezcla de tres péptidos con actividad biológica. Los mismos poseen la siguiente secuencia: I. Asp-Gly-Glu-His-Pro-Ala-Ala-Asp-Ser-Thr II. Gly-Tyr-Ile-Ala-Phe-Gly-Leu-Val-Trp-Ala III. Gly-Ala-His-Lys-Ser-Gln-Thr-Asn-Lys Para ello cuenta con los siguientes soportes para realizar cromatografía líquida: DEAE-celulosa (-O-CH 2 -CH 2 -N + (C 2 H 5 ) 2 H), sulfometilcelulosa (-O- CH 2 SO - 3 ), Butil Sepharosa (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ) y Sephadex G-50. Describa un protocolo adecuado para la separación de estas tres biomoléculas e indique el fundamento de su decisión. 2

3 9) Ud. está buscando afanosamente una sustancia presente en el espárrago violeta de la Antártida, que cura (según dicen) el resfrío de los guanacos. En sus estudios termina purificando dos proteínas que no le curan el resfrío a nadie, pero que dan cristales violetas muy bonitos. Ambas proteínas tienen el mismo peso molecular en condiciones nativas (40.000), pero la composición de aminoácidos es muy distinta, salvo para las cisteínas. Tanto la proteína A como la B tienen dos cisteínas. El análisis de la proteína A pura indica que tiene un solo tipo de aminoácido N-terminal (treonina), pero el análisis de la proteína B reveló la existencia de dos tipos de extremos N-terminales (alanina y serina). a) Qué le sugiere que las proteínas corridas en un gel PAGE-SDS, no teñido con azul de Coomassie, den bandas de color violeta? b) Qué le indica la presencia de un solo tipo N-terminal en la proteína A y de dos tipos N-terminales en la proteína B? Cuando trata a la proteína A con urea, ya sea en presencia o en ausencia de mercaptoetanol, ésta da una única banda de Daltons en un gel de poliacrilamida con SDS. La proteína B, en cambio, se descompone en dos subunidades (una de y otra de Daltons) sólo cuando se la trata con urea y mercaptoetanol. Ni la urea ni el mercaptoetanol solos la disocian. c) Qué infiere de estos resultados respecto de la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas A y B? d) Por qué es tan diferente la respuesta al mercaptoetanol pese a que ambas proteínas tienen dos residuos de cisteína? e) Por qué no basta la urea para disociar la proteína B? Por qué no basta el mercaptoetanol para disociar la proteína B? 10) Una proteína en su estado nativo tiene un peso molecular de a) Deduzca su estructura cuaternaria (número de subunidades, peso molecular de cada una de ellas, uniones que las estabilizan y glicosilación de subunidades) a partir de los resultados de los siguientes geles de poliacrilamida en los que se sembró la proteína pura, la cual fue previamente sometida a tres tratamientos (por separado) que se indican abajo. Al final de la corrida electroforética, los geles fueron teñidos con Coomassie Blue, que es un colorante azul que tiene afinidad por las estructuras peptídicas. Tratamientos previos: SDS SÍ SÍ SÍ mercaptoetanol NO SÍ SÍ ENDO-H (corta la unión NO NO SÍ proteína-azúcar) 3

4 b) La sensibilidad del Coomassie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aproximadamente 0,2 g de proteína/banda. Cree Ud. que es correcto afirmar que una proteína está pura si da una sola banda en un gel teñido con ese colorante? De no ser correcto, cómo haría para determinar la presencia de otras proteínas? 11) El perfil de elución o cromatograma de una muestra de proteínas en Sephadex G-200 fue el siguiente: Concentración de proteína en el eluído Aldolasa Catalasa Gliceraldehido 3-P-deshidrogenasa Ovoalbúm. Mioglobina Las proteínas marcadoras fueron las siguientes: Nº de fracción Proteína M r (x10-4 ) N de fracción Aldolasa Catalasa Ovoalbúmina Mioglobina 1,6 285 Kav = Ve - Vo Vt - Vo Se recogieron fracciones de 1,6 ml y el volumen vacío de la columna previamente determinado con azul de dextrano fue de 200 ml. Vt = 500 ml. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se observó que la enzima aparece en la fracción 244. Indique el peso molecular de la misma. 12) Se purificó a homogeneidad una inmunoglobulina G (IgG), la cual posee cuatro cadenas polipeptídicas, dos de 215 residuos de aminoácidos y dos de 500 residuos de aminoácidos. Estas cuatro cadenas están unidas por puentes disulfuro. Esta IgG es sometida a una electroforesis desnaturalizante (SDS- PAGE) en presencia de 2-mercaptoetanol. Las proteínas marcadoras y sus movilidades en dicho gel se indican en la tabla. El colorante migró 5,3 cm desde el punto de siembra. Proteína marcadora Migración (cm) M r Inhibidor de tripsina 4, Anhidrasa carbónica 3, Gliceraldehido 3-P-deshidrog. 3, Albúmina de huevo 2, Albúmina sérica bovina 1, Fosforilasa B 1, a) Cuál será la movilidad para cada subunidad de la IgG? 4

5 b) Cuál es la masa aparente de la IgG? c) Cuántos nucleótidos codifican a esta proteína? 13) Usted tiene tres muestras de tres proteínas distintas a las que quiere caracterizar. Con este objetivo, se siembran separadamente en una columna de Sepharosa 6-B previamente calibrada con las siguientes proteínas: Proteínas Ve (ml) m (kda) Ribonucleasa de páncreas bovino ,7 Quimotripsinógeno A Ovoalbúmina Albúmina de suero bovino Aldolasa de músculo de conejo Catalasa de hígado bovino Ferritina de bazo de caballo Tiroglobulina bovina El volumen de exclusión determinado con azul de dextrano fue de 100 ml y los volúmenes de elución de las proteínas fueron A: 134 ml, B: 120 ml y C: 134 ml. El volumen total de la columna fue de 260 ml. Posteriormente con muestras de las proteínas se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Los resultados fueron: Proteína Migración (cm) m (kda) PEPC de maíz 0,4 110 Albúmina 2,8 67 Ovoalbúmina 4,8 43 Quimotripsinógeno 7,4 25 Ribonucleasa 10,2 13,7 A (5 bandas) 2,2 3,4 5,6 7,8 10,0 B (2 bandas) 3,6 9,8 C (1 banda) 0,8 En base a estos datos caracterice a A, B, y C lo mejor que pueda teniendo en cuenta que la corrida del frente es de 12 cm. 14) En una columna de Sepharosa 6-B previamente equilibrada se sembró una alícuota de una solución conteniendo una proteína pura. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las proteínas marcadoras fueron de masas moleculares 160, 90, 60, 40 y 16 kda y valores de Kav de 0,18; 0,36; 0,47; 0,60 y 0,87, respectivamente. El valor de Kav de la muestra se calculó en 0,32. Además, se corrió una electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) La proteína se hirvió sin DTT (agente reductor), II) La proteína se hirvió previamente con agente reductor. El patrón electroforético se muestra en la figura: 5

6 kda Proteínas marcadoras I II 16 SDS PAGE a) Indique el peso molecular de la proteína nativa. b) Infiera la composición cuaternaria de la misma. 15) Se quiere estudiar la estructura cuaternaria de una proteín-quinasa (PKasa) dependiente de camp, purificada de hepatocito de rata. Una alícuota de PKasa pura se sembró en una columna de exclusión molecular (Superosa 4 B). La columna tiene un volumen de exclusión, medido con azul de dextrano, de 50 ml y un volumen total de 130 ml. La columna fue calibrada con proteínas de peso molecular conocido mostradas en la siguiente tabla. El volumen de elución para la PKasa purificada usando esta columna fue de 73 ml. Testigo Ve (ml) M r Albúmina Aldolasa Catalasa CF Con otra aiícuota de la PKasa se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS), observándose dos bandas proteicas teñidas con igual intensidad que migraron 2,0 cm y 7,7 cm, respectivamente. La tabla muestra la migración electroforética de distintas proteínas de peso molecular conocido corridas en paralelo con el mismo gel. Testigo Migración (cm) M r PEP carboxilasa 0, Fosforilasa A 1, Albúmina 4, Quimotripsina 11, En base a estos datos calcule el peso molecular de la PKasa y la composición en subunidades de la estructura cuaternaria de la enzima. 6

7 16) Las enzimas M y X tienen las siguientes propiedades: M es un heteropentámero (aifa3- beta2) formado por 3 subunidades aifa y dos beta. El peso molecular de alfa y beta es y respectivamente. El punto isoeléctrico de M es de 7,8. X es un homodímero de peso molecular Su punto isoeléctrico es 5,2. La figura A muestra el perfil proteico de elución al pasar la mezcia por una columna de Sephadex G-100 a ph 8,5. La figura B corresponde al perfil de elución obtenido al cromatografiar la mezcla en una columna de DEAE-celulosa realizada a ph 7,5. La figura C muestra los resultados de las bandas proteicas obtenidas al resolver la muestra por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas realizada a ph 8.2. La figura D corresponde a una electroforesis de la mezcla realizada a ph 8,2 y en presencia de dodecil sulfato de sodio (condiciones desnaturalizantes). Identifique cada pico o banda de las figuras en base a las propiedades y condiciones antes descriptas. 17) A fin de caracterizar una enzima purificada, se somete su preparación a cromatografía de exclusión molecular en columna de Sephacryl S300 (SS300) y a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Los resultados obtenidos son los siguientes: a) Volumen de elución de la proteína de interés en SS300: 70 ml b) SDS-PAGE: dos bandas de igual intensidad (ver figura 1) La columna de SS300 tenía un Vo de 50 ml y un Vt de 130 ml y fue calibrada con proteínas de peso molecular conocido como muestra la Tabla 1. La calibración de los geles de SDS-PAGE se muestra en la Figura 1. 7

8 Tabla 1 Figura 1 Estándar Ve (ml) M r Ovoalbúmina Albúmina Fosforilasa Aldolasa 82, Catalasa Apoferritina Origen Frente Calcule el peso molecular y la composición en subunidades de la enzima en estudio. 8

9 RESPUESTAS Prob 1: a) Resina de intercambio catiónico. b) Al ph que se trabaja se podría suponer que el sitio activo de la enzima tiene carga neta positiva. Prob 2: La matriz entrecruzada de cada esfera de Sephadex, bajo ciertas condiciones de fabricación, excluye las proteínas grandes pero admite las proteínas pequeñas. Por consiguiente, las proteínas mayores pueden pasar entre las esferas. Las proteínas pequeñas pasarán a través del volumen total de la columna. Mientras más grande sea la proteína, menor es el tiempo que se retiene en las esferas y, como consecuencia, se eluye más rápidamente. En el soporte para la electroforesis en gel de poliacrilamida no hay espacios inter-esferas y todas las proteínas deben pasar por la matriz entrecruzada. Mientras más pequeña sea la proteína, más rápidamente migrará a través de la matriz. Prob 3: ph= 8,0, luego ph= 5,0, por último 3,0. C B A. Prob 4: Prot A: M r ; Homodímero; pi= 8,0. Prot B: M r ; Heterodímero, con una subunidad de M r = y otra con M r = ; pi= 5,0. Prot C: M r ; Monómero; pi= 10,0. Prob 5: a) lisozima- citocromo C- mioglobina- ovoalbúmina. b) pepsina- ureasa- hemoglobina- citocromo C. Prob 6: a) alfa: pi= 5,2 beta: pi= 6,3 gamma: pi= 7,3. b) alfa; a ph 6 carga neta (-). c) beta y gamma; aumentando la fuerza iónica o gradualmente el ph del buffer de elución. d) Porque es la más pequeña de las tres. Prob 7: a) A: pi= 3,0 m 21,5 kda Orden 1º. B: pi= 5,5 m 15,0 kda Orden 2º. C: pi= 9,5 m 11,4 kda Orden 3º. b) H4 es C. Prob 9: a) Sugiere la presencia de un grupo prostético en la estructura de las proteínas. b) Que A tiene una sola cadena polipeptídica y B dos. c) Que A es un monómero y B es un heterodímero. d) Que A tiene un enlace disulfuro intracadena y B tiene un enlace disulfuro intercadena. e) Porque la urea actúa sobre interacciones hidrofóbicas y puentes de H, no sobre enlaces covalentes. Porque el beta-mercaptoetanol no puede romper las interacciones no covalentes ingresar dentro de las subunidades de esta proteína para cortar el enlace disulfuro 9

10 Prob 10: a) Heterotrímero. Subunidades de 60, 30 y 25 kda. Las subunidades de 60 kda y 30 kda están unidas por puente disulfuro. La subunidad de 30 kda está glicosilada con un hidrato de carbono de 10 kda. b) Es incorrecto. En un gel se siembra normalmente de 1 a 2 g de proteína supuestamente pura. En el caso de sembrar la menor cantidad (1 g) y realizar la tinción de Coomassie no se detectaría hasta un 20 % de impurezas. Lo más conveniente es usar otros métodos más sensibles como la tinción con Ag o con reactivos que emitan luz fluorescente. Por otro lado, para detectar una impureza que posea el mismo peso molecular que la proteína supuestamente pura, se debería realizar electroforesis en 2D (SDS-PAGE seguida de isoelectroenfoque) Prob 11: M r Prob 12: a) Movilidad : 3,8 cm; 1,8 cm b) Masa aparente: Da c) Prob 13: A: M r : , subunidades de M r = ; ; ; ; (dos de cada una). B: M r : , subunidades de M r = y (ocho de cada una). C: M r , 4 subunidades de M r = Prob 14: a) M r b) Heterotrímero; 2 subunidades de M r = y una subunidad de M r = (Las subunidades de están unidas entre sí por puentes disulfuro). Prob 15: a) M r = Heterotetrámero con 2 subunidades de M r = y 2 subunidades de M r = Prob 16: a) FIG A: 1 pico: M; 2º pico: X. FIG B: 1 pico: M; 2º pico: X. FIG C: 1 banda: M r = (Prot M); 2º banda: M r = (Prot X). FIG D: 1 banda: M r = ; 2 banda: M r = ; 3 banda: M r = Prob 17: M r = Heterotetrámero con 2subunidades de M r y 2 subunidades de