ESTUDIO DE LA FISIOLOGÍA DIGESTIVA EN EL PULPO Octopus maya: Caracterización de enzimas y digestibilidad in vitro.

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Silvia San Martín Martín
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1 ESTUDIO DE LA FISIOLOGÍA DIGESTIVA EN EL PULPO Octopus maya: Caracterización de enzimas y digestibilidad in vitro. Sandra García Garrido IFAPA Agua del Pino 11 Diciembre de 2008

2 UMDI-Sisal UNAM, Facultad de Ciencias. Sisal, Yucatán (México) Ubicación: Duración: 8 /09 28 / Tutor estancia: Dr. Carlos Rosas Vázquez

3 Octopus maya (Pulpo Rojo)

4 Octopus maya: Cultivo

5 ANTECEDENTES

6 Average mean initial weight Average weight gained Weight (g) Squid Squid + Gellatin Shrimp + Gelattin Diets Weight (g) Squid Squid + gellatin Shrimp + Gellatin Days

7 Tasa de crecimiento (% peso día -1 ) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 Tasa de crecimiento de pulpos alimentados con dieta aglutinada con alginato o gelatina Weight (g) Crecimiento en peso (g) de pulpos alimentados con dietas artificiales con distintas porcentages de CPSP y aglutinados con gelatina CPSP 20 - Gelatin CPSP 40 - Gelatin Squid Gelatina Alginato Calamar Dieta Days 1500 Crecimiento en peso (g) de pulpos alimentados con dietas aglutinadas con alginato o gelatina Crecimiento de pulpos alimentados con dietas con distintas concentraciones de CPSP y aglutinadas con gelatina 1200 Alginato Gelatina 1600 CPSP 10 - Alginate Peso (g) Calamar Weight (g) CPSP 20 - Alginate Squid Días Days

8 JUSTIFICACIÓN Cultivo Octopus vulgaris Cultivo Octopus maya etapa larvaria: desarrollo indirecto dietas: tasas crecimiento bajas Búsqueda de propiedades nutricionales que favorezcan la digestibilidad en el pulpo. 1. Caracterización del alimento de referencia. 2. Estudio de la fisiología digestiva del pulpo. 3. Rediseño de las propiedades idóneas que debe tener el alimento suministrado. 4. Digestibilidad in vitro.

9 1. Caracterización del alimento de referencia. - Proteínas solubles - Aminoácidos libres 2. Estudio de la fisiología digestiva del pulpo Identificación de enzimas presentes en la glándula digestiva (GD) y jugo gástrico (JG) - Electroforesis - Inhibidores específicos O. maya JG: proteasas ácidas, no quimotripsina y tripsina 2.2. Caracterización de las enzimas de GD y JG - Actividad enzimática en el intervalo de ph 2 a 12 y en el de temperatura (5 a ºC) O. maya JG: ph Tª 28 ºC 3. Rediseño de las propiedades idóneas que debe tener el alimento suministrado. 4. Digestibilidad in vitro. (PH-STAT)

10 OBJETIVOS DE LA ESTANCIA Evaluación de la actividad de enzimas digestivas de tejido y jugo gástrico de cefalópodos. Aprendizaje de técnicas bioquímicas para la evaluación de la digestibilidad in vitro.

11 ENZIMAS DIGESTIVAS PROTEASAS TOTALES (Anson, 1938) PROTEASAS ALCALINAS GENERALES (Anson, 1938) TRIPSINA (Charney y Tomarelli, 1947) QUIMOTRIPSINA (Delmar et al., 1979) PROTEASAS ÁCIDAS GENERALES (Walter, 1984) PROTEÍNAS TOTALES (Bradford, 1976)

Enzimas digestivas: PROTEASAS Preparación de extractos Pesar glándulas digestivas o jugo gástrico. Conversión a 60 mg de tejido (fresco) por ml de agua destilada.

12 Enzimas digestivas: PROTEASAS Preparación de extractos Pesar glándulas digestivas o jugo gástrico. Conversión a 60 mg de tejido (fresco) por ml de agua destilada. Si están liofilizadas, hidratar primero. Homogenizar Centrifugar a rpm por 30 min a 4 ºC Recuperar sobrenadante En caso de jugo gástrico se utiliza puro, sólo se centrifuga para minimizar el efecto de la presencia de alimento Solución tampón (Stauffer, 1989) 3.5 g ácido bórico 7 g de citrato de sodio 4.6 g de fosfato sodico monobásico 310 ml de 1N de hidróxido de Na Aforar a 1000 ml con agua destilada TOTALES

Enzimas digestivas: PROTEASAS TOTALES Preparar solución tampón (Stauffer, 1989) Mezclar 20 ml de tampón con X ml de HCl

destilada. Los ajustes de ph se logran con HCl y NaOH a 2, 1 y 0.1 M 0.

13 Enzimas digestivas: PROTEASAS TOTALES Preparar solución tampón (Stauffer, 1989) Mezclar 20 ml de tampón con X ml de HCl 1 N, de acuerdo a la siguiente tabla: ph X ml Se ajusta el ph y se afora a 95 ml con agua destilada Se reajusta el ph y se termina de aforar a 100 ml de agua destilada. Los ajustes de ph se logran con HCl y NaOH a 2, 1 y 0.1 M 0.5 ml de hemoglobina a 1% (100 mg de hemoglobina en 10 ml, diluir con tampón Stauffer al ph correspondiente). 0.5 ml de Stauffer al ph correspondiente. 20 µl de extracto enzimático (dilución 1:10). Poner 20 µl agua destilada a los blancos. Incubar durante 10 minutos a 37 O C de temperatura.

Enzimas digestivas: PROTEASAS TOTALES Detener la reacción adicionando 0.

Dejar reposar la mezcla de reacción (15 min) a 4 o C para que precipiten las

Medir la absorbancia del sobrenadante en el espectrofotómetro a λ=280 nm

14 Enzimas digestivas: PROTEASAS TOTALES Detener la reacción adicionando 0.5 ml de TCA (ácido tricloroacético) al 20%. Dejar reposar la mezcla de reacción (15 min) a 4 o C para que precipiten las proteínas. Centrifugar a rpm durante 15 min. Medir la absorbancia del sobrenadante en el espectrofotómetro a λ=280 nm (cubeta de cuarzo). La evaluación de la actividad enzimática requiere paralelamente una evaluación de las proteínas totales: Método de Bradford.

15 DIGESTIBILIDAD IN VITRO: PH-STAT El sistema ph-stat permite una determinación rápida de la digestibilidad de la proteína de diferentes materias primas. Este sistema fue desarrollado por Pedersen y Eggum (1983) y se basa en la medición del consumo de álcali (NaOH) o ácido clorhídrico (HCl) necesario para mantener constante el ph que tiende a descender o aumentar al romperse los enlaces peptídicos durante la hidrólisis o digestión. El parámetro determinado es el grado de hidrólisis (GH en %) que relaciona los enlaces peptídicos hidrolizados por las proteasas digestivas con el número total de enlaces peptídicos presentes en una proteína (Adler-Nissen, 1976). Al número de estos enlaces hidrolizados en un proceso de hidrólisis se le denomina equivalentes de hidrólisis (h) y se expresa como mequv/g proteína.

16 DIGESTIBILIDAD IN VITRO: PH-STAT Cálculo del grado de hidrólisis de una reacción enzimática: GH (%) = (h/htot) x 100 o Siendo: h: número de enlaces peptídicos hidrolizados. htot: número de enlaces peptídicos totales del sustrato proteico h = Vb x Nb x (1/α) x (1/MP) o Siendo: h: número de enlaces peptídicos hidrolizados Vb: el consumo de base o ácido en ml Nb: la normalidad de la base o ácido α : la constante de disociación de los grupos α -NH2 MP: la masa de proteína en la mezcla de reacción

17 DIGESTIBILIDAD IN VITRO: PH-STAT Dosificador Bañera Sensor de temperatura Sensor de ph Cabezal Agitador Vaso de precipitado

18 Tasa de crecimiento de O. maya alimentados con ensilados expuestos a diferentes tiempos de transformación (1, 3 y 7 días). Datos preliminares, ,5 3,09 3 TCE, % por dia 2,5 2 1,5 1 1,03 1,35 1,20 1,45 0,5 0 Hom + Jaiba Ens1 + Jaiba Ens3 + Jaiba Ens7 + Jaiba Jaiba TRATAMIENTO Ensilados Se trata de la transformación química de los desechos generados del procesamiento de pescado (cabezas, piel, huesos) y vísceras a través de un método de ensilaje químico con ácido fórmico y por tanto de recuperación de proteínas y lípidos de alta calidad para ser empleados en dietas para juveniles y adultos del pulpo O. vulgaris.

19 CONGRESOS Del 23 al 24 de octubre de 2008 Sede: Instituto Tecnológico de Mérida Mérida, Yucatán, México Del 18 al 21 de noviembre de 2008 Sede: Hotel Hilton Cancún, Quintana Roo, México

20 Gracias por vuestra atención

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