Fluorescencia. Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone

Transcripción

1 Fluorescencia Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone

2 Para qué sirve? Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc. Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial de membrana, endocitosis y exocitosis. Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se resolverían. Estudiar la interacción entre moléculas in vivo

3 Qué es? Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido Fuentes: Excitación por absorción de fotones: fotoluminiscencia Excitación por una reacción química: quimio-luminiscencia Excitación por un ser vivo: bioluminiscencia

4 Diagrama de Jablonski 1) La absorción de la luz de excitación eleva la molécula del fluorocromo a un estado de excitación con un mayor contenido de energía, S1 2) En este estado de excitación se mantienen un tiempo determinado, en el cual la molécula sufre cambios conformacionales e interacciona con las moléculas de su entorno. Como consecuencia, parte de la energía del estado S1 se disipa, creándose un estado S1 de menor energía S1 S S1 3) Pasado este tiempo de excitación la molécula emite luz de menor energía volviendo a su estado fundamental, S0

5 Fotoluminiscencia Fluorescencia Fosforescencia Ambos procesos emiten luz La diferencia entre ambos fenómenos es la capacidad de almacenar la energía. La fluorescencia absorbe la energía excitación e inmediatamente emite la radiación luminosa (singuete excitado) La fosforescencia, comienza igual, absorbiendo energía de excitación, pero la almacena, retardando la emisión, siendo capaz de emitir esa radiación luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de radiación excitadora inicial (triplete excitado).

6 Por qué algunos materiales fluorescen? Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con configuraciones moleculares particulares conocidas como fluoróforos o fluorocromos. Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda). Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.

7 Tipos de fluoróforos 1-Moléculas orgánicas: Los fluoróforos Alexa Fluor (derivados de la rodamina) han sido utilizados como marcadores de biomoléculas. La fotoestabilidad es una de las principales características de este tipo de colorantes, además barren todo el espectro. 2-Puntos cuánticos: son nanocristales (2-50 nm) semiconductores que al ser iluminados, re-emiten luz en una longitud de onda muy específica y que depende del tamaño de este. Cuanto más pequeños sean los puntos, menor es la longitud de onda y más acotadas las propiedades cuánticas de la luz que emiten. Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a medida que el tamaño del punto se incrementa.

8 3-Proteicos: GFP posee un barril beta formado por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde. Mutaciones en residuos clave permitieron obtener variantes de la GFP (espectro de colores y estabilidad).

9 Características Espectros de excitación y emisión Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

10 Cómo se obtienen estos espectros? Fluorímetro La presencia de 2 monocromadores permiten el registro de dos tipos de espectros: el espectro de absorción y el espectro de emisión

11 Espectro de excitación: Muestra la diferente intensidad de fluorescencia observada en función de la longitud de onda de excitación, a una longitud de onda de emisión fija Espectro de excitación Variación de la IF al variar la λex a una λem constante Eficacia de las diferentes λex para producir fluorescencia

12 Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en función de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de excitación fija (máxima). Espectro de emisión Variación de la IF al variar la λem a una λex constante Intensidad de la radiación emitida a las diferentes λ

13 Espectro de excitación Espectro de emisión

14 Características de los espectros 1- La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (λ) de excitación. La excitación a la λ max (A), produce la fluorescencia más intensa (A). 2- El perfil o aspecto del espectro de emisión no depende de la l de excitación. 3- El espectro de emisión es la imagen especular del espectro de absorción. 4- Los espectros se encuentran desplazados

15 Puntos 1 y 2: Regla de Kasha La emisión siempre proviene del S1 con una intensidad proporcional al número de fotones absorbidos. Esto ocurre por la rápida conversión interna que precede a la emisión

16 Punto 3: La regla del espejo El espectro de absorción muestra los niveles vibracionales del estado excitado y el espectro de emisión los niveles vibracionales del estado basal, los cuales en la mayoría de los fluorocromos son similares (ocurren las mismas transiciones electrónicas)

17 Punto 4: Corrimiento de Stokes Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado basal existe una pérdida de energía vibracional. Como consecuencia, el espectro de emisión es desplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al espectro de excitación. A este desplazamiento se lo denomina corrimiento de Stokes. La distancia entre los picos de excitación y emisión de un fluoróforo depende de su estructura electrónica. Es fundamental para la sensibilidad dado que permite que los fotones de emisión sean detectados contra un fondo bajo, aislado de los fotones de excitación

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19 Tipos de fluorescencia. La fluorescencia primaria (fluoróforos intrínsecos) es la que se da porque existe una configuración inherente a la estructura molecular. Ejemplo: clorofila, GFP La fluorescencia secundaria (fluoróforos extrínsecos) ocurre cuando una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra. Ejemplo: sondas catiónicas planares como BrEt o DAPI que se agregan a los ácidos nucléicos Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia. Aequorea victoria DAPI intercalado en una molécula de ADN

20 Los fluoróforos extrínsecos pueden ser, a través de vectores de expresión, introducidos en bacterias, células u organismos para dirigir la expresión tanto de las proteínas fluorescentes solas como fusionadas a otra proteína de interés en el contexto del proceso biológico en estudio.

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22 Factores que afectan la fluorescencia 1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos. Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra. Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados. Comercialmente se han desarrollado productos con menor labilidad ante la estimulación lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa). También se desarrollaron sustancias antifade que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se pueden utilizar en células vivas 2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones de temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. También puede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento de fluorescencia. Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.

23 Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos Cuando se solapan los espectros de emisión. Ejemplo GFP/Alexa 488 NO SE PUEDEN USAR JUNTOS

24 SE PUEDEN USAR JUNTOS

25 Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos Cuando la emisión de un fluoróforo es capaz de excitar un segundo fluoróforo y es esta fluorescencia la que es detectada.

26 Usos de estos problemas como herramientas en la investigación

27 FRET Nature

28 FRAP y FLIP Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específica por altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de fluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo regulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad de macromoléculas. Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decolorada por el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célula completa. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmente decolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexión la fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas, movimiento de proteínas