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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61L 24/00 k 12 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 k k k k 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Procedimiento de preparación de una cola biológica enriquecida con factores plaquetarios y aplicación. kprioridad: FR k Titular/es: INOTEB Le Guernol F-69 Saint-Gonnery, FR k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Patat, Jean-Louis; Delmas, Olivier y Schmitthaeusler, Roland k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T DESCRIPCION Procedimiento de preparación de un cola biológica enriquecida con factores plaquetarios y aplicación. La invención tiene por objeto la obtención de una cola biológica que contiene proteínas plasmáticas humanas coagulables. La cola biológica obtenida según la invención contiene particularmente factores de crecimiento de origen plaquetario. Se sabe que concentrados de proteínas coagulables por la trombina, o soluciones de fibrinógeno, son utilizados en la realización de un material adhesivo que permite particularmente juntar los tejidos vivos ejerciendo a la vez una acción hemostática; ver por ejemplo la patente FR Este material adhesivo se denomina corrientemente cola biológica y se utiliza en cirugía. Las colas biológicas permiten reproducir, en condiciones fisiológicas, la fase final del proceso de la coagulación. Para ello, se mezcla extemporáneamente, sobre el tejido vivo a tratar, una soluciónque contiene fibrinógeno y factor XIII con una solución que contiene trombina e iones de calcio. El fibrinógeno, en presencia de trombina y de iones de calcio, se transforma en fibrina. Los monómeros de fibrina se juntan para formar polímeros de fibrina y estos polímeros se reticulan por la acción del factor XIII activado. El factor XIII, activado bajo la acción de la trombina en presencia de iones calcio, es una transamidasa que establece enlaces peptídicos entre las cadenas de fibrina con formación de una red. En la presente solicitud, se denominará cola biológica a un concentrado de proteínas coagulablespor la trombina, aunque de hecho esto sea solamente en presencia de trombina y de sales de calcio (o después de la activación de la protrombina que contiene) cuando dicho concentrado constituye verdaderamente una cola. La formación de la red de fibrina es responsable de la actividad hemostática de la cola biológica. Por otro lado, la fibrina se adhiere a los tejidos circundantes, particularmente por mediación de la fibronectina y del colágeno. Además, el factor XIII activado establece enlaces peptídicos entre la fibrina y la fibronectina, lo cual refuerza las propiedades adhesivas. Se sabe que el coágulo de fibrina desaparece progresivamente, in vivo, bajo la acción de una enzima proteolítica denominada plasmina, lo cual limita el tiempo de duración del colágeno. Sin embargo, es posible reforzar la duración de la acción de las colas biológicas añadiéndolas por ejemplo alfa 2-antiplasmina o un inhibidor de las proteasas tal como la aprotinina, o incluso ácido epsilon-aminocapróico. Las aplicaciones de las colas biológicas son numerosas, en particular en cirugía para evitar hemorragias, para sustituir los hilos de suturas o para reforzar éstas. Sin embargo, las colas biológicas no tienen actividad particular propia para favorecer la cicatrización. 4 0 Se sabe que la cicatrización es favorecida particularmente por ciertos factores de crecimiento que actúan directamente sobre células-blanco presentes a nivel de una herida. Estos factores de crecimiento inducen la multiplicación o la diferenciación, o incluso la atracción celular (quimiotactismo). Las plaquetas sanguíneas (o trombocitos) son una de las fuentes principales de factores de crecimiento en la sangre. En una lesión celular in vivo, los trombicitos liberan los factores de crecimiento contenidos en gránulos, bajo la acción de activadores de trombocitos, de los cuales la trombina. Los sobrenadantes de plaquetas activadas incluyen una gran diversidad de moléculas, como por ejemplo el factor de crecimiento derivado de las plaquetas, o PDGF (Platelet-derived growth factor), el Transforming growth factor bêta, el Basic fibroblast growth factor, el Platelet factor 4, el Platelet-derived endothelial growth factor, el Heparin-binding epidermal growth factor, el Insulin-like growth factor 1, el Connective-tissue activating peptide III, la bêta-thromboglobuline, el Epidermal growth factor, el plasminógeno, el factor Von Willebrand, el fibrinógeno, la serotonina, la histamina, la adenosina di- y trifosfato, la fibronectina, la vitronectina, el factor XIII plaquetario, enzimas proteolíticas o glicolíticas, los metabolitos del ácido araquidónico etc...; ver particularmente H.L. Wong & S.M. Wahl, In Peptide Growth Factors and their Receptors Sporn & Roberts Eds., Springer-Verlag. Berlin, p. ; R.A. Terkeltaub & M.H. Ginsberg, In The Molecular and Cellular Biology of Wound repair, Clark & Henson Eds, Plenum Press, New York, p. 38. Los extractos plaquetarios incluyen una actividad mitógena elevada, y su efecto cicatrizante es conocido; D.M. Carter y col., In Growth factors and other aspects in Wound Healing, Barbul. Pines, Cadwell Hunt Eds, Alan R.Liss Inc., New York 1988, páginas 3-317; patente US y solicitudes de patente PCT WO 86/03122, WO 88/039 y WO 89/066. 2

3 ES T Ahora se ha descubierto que es posible obtener una cola biológica mejorada, que favorezca particularmente la cicatrización, gracias a un procedimiento que permita unir a la vez las proteínas coagulables por la trombina y factores plaquetarios. Los modos de preparación de los concentrados de proteínas coagulables por la trombina son conocidos. La materia prima está constituida por plasma sanguíneo, es decir sangre de la cual se han eliminado las células sanguíneas. Dicho de otro modo, se trata de un producto pobre en plaquetas. El procedimiento consiste esencialmente en precipitar el fibrinógeno bien sea mediante etanol, según el método de Cohn, o por la obtención de un crioprecipitado. Se sabe que la preparación de un crioprecipitado consiste en congelar un plasma y luego en descongelarlo a una temperatura superior a 0 e inferior a 6 o C, generalmente comprendida entre +1 y +4 o C. La fracción sólida que queda, y que contiene particularmente fibrinógeno y fibronectina, se denomina crioprecipitado y puede separarse de la fracción líquida por centrifugación. El volumen de crioprecipitado generalmente se encuentra comprendido entre 1/2 y 1/0 del volumen del plasma de partida. Las proteínas plasmáticas insolubles en las condiciones de obtención del crioprecipitado se encuentran por consiguiente concentradas con un factor del 2 al 0 en el transcurso de la crioprecipitación. Pero las preparaciones así obtenidas son pobres en factores de crecimiento. En particular las colas biológicas preparadas según procedimientos industriales conocidos no incluyen actividad mitógena notable. Ahora se ha descubierto que utilizando como producto de partida un plasma enriquecido con plaquetas, numerosos factores plaquetarios, aunque normalmente solubles en las condiciones de obtención de crioprecipitado, se encuentran retenidos en el indicado crioprecipitado en proporciones muy importantes, mientras que normalmente se debería esperar en un reparto uniforme de estos factores entre la fracción líquida y el crioprecipitado obtenidos. El procedimiento de la invención permite obtener un producto que combina las propiedades hemostáticas y adhesivas de los concentrados de proteínas coagulables por la trombina y las actividades cicatrizantes de los extractos plaquetarios, sin que sea necesario proceder a dos preparaciones distintas. Es así como gracias al procedimiento de la invención, el factor de concentración del PDGF, en el crioprecipitado, es generalmente superior a. El rendimiento en PDGF es generalmente superior a ng por mil millones de plaquetas presentes en el plasma de partida. La invención tiene pues por objeto un procedimiento de preparación de una cola biológica que contiene un concentrado de proteínas coagulables por la trombina, caracterizado, por el hecho de que contiene al menos un factor de crecimiento de origen plaquetario. El indicado factor de crecimiento es particularmente el PDGF. La cola biológica obtenida según la invención contiene generalmente al menos ng/ml, y lo más a menudo al menos 0 ng/ml de PDGF. Generalmente, puede contener de a 0 ng/ml de PDGF. La cola biológica contiene otros productos presentes normalmente en los extractos plaquetarios, y en particular la beta-tromboglobulina, el inhibidor de tipo 1 del activador del plasminógeno (PAI-1) y el factor XIII plaquetario (Factor XIII-A). La misma contiene por ejemplo al menos µg/ml, y en particular de a 0 µg/ml, de beta-tromboglobulina, al menos 1 µg/ml de PAI-1 y en particular de a µg/ml, de PAI-1. La proporción de factor XIII-A con relación al Factor XIII-S es de al menos 1,2 veces más elevada que la proporción de estos factores en un plasma normal, y en particular de 1,2 a 4 veces más elevado. La cola biológica de la invención contiene por ejemplo: -proteínas : - 0 g/l, - fibrinógeno : - g/l, en particular 0-0 g/l, - fibronectina : 6-14 g/l, particularmente 8-12 g/l, - factor XIII : - unidades equivalente plasma, -albúmina : - 38 g/l, en particular 18- g/l. La unidad equivalente de plasma corresponde a la concentración plasmática normal de factor XIII presente en un conjunto de plasmas. La concentración en proteínas se determina por el método del Biuret. La concentración en fibrinógeno 3

4 ES T se determinó por el método ponderal, la concentración en fibronectina y en PAI-1 por un ensayo ELISA (Stago), según las instrucciones del fabricante, la actividad de factor XIII por un ensayo de liberación de amoniaco provocada por la incorporación de etilester de glicina sobre un sustrato peptídico (Reactivos de Berichrom F XIII, Behring), según las recomendaciones del fabricante, el factor XIIII-A y XIII-S por el método de Laurell utilizando antisueros específicos (Stago). La concentración en albúmina se determinó por electrofóresis mediante Acetato de Celulosa (Sebia), según las recomendaciones del fabricante. El contenido en proteínas de la banda de electrofóresis característica de la albúmina se determinó por densitometría. La cola biológica contiene los factores de la coagulación en cantidad suficiente para conferirle la propiedad de coagular activando bien sea la vía intrínseca de la coagulación, o la vía extrínseca de la coagulación. La cola biológica contiene por ejemplo entre 0, y 1, veces la concentración plasmática normal en protrombina, determinada bien sea por el método de Laurell utilizando para ello un antisuero específico (Stago), o por el método cronométrico (Stago deficiente II, Stago), según las recomendaciones del fabricante. Una dilución al 1 2 en un tampón fisiológico de la cola biológica presenta un tiempo de Quick equivalente al de un plasma normal diluido entre 1 2 y 1/6. El tiempo de Quick explora la capacidad de activar la vía extrínseca de la coagulación. Se determina con la ayuda de un reactivo de marca Neoplastine (Stago), que contiene tromboplastina, según las recomendaciones del fabricante. Una dilución del 1 2 en un tampón fisiológico de la cola biológica presenta un tiempo de Caolín equivalente al de un plasma normal diluido entre 1:1 y 1:4. El tiempo de Caolín explora la capacidad de activación de la vía intrínseca de la coagulación. Se determinó con la ayuda de los reactivos C.K. PREST (Stago), según las recomendaciones del fabricante, salvo que la cefalina se omita en la realización del ensayo. El procedimiento de preparación de la cola biológica según la invención contiene factores plaquetarios en cantidad suficiente para conferirle propiedades mitógenas, que pueden ser evidenciadas según los métodos clásicos. La actividad mitógena de la cola biológica según la invención es por ejemplo tal que diluida en 1/00e (e incluso, generalmente, en 1/000e), la misma tenga una actividad mitógena al menos igual a la de una solución que contiene 0,1 ng/ml de PDGF en un ensayo de medición de la incorporación de timidina tritiada por células 3T3 estimuladas en una fase de detención de crecimiento. Un ensayo de este tipo, se describe por ejemplo por HART C.E. y col., Biochemistry vol.29, (1990). 4 0 La célula 3T3 es una célula de embrión de ratón Swiss (tipo ATCC CCL 92). Un tipo procedente de un subclonado se encuentra igualmente disponible (NIH/3T3; ATCC CRL 168). La cola biológica puede estar constituida esencialmente por un crioprecipitado procedente de un plasma enriquecido con plaquetas, y la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una cola biológica en el cual se prepara y recoge un crioprecipitado a partir de un plasma congelado, caracterizado por el hecho de que se utiliza como plasma de partida un plasma enriquecido con plaquetas. Dicho de otro modo, el procedimiento de la invención se caracteriza por el hecho de que antes de preparar el crioprecipitado, se prepara un plasma enriquecido con plaquetas. La operación de enriquecimiento del plasma con plaquetas se realiza según los métodos usuales, particularmente por centrifugación de la sangre extraída. El plasma enriquecido con plaquetas contiene generalmente al menos 0 millones de plaquetas por ml, particularmente 0 millones por 1 billón de plaquetas aproximadamente por ml, y por ejemplo de 0 millones a 00 millones aproximadamente por ml. Las condiciones de obtención del crioprecipitado son las condiciones clásicas. Por ejemplo se congela a una temperatura no superior a -1 o C, por ejemplo comprendida entre -1 y - o C. Se mantiene el producto a esta temperatura durante al menos un tiempo suficiente para permitir un equilibrio térmico en la masa del producto. Este tiempo es por ejemplo del orden de 12 horas a 72 horas. El plasma se descongela seguidamente a una temperatura superior a 0 o C pero inferior a la tempe- 4

5 ES T3 ratura a la cual el conjunto del producto congelado se licúa. Se opera generalmente entre +1 y +6 o C, yenparticulara+4 o C. El tiempo de incubación a la temperatura de descongelación es suficiente para permitir realizar un equilibrio térmico; esta duración se encuentra comprendida por ejemplo entre 12 y 24 horas. Se puede seguidamente separar el crioprecipitado de la fracción líquida. Para ello, se centrifuga el plasma descongelado a una temperatura suficientemente elevada para no tenerlo que congelar de nuevo, y suficientemente baja para evitar la licuación del crioprecipitado, luego se elimina el sobrenadante según los métodos conocidos, y se recoge el crioprecipitado que constituye el residuo de centrifugación. El volumen del crioprecipitado representa generalmente del 1/2 ā a 1/0 ā del volumen del plasma inicial. Generalmente la centrifugación se realiza a una temperatura comprendida entre +1 y +6 o C. 1 En el caso en que no se desee utilizar inmediatamente la cola biológica constituida por el crioprecipitado obtenido, se puede congelarla de nuevo, por ejemplo a - o C. Cuando la cola biológica está destinada para ser utilizada inmediatamente, conviene licuarla mediante calentamiento a una temperatura suficiente, habitualmente comprendida entre 32 y 38 o C. 2 La sencillez del procedimiento de obtención de la cola biológica enriquecida con factores plaquetarios según la invención permite aplicar este procedimiento en la realización de una cola biológica autóloga, es decir obtenida a partir del plasma procedente de un único donador, con miras a la utilización en este donador. Una de las ventajas de este procedimiento es que todas las operaciones, comprendida el enriquecimiento del plasma con plaquetas, pueden ser realizadas en el sistema de bolsas utilizado para la extracción de sangre de un donador. Se puede bien entendido preparar la cola biológica a partir del plasma procedente de varios donadores identificados El producto de partida del procedimiento de la invención es un plasma enriquecido con plaquetas. La preparación de dicho plasma enriquecido con plaquetas es conocida en sí. La misma puede ser realizada por ejemplo según el método siguiente. Sangre total, recogida durante una donación de sangre, en un sistema de bolsa triple, (Maco-pharma por ejemplo), se centrifuga en una centrifugadora Jouan K1 de 00xg durante 4 minutos. El plasma sobrenadante, rico en plaquetas, es transvasado a la bolsa de transferencia 3 del sistema de triple bolsa, con la ayuda de un extractor de plasma. La bolsa 3 se separa del resto del sistema por soldadura del conducto. Es esta bolsa la que se utilizará para la fabricación según la invención del concentrado de proteínas coagulables por la trombina. La invención tiene igualmente por objeto la utilización distinta en un método de tratamiento terapéutico o quirúrgico del cuerpo humano o animal de la cola biológica que puede ser obtenida según el procedimiento mencionado anteriormente. Esta utilización puede ser realizada según los métodos conocidos en sí. El principio de esta utilización consiste en provocar la formación de fibrina por transformación del fibrinógeno. Esta transformación se realiza por la acción de la trombina. La trombina puede ser la trombina exógena añadida, según los métodos conocidos en sí: para ello, se mezcla la cola biológica obtenida tal como la descrita anteriormente con una solución acuosa que contiene trombina e iones de calcio con el fin de desencadenar la reacción de coagulación por transformación del fibrinógeno en fibrina. Se puede utilizar particularmente una solución acuosa que contiene de 0, a 00 U NIH/ml de trombina y una concentración en iones de calcio (particularmente en forma de cloruro de calcio) comprendida por ejemplo entre y 0 mm, en particular entre y mm. La mezcla con la solución de trombina se realiza de preferencia in situ, sobre los tejidos a tratar. Generalmente, se mezcla el crioprecipitado licuado y la solución acuosa de trombina en unas proporciones volúmicas de :1 a 1:2. Si se desea, se añade a la cola final, o a uno de sus constituyentes antes de su mezclado, un inhibidor de plasmina o análogo (alfa 2-antiplasmina, aprotinina, ácido epsilon-aminocapróico, ácido tranexámico por ejemplo).

6 ES T3 Se puede también sacar ventajosamente partido de la presencia de protombina y de otros factores de coagulación en la cola biológica de la invención, y activar bien sea la vía extrínseca, o la vía intrínseca de la coagulación La invención tiene pues particularmente por objeto la utilización de la cola biológica obtenida como se ha indicado anteriormente, caracterizándose esta utilización por el hecho de que se añade a la indicada cola biológica al menos un agente que favorece la activación de la protrombina endógena. Se desencadena también el fenómeno de coagulación, operando preferentemente a temperatura próxima a los 37 o C. Para ello, basta con añadir a la cola biológica una solución acuosa que contiene iones calcio (por ejemplo -0 mm, en particular - mm). Si se desea acelerar esta coagulación, se puede operar como se ha indicado a continuación, con la ayuda de activadores. Para activar la vía intrínseca, se puede mezclar la cola biológica con una solución acuosa que contiene iones calcio (por ejemplo - 0 mm, en particular - mm), y ponerla en contacto con al menos un activador conocido del Factor XII de la coagulación, y de forma más general con superficies o compuestos sólidos, por ejemplo en forma de polvo, insolubles en la cola biológica y que presentan cargas negativas, como silicatos, (Particularmente el Caolín), la sílice, el vidrio de sílice, cristales de carbonato de calcio, como por ejemplo la aragonita, procedente por ejemplo de estructuras de coral, cristales de tri-calcio dicitrato. Al cabo de un tiempo suficiente, que puede estar determinado por simples ensayos de rutina, se separa la cola biológica de los indicados compuestos insolubles por filtración. Se puede operar por ejemplo en una columna provista de un filtro. Para activar la vía extrinseca de la coagulación, se puede mezclar la cola biológica con una solución acuosa que contiene iones calcio - 0 mm (en particular - mm) y tromboplastina de los tejidos, por ejemplo de origen animal, o tromboplastina producida por ingeniería genética. Una de las ventajas importantes de la cola biológica obtenida se acuerdo con la invención es por consiguiente la que contiene protombina en cantidad suficiente para permitir desencadenar la coagulación de la cola sin adición de trombina exógena, lo cual reduce los riesgos de contaminación accidental. El procedimiento de la invención está por consiguiente particularmente adaptado a las necesidades actuales de utilización de productos autólogos. La cola biológica puede ser utilizada particularmente en el tratamiento de las heridas traumáticas o quirúrgicas, en el implante y el mantenimiento de injertos (particularmente injertos de piel, de huesos, etc...). La misma puede igualmente ser utilizada para fijar piezas de prótesis, comprendidas prótesis óseas, piezas de osteosíntesis y prótesis dentales, y también para fijar y mantener juntos materiales de relleno óseo, particularmente materiales de relleno reabsorbibles a base de carbonato de calcio (por ejemplo a base de estructura de coral o de concha de Pinctada margaritifera), de hidroxiapatita o de polímeros biodegradables como el poli(ácido láctico). Ejemplo 1 Se preparó un plasma humano enriquecido con plaquetas, como se ha descrito anteriormente. El plasma enriquecido así obtenido contiene 14 millones de plaquetas por ml. 0 La bolsa de transferencia incluyendo 2 ml de dicho plasma enriquecido con plaquetas se coloca en una cámara fríaa- o C durante 72 horas. La bolsa de plasma se coloca seguidamente en un refrigerador a una temperatura de 4 o C durante horas. La bolsa de plasma se centrifuga seguidamente durante minutos a 00 rpm, siempre a temperatura de +4 o C. Después de la centrifugación, la bolsa de situó horizontalmente, y se colocó un conducto de extracción y el sobrenadante líquido se trasegó por aspiración. El residuo sólido contenido en la bolsa constituye el crioprecipitado que puede conservarse por una nueva congelación a una temperatura de - o C hasta su utilización. Cuando se desea utilizar inmediatamente el crioprecipitado, se coloca la bolsa al baño de maría, por ejemplo a una temperatura de 37 o C. Después de 1 minutos de incubación la solución residual se extractó. Su volumen es de 3 ml aproximadamente. 6

7 ES T3 Análisis del producto obtenido : ver tabla 1 dada a continuación. Ejemplo 2 1 Se operó de forma similar a la descrita en el ejemplo 1. El volumen de plasma tratado fue de ml. El plasma incluía al comienzo, 26 millones de plaquetas por ml. El volumen de la solución final recuperada, procedente de la licuefacción del crioprecipitado, es de ml. Análisis: ver tabla 1. El contenido en PDGF del sobrenadante obtenido después de la centrifugación del plasma descongelado solo es de,9 ng/ml. Se aprecia (en comparación con la Tabla I) que la casi-totalidad del PDGF se encuentra en el crioprecipitado. TABLA I 2 Ejemplo 1 Ejemplo 2 Proteínas (1), (mg/ml) 61 89,6 PDGF(2), (ng/ml) Beta-tromboglobulina(3) (µg/ml) Coagulable por la trombina (4) SI SI Actividad mitógena () (actividad específica) 4 sin medir (1) Determinado por el método de Bradford (Reactivo Biorad referencia ) (2) PDGF : factor de crecimiento derivado de plaquetas (Platelet Derived Growth Factor), medido por un ensayo ELISA (3) Medido por un ensayo ELISA (Stago, Francia, referencia 0419) (4) Determinado mezclando un volumen de crioprecipitado licuado con un volumen de una solución de trombina de 00 U.N.I.H. y cloruro de calcio 0 mm. Después de 1 minutos, se observa la formación de un coágulo. () La actividad específica se determinó según el protocolo descrito a continuación. La radioactividad obtenida con el testigo es de cpm. A cpm, la concentración en proteínas es de 0,0096 mg/ml en el ejemplo 1. A título indicativo, la actividad específica del Tissucol (marca comercial que designa una cola biológica vendida por IMMUNO) medida por el mismo método, es de 0,22. El protocolo medido por la actividad mitógena fue el siguiente: Se separaron células de fibroblastos a partir del prepucio de un niño de 6 meses. Las células se pusieron en suspensión en medio DMEM (Gibco) incluyendo un % de suero de ternera fetal. Se sembró cada pocillo con una placa de microtitulación de 96 pocillos con 0 µl de la suspensión de.000 células/ml. Después de 3 días de incubación a 37 o C, en atmósfera al % de CO 2,elmediode cultivo es sustituido por un medio DMEM (Gibco) al 8 % de suero de ternera recién nacida. Después de 3 días de incubación suplementarios, se añadieron 0 µl de una solución de proteínas coagulables por la trombina (muestra). Cada muestra se sometió a ensayo en diferentes diluciones en DMEM, y por triplicado. Se inocularon 0 µl de DMEM en pocillos testigo. La microplaca se incubó en las mismas condiciones durante 24 horas. Seis horas antes del final de la incubación, se añadieron 0 µl de una solución de timidina tritiada en µci/ml a cada pocillo. Después de la incubación, los pocillos se lavaron mediante una solución fisiológica. Las células se despegaron entonces del pocillo mediante una solución de tripsina al 0,2 %, en presencia de etilen-diamina-tetra-acetato (solución Gibco). Las células se recogen entonces en un filtro, gracias a un colector de células de tipo Skatron. Los filtros se secaron entonces y la radioactividad se midió en presencia de un líquido centelleante. 7

8 ES T3 Determinación de la actividad específica: 1 2 Se indica en un grafo, en abscisa, la concentración en proteínas de la muestra en el pocillo (expresada en mg/ml) y en ordenada la radioactividad correspondiente. Se determina gráficamente, por interpolación, la concentración en proteínas de la muestra proporcionando un porcentaje de radioactividad doble respecto a la de los pocillos testigo. La inversa de esta concentración se denomina la actividad específica de la muestra. Ejemplo3: Se operó de forma análoga a la del ejemplo 1. Los resultados de los análisis (medias de varios ensayos) seindicanenlatablaii. TABLA II Nb de exp Media Val. mini Val.máx. Concentración en plaquetas en el plasma de partida 6 /ml Proteínas g/l Fibrinógeno g/l Fibronectina g/l 9 7, Factor XIII UEP* F XIII-A/F XIII-S 4 2,9 2,14 3,7 PDGF ng/ml β-tromboglobulina µg/ml Albúmina g/l 6 2,1 19,8 3,9 PAI-1 µg/ml * UEP : Unidad equivalente de plasma 3 4 Ejemplo 4 Se preparó una cola biológica de forma similar a la descrita en el ejemplo 1. En un tubo, se mezclaron sucesivamente µl de cola biológica, µl de suero fisiológico, 0 µl de una solución acuosa de cloruro de calcio a 2 mm y, bien sea 0 µl de una suspensión de Caolín, bien 0 µl de una suspensión de polvo de coral, o bien 0 µl de suero fisiológico. El tubo se incubó a37 o Calbaño de maría. Se siguió la aparición de un coágulo en el tubo. En presencia de Caolín, el coágulo se formó después de 4 min. de incubación. En presencia de polvo de coral en medio de Caolín, el coágulo se forma en 7 min. La preparación sin Caolín ni coral (obtenida por simple adición de suero fisiológico) se coagula al cabo de 9 min. 0 8

9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de preparación de una cola biológica en el cual se prepara y recoge un crioprecipitado, que constituye la indicada cola, a partir de un plasma congelado, caracterizado por el hecho de que se utiliza como plasma de partida un plasma enriquecido con plaquetas. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el indicado plasma enriquecido contiene al menos 0 millones de plaquetas por ml Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que el indicado plasma de partida contiene 0 millones a un billón, y en particular de 0 millones a 00 millones de plaquetas por ml. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que se calienta el indicado crioprecipitado para obtener la indicada cola en forma líquida.. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que partiendo de sangre extraída, se prepara primeramente un plasma enriquecido en plaquetas Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que el indicado plasma proviene de un solo donador, y porque se realiza el conjunto de las operaciones de dicho procedimiento en un sistema de bolsas que sirven para extraer la sangre. 7. Utilización distinta en un método de tratamiento terapéutico o quirúrgico del cuerpo humano o animal de la cola biológica obtenida según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que se añade al a indicada cola un agente que favorece la activación de la protrombina endógena. 8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada por el hecho de que el indicado agente es una solución acuosa que contiene iones calcio. 9. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada por el hecho de que el indicado agente es la tromboplastina, en presencia de iones de calcio. 3. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada por el hecho de que el indicado agente es un activador del Factor XII de la coagulación, en presencia de iones de calcio. 11. Utilización según la reivindicación anterior, caracterizada por el hecho de que el indicado activador es elegido entre compuestos sólidos insolubles en la cola biológica y que presenta cargas negativas. 12. Utilización según la reivindicación anterior, caracterizada por el hecho de que el indicado compuesto sólido es elegido entre los silicatos, el vidrio de sílice, carbonato de calcio o tri-calcio dicitrato. 4 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 9