UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis Tesis que Presenta Jesús Oswaldo Medina López Como Requisito para Obtener el Título Profesional de: Biólogo San Nicolás de los Garza N. L. Marzo, 2014

2 Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis TESIS QUE PRESENTA JESUS OSWALDO MEDINA LOPEZ COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE: BIOLOGO APROBADA COMISION DE TESIS Presidente Dr. Benito Pereyra Alférez Secretario Dr. Carlos Francisco Sandoval Coronado Vocal Dra. María Magdalena Iracheta Cárdenas Suplente Dr. Hugo Alberto Luna Olvera Asesor Externo Dr. Víctor Ricardo Moreno Medina ii

3 Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio L4 del Instituto de Biotecnología, de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León bajo la Dirección del Dr. Benito Pereyra Alférez iii

4 INDICE Sección Pág. Dedicatoria v Agradecimientos vi Lista de Abreviaturas vii Lista de Figuras ix Lista de Tablas x 1.Introducción 1 2.Importancia 3 3.Hipotesis 4 4.Objetivos 4.1.Objetivo general 4.2. Objetivos específicos Antecedentes Características de Helicoverpa zea (Boddie) Características de Gossypium hirsutum Algodón GM en México Características de B. thuringiensis Cristales paraesporales Modo de acción de las toxinas Cry Receptores asociados a la resistencia a las toxinas Cry APN APN como una proteína de unión a toxinas Cry Cadherinas ALP Resistencia a toxinas de B. thuringiensis Pruebas de Selección en laboratorio de otros insectos Pruebas de Selección en laboratorio de Helicoverpa zea Características genéticas ligadas a la resistencia MATERIALES Y METODOS 6.1.Muestreo de algodón GM 6.2.Purificación de toxinas a partir de cepas recombinantes de B. thuringiensis Obtención de proteínas Cry Solubilización 6.3.Procedencia de las colonias de insectos A partir de larvas En el caso de las pupas Cría de insectos 6.4.Concentración letal media (LC50) de la protoxina Cry1Ac Determinación de resistencia Ensayos de segregación iv

5 6.7.Identificación de genes de los receptores asociados al mecanismo de resistencia Extracción de ADN Extracción de RNA con Tripure reagent Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 7.Resultados 7.1.Expresión de Toxina Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS) 7.2.Obtención de proteínas Cry 7.3.Determinación de la LC Bioensayos de resistencia 7.5.Cruza de colonias 7.6.Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias 7.7.Segunda cruza de colonias 7.8.Genes de los receptores asociados al mecanismo de resistencia Discusion 39 9.Conclusiones Literatura citada 45 v

6 DEDICATORIA A mis padres: A Irma y Jesús, porque gracias a su apoyo pude realizar mis deseos de estudiar la carrera de biología y continuar hasta la culminación con esta tesis, tal vez con algunas quejas de por medio pero aun así permitiéndome elegir mis propias decisiones. Todos mis éxitos de aquí en adelante estarán influenciados por ustedes. A mi hermana A Jessica, por su apoyo además de las bromas relacionadas acerca de mi carrera y la suya, por todos los momentos divertidos que hemos pasado juntos a través de los años, porque siempre serás una conexión con mi pasado, mi presente, y esperemos también mi futuro, porque posiblemente no leas esto al menos que te lo muestre (Es un hecho que tendré que mostrártelo para presumir mi tesis), gracias por todo. A mis amigos Mencionarlos a todos sería bastante problemático ya que puedo decir que cuento con una gran cantidad de amigos de los cuales conozco desde años, otros con menos tiempo de conocerlos pero de igual importancia, añadiendo que la mayoría de ustedes son bastante sensibles y se molestarían por una lista en orden alfabética, lo mejor será dejarlo con una clásica frase "Ustedes saben quiénes son", gracias por todos los momentos, los consejos, las risas, las pláticas profundas, las pláticas sin sentido que podemos llegar a tener, ustedes son parte de lo que soy ahora y agradezco bastante eso, gracias a todos. vi

7 AGRADECIMIENTOS A la Ciencia Si no conozco una cosa, la investigaré. Louis Pasteur ( ) Químico y microbiólogo francés. A los hombres les encanta maravillarse. Esto es la semilla de la ciencia. Emerson ( ) Poeta y pensador estadounidense. Me has entregado tanto a cambio de solo mi atención y mi tiempo, no me parece un intercambio justo, pero prometo regresarte todo lo que mi capacidad pueda ofrecer y un poco más, el gusto de estudiar biología es algo que tratare de inculcar a cualquier persona que se cruce por mi camino. Dr. Benito Pereyra Alférez Doctor, muchas gracias por recibirme en su laboratorio. Muchas gracias por los consejos tanto académicos como para la vida diaria, por su confianza tomando en cuenta que llegue a este laboratorio con solo una idea para un proyecto de un concurso y termine deseando quedarme, porque la frase "No queremos ser técnicos, queremos ser científicos", se ha impreso en mi mente como una ley, espero seguir trabajando con usted en el futuro. Tiene todo mi respeto y admiración. Dra. Licet Villarreal Treviño Doctora, muchas gracias por permitirme realizar mi servicio social en el laboratorio de microbiología general, y además tener una estadía como becario, esos fueron mis primeros pasos hacia donde me encuentro ahora, sus consejos siempre fueron bien recibidos, incluso aquellos que tenían relación con mi forma de vestir, mi cabello y presencia, tome nota de cada uno de ellos, no se preocupe, cada vez me veo más como un profesional, le agradezco todas sus atenciones. Gracias a la beca y los apoyos otorgados por CONACyT y CIBIOGEM Proyecto: durante la realización de esta investigación A todos los compañeros con los cuales pase mi estadía de servicio social y becario en el Laboratorio de Microbiología General de la Facultad de Ciencias Biológicas, gracias a ustedes aprendí bastante y me divertí mucho, gracias por los recuerdos. A todos los integrantes del Laboratorio L4 del Instituto de Biotecnología, a pesar del hecho de no verme tanto en el laboratorio siempre han procurado ayudarme en cualquier cosa que necesite o sobre alguna duda y eso lo aprecio bastante. vii

8 LISTA DE ABREVIATURAS Bacillus thuringiensis ingeniería genética Ha Bt IG Hectárea(s) C Grado(s) Celsius mm ml ADN GM OGM ph kda ANP ALP Mg GPI BBMV( por sus siglas en inglés) ppm h M mm X g TA Milimetro(s) Mililitro(s) Acido desoxirribonucleico Genéticamente Modificado Organismo geneticamente modificado Potencial de hidrogeno Kilodaltones Aminopeptidasa Fosfatasa alcalina Magnesio Glicosilfosfatidilinositol Vesículas del intestino medio Partes por millón Hora(s) Molar Milimolar Aceleración por gravedad Temperatura ambiente µg Microgramo(s) viii

9 g Min Gramo(s) Minuto(s) µl Microlitro(s) mg rpm nm SDS PM EPA PCR Hz10 Hz20 pb Miligramo(s) Revoluciones por minuto Nano molar Dodecil-sulfato de sodio Peso molecular Enviromental protection agency Reacción en cadena de la polimerasa Helicoverpa zea resistente a 10 µg/g de dieta Helicoverpa zea resistente a 20 µg/ g de dieta Pares de bases LC50 Concentración a la cual muere el 50% de los organismos LC99 Concentración a la cual muere el 99% de los organismos ix

10 LISTA DE FIGURAS Figura Titulo Pág. 1 Estadios de larva, pupa y adulto de H. zea Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una cepa de B. thuringiensis en estado de esporangio Mecanismo de acción de proteínas Cry en insectos lepidópteros Estructura tridimensional de diferentes toxinas Crya Inmunotiras Agdia presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS) Hojas utilizadas en el diagnóstico de expresión del algodón GM Inmunotiras Agdia presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS) Desarrollo en agar nutritivo de la cepa HD73 expresante de la protoxina Cry1Ac Tinción en Cristal Violeta de la cepa HD73 de Bacillus thuringiensis mostrando la proteína Cry1Ac en su forma bipiramidal Gel de poliacrilamida-sds al 10% de la protoxina Cry1Ac (130 KDa) presente en la cepa de Bacillus thuringiensis HD Placa de 24 orificios empleada en la determinación de la LC50 y los bioensayos de resistencia Diferencia de tamaño entre una larva control y una larva expuesta a una concentración de 10 µg/g de protoxina Cry1Ac después de una semana Determinación de sexos en H. zea del lado izquierdo se encuentra un macho y del lado derecho una hembra PCR con los iniciadores Apn1Ha, Apn2Ha y CadLHz x

11 LISTA DE TABLAS Tabla Titulo Pág. 1 Historial de producción máxima de algodón Historial de producción de Algodón GM en México Asociaciones entre los principales tipos de cristales de B. thuringiensis, proteínas Cry y su espectro de actividad insecticida Iniciadores utilizados para la amplificación de genes de los receptores involucrados en la resistencia en lepidópteros Transcurso cronológico de los ensayos en H. zea Cruza de colonias de H. zea Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias Segunda cruza de colonias de H. zea xi

12 RESUMEN El algodón biotecnológico BollgardII es un material que expresa las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab de Bacillus thuringiensis. Estas semillas, también llamadas algodón Bt es el cultivo de mayor cobertura a nivel mundial. Entre las principales plagas del algodonero y razón de este estudio se encuentra el gusano bellotero, Helicoverpa zea. La preocupación de aparición de resistencia en campo al algodón Bt, ha generado preocupación y motivo de estudio. El objetivo de este trabajo fue la obtención de colonias de H. zea resistentes a la protoxina Cry1Ac y la forma de herencia de la resistencia. Visitamos campos cultivados con BollgardII en San Pedro de Las Colonia, Coah., Sonoyta, Son., y el valle de Mexicali, BC., en busca de H. zea y Pectinophora gosypiella (gusano rosado). Demostramos que las plantas de los campos visitados expresan Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia al herbicida glifosato. Sin embargo no encontramos adultos, huevos, larvas o pupas de ninguno de los insectos buscados. A partir de una colonia de laboratorio iniciamos los ensayos de sensibilidad y resistencia. El resultado de los bioensayos con protoxina de Cry1Ac, mostró una LC50 de g/gramo de dieta. La búsqueda de los posibles receptores indicó la presencia de genes que codifican para dos alelos de aminopeptiodasa N y uno de cadherina. Cuando larvas neonatas fueron expuestas a la protoxina Cry1Ac a dos concentraciones altas, 10 y 20 µg/g dieta, el número de sobrevivientes en los bioensayos, sugiere que la resistencia podría estar asociada a un alelo parcialmente dominante. Las larvas resistentes son, en su mayoría machos en proporción 2:1 con respecto a hembras. En las colonias se observó bajo peso larval, bajo peso en estado de pupa, prolongación de los estadios larvales y el estado de pupa, pupas deformes, y adultos con problemas de copula. La búsqueda de la F2, cruza 1: hembras R x machos S; cruza 2: machos R x hembras S; cruza 3, machos R x hembras R, demostró que: i) cruza 1, hubo oviposición, pero ninguno fértil; ii) cruza 2, oviposición fértil, pero muy reducida con respecto a lo esperado; iii) cruza 3, oviposición infértil. El costo de aptitud de H. zea está directamente relacionado con la selección de resistencia a Cry1Ac. El estudio de la resistencia en laboratorio sirve para crear mejores estrategias de control en los cultivos a campo abierto. Las medidas en campo abierto como lo es la expresión de altas dosis de toxina y refugios es un método efectivo para evitar que las poblaciones de plagas puedan generar una resistencia.

13 1. INTRODUCCION El algodón representa alrededor del 40% de la fibra natural a nivel mundial y es cultivado comercialmente en 78 países. Sin embargo, éste puede ser el blanco de >1300 especies de insectos, entre los que destacan más de 30 especies de lepidópteros, principalmente Helicoverpa zea and Heliothis sp., Pectinophora gossypiella, y Earias sp. (Benedict y Ring. 2004; Naranjo. 2011). El control de los insectos plaga se realiza, tradicionalmente con insecticidas químicos, como piretroides, organoclorados y organofosforados. Sin embargo, éstos tienen la limitante de ser inespecíficos y afectan, no solo a la fauna silvestre sino también al ser humano. Por tanto, el control de las plagas se modificó con el uso de organismos enemigos naturales de las plagas: entomopatógenos y entomófagos. Entre los agentes de mayor uso se encuentra Bacillus thuringiensis (Bt). Bt es un organismo esporulado que sintetiza un cristal de naturaleza proteica (δ-endotoxinas) con actividad tóxica hacia ciertos organismos, especialmente insectos Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros (Ferré et al., 2008; Iracheta et al., 2000; Marroquín. 2006). Los productos comerciales a base de Bt se aplican en forma de polvos humectables sobre el área foliar de los cultivos, con la desventaja de la inactivación por radiación solar y lavado por lluvia. La clonación y expresión de genes de δ-endotoxina en otras bacterias y en plantas ha incrementado el uso de Bt como el insecticida biológico de mayor uso (Tabashnik et al., 2009). El cultivo de plantas modificadas por ingeniería genética (IG), entre 1996 y 2009 representaron cerca de mil millones de Ha en varios países alrededor del mundo, con un incremento constante de 10 millones de Ha/año desde 1996 (James. 2009; Naranjo. 2011). En el 2009, plantas modificadas por ingeniería genética (IG) fueron sembradas en más de 134 millones de Has en 25 países, representando alrededor de 63% del total. Entre las plantas de mayor cultivo se encuentran las tolerantes a herbicidas como glifosato o glufosinato (James. 2009). Mientras que las resistentes a insectos produciendo las toxinas de Bt comprenden el resto, pero comparten el 57% con las tolerantes a herbicidas (Benedict y Ring. 2004; Naranjo. 2011). Entre los principales productos biotecnológicos del algodonero, se encuentran Bollgard y Bollgard II. Bollgard sintetiza solo la toxina Cry1Ac, pero el Bollgard II produce dos; Cry1Ac y Cry2Ab (Moar y Anilkumar. 2007). En los Estados Unidos la patente de Bollgard finalizó en el 2009, por lo que ha sido reemplazado por el Bollgard II y el Widestrike. Con éste último, se obtiene el plus de la tolerancia a herbicidas (Naranjo. 2011). A pesar de todos estos desarrollos biotecnológicos, se ha reportado la aparición de resistencia a las toxinas de Bt en varios insectos plaga, entre los que se encuentra Pectinophora gossypiella "el gusano rosado", la principal plaga del algodonero (Tabashnik et al., 2009; Soberón et al., 2007; Ferré et al., 2008), además de otros insectos plaga como Helicoverpa zea (Sivasupramaniam et 1

14 al., 2008; Anilkumar et al., 2009; Jackson et al., 2006 ) y Heliothis virescens ( Jurat et al., 2003, 2004, 2006). Una solución, parcial, al problema de resistencia ha sido la obtención de semillas que generen plantas que sinteticen dos toxinas, como el Bollgard II, las dos proteínas actúan independientemente, uniéndose a receptores distintos en el intestino del insecto (Moar y Anilkumar. 2007). Otra posible solución podría ser la generación de plantas con toxinas modificadas, como la Cry1Ab, donde se demostró que la α- hélice 5 es la responsable de la resistencia en "el gusano rosado" (Soberón et al., 2007). Con respecto a las plantas Bt y las combinaciones con tolerancia a herbicidas, quedó de manifiesto que solo las plantas Bt rinden ahorros significativo. Mientras que las plantas con tolerancia a herbicidas en la mayoría de los casos no mostraron diferencias con las normales, al ser necesario aplicar mayor cantidad del herbicida para eliminar a las malezas (Cataneo et al., 2006.) En las zonas algodoneras del país como Mexicali, BC., La Laguna, Sonoyta, Son., Delicias, Chih., y Tamaulipas, los insectos P. gossypiella, H. zea, H. virescens y Spodoptera exigua son las principales plagas del algodón y afectan gravemente su producción, causando cuantiosas pérdidas año con año. En nuestro país la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) en asociación con la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (CIBIOGEM) solicitaron revisar el estado de la entomofauna asociada al algodón biotecnológico, especialmente Bollgard II (CIBIOGEM. 2011). Ante esta situación, el objetivo de nuestro trabajo consistió en: i) revisar el estado de colonización de los cultivos biotecnológicos Bollgard II con los insectos mencionados; ii) establecer una colonia de H. zea en el laboratorio, conocer la línea basal de susceptibilidad, inducir resistencia y conocer la forma de herencia de la misma. 2

15 2. IMPORTANCIA Aún y cuando previo a la comercialización del algodón Bt en EUA, Canadá y la Unión Europea se evaluaron los potenciales riesgos ambientales de las plantas transgénicas resistentes a insectos, se ha requerido de una enorme inversión de recursos económicos para evaluar el impacto ambiental en cultivos a "cielo abierto" (EPA. 2007). Un primer paso es la determinación del potencial riesgo de toxicidad hacia entomofauna benéfica o no blanco (Duan et al., 2010; Wolfenbarger et al., 2008). De no existir daño de muerte o toxicidad, entonces se juzga como de riesgo mínimo (Rose. 2006; Romeis et al., 2006). En 2010, Duan y cols. dirigieron un estudio para evaluar el impacto sobre organismos no blanco, concluyendo que, aún y cuando no existe un efecto, estadísticamente significativo, sobre los organismos no blanco es preciso realizar el estudio ambiental (Duan et al., 2010). A pesar de la enorme importancia económica y ecológica, poco es conocido sobre la genética de la mayoría de los lepidópteros, debido a su gran número de cromosomas, en algunas especies un gen recesivo autosómico es el que confiere resistencia a, por lo menos, cuatro toxinas de Bt (Heckel et al., 1999). El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de resistencia en insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el manejo de plagas resistentes, la investigación en esta área tiene como objetivo aportar información sobre las características de unión implicadas principalmente, de acuerdo a estudios realizados, en el comportamiento de la resistencia hacia la toxina Cry1Ac de Bt sobre H. zea como insecto plaga de los algodoneros de México. 3

16 3. HIPOTESIS La presión constante de la δ-endotoxina Cry1Ac en una población de H. zea podría generar en el insecto una resistencia progresiva a dicha toxina. 4

17 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General Obtener colonias de H. zea resistentes a la protoxina Cry1Ac e incrementar el conocimiento sobre la resistencia de esta plaga a la proteína Cry presente en los cultivos transgénicos de algodón de nuestro país Objetivos Específicos 1. Analizar la susceptibilidad de H. zea presente en la zona algodonera de México hacia la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis HD Determinar la LC50 de la protoxina Cry1Ac en la población de H. zea presente en el laboratorio de cría de insectos del Instituto de Biotecnología, UANL. 3. Lograr generar una resistencia inducida en laboratorio hacia la protoxina Cry1Ac en la población de H. zea. 4. Identificar la forma de herencia de la resistencia a Cry1Ac en H. zea. 5. Detectar el gen para cadherina, y aminopeptidasa N en las colonias resistentes y susceptibles a Cy1Ac 5

18 5. ANTECEDENTES 5.1. Características de Helicoverpa zea (Boddie) H. zea (Boddie) está registrado como polífago en hábitos alimenticios pero parece mostrar una preferencia definida en Norteamérica por las mazorcas y espigas jóvenes de maíz, y particularmente para cultivares de maíz dulce y palomero y también para el sorgo. Tiene como preferencia alimenticia a las flores y frutos de la planta hospedera. Muchos hospederos se registran dentro de la familia Poaceae, Malvaceae, Fabaceae y Solanaceae; en total se registran más de 100 especies de plantas como hospederos. Los cultivos más comúnmente registrados como hospederos son maíz, sorgo, algodón, Phaseolus, chícharo, tomate, berenjena, chile, haba y, en menor grado, Trifolium, okra, col, lechuga, fresa, tabaco, girasol, Cucurbitaceae y muchas otras leguminosas (Smith et al., 1992). Distribución geográfica: desde Norteamérica, hasta Sudamérica, incluyendo Centroamérica y el Caribe. Biología: los huevecillos son ovipositados en los pelos del jilote del maíz en pequeños números (uno a tres), pegados a los tejidos de las plantas. Hasta 3,000 huevecillos han sido ovipositados por una sola hembra en cautiverio, pero es más usual en forma silvestre que sea de 1000 a 1,500 por hembra. La eclosión ocurre después de 2-4 días y los huevecillos cambian de color de verde a rojo o gris. Las pequeñas larvas grises primero se alimentan del cascarón del huevo y después de un corto descanso se vuelven muy activas derivado de lo cual empiezan a alimentarse de la planta. El desarrollo larval usualmente toma de (promedio 16) días, pero bajo condiciones frías requiere 60 días. En el instar final, usualmente el sexto, deja de alimentarse y la larva completamente desarrollada abandona la planta y desciende al suelo. Esta se entierra en el suelo a unos cm y forma una celda cubierta de tierra, donde descansa en un estado prepupal por 1-2 días, antes de que pupe finalmente. Los adultos son de hábitos nocturnos y emergen en las tardes. Los campos de maíz de EUA regularmente producen 40,000 a 50,000 palomillas adulto/ha. El vuelo de los adultos responde a las radiaciones de luz nocturna y son atraídos por trampas de luz (Hardwick. 1968), especialmente el tipo ultravioleta, en compañía de muchos otros noctuidos locales. La longevidad del adulto es registrada por ser cercana a 17 días en cautiverio; éstos beben agua y se alimentan de néctar de nectarios florales y extraflorales. Las palomillas vuelan fuertemente y son migrantes estacionales regulares, vuelan cientos de kilómetros de EUA a Canadá. El ciclo biológico puede ser completado en días a 25 C y en los trópicos puede haber hasta generaciones por año. Todos los estados del insecto son encontrados a lo largo del año si el alimento está disponible, pero el desarrollo disminuye o se detiene por sequía o el frío. 6

19 Síntomas: las plantas jóvenes tienen hoyos severos en las hojas siguiendo la alimentación en la hoja apical. En plantas grandes las sedas son rozadas y los huevecillos pueden ser encontrados pegados a las sedas. Morfología: Los huevecillos son subesféricos, con surcos radiales, de 0.52 mm de alto y 0.59 mm de diámetro, depositados en forma individual en el sustrato de la planta, verdes cuando se ovipositan, turnándose rojos y finalmente grises antes de la eclosión. Las larvas recién emergidas son pequeñas, grises, tienen una cápsula cefálica negruzca; pasan usualmente por seis instares, pero cinco o siete no son comunes, el tamaño final del cuerpo es de aprox. 40 mm de largo. En el tercer instar se pueden desarrollar dos fases de color: café (la fase predominante) y verde (menos frecuente). Están presentes líneas longitudinales de color blanco, crema o amarillo, y la banda espiracular es la más distintiva. Conforme la larva se desarrolla, el patrón se define mejor, pero en el instar final (sexto) la coloración cambia abruptamente en un patrón brillante, frecuentemente rosado y con estriaciones extra. Pupa: una pupa típica de un noctuido, de color café rojiza brillante, de aprox. 16 mm de largo, y con dos espinas cremaster distintivas. Adulto: palomilla de coloración café con expansión alar de mm; ala anterior café pálido a verdosa con marcas oscuras transversales, alas posteriores pálidas con una banda marginal ancha oscura. Los adultos son muy similares en apariencia y ambos son indistinguibles morfológicamente de Helicoverpa armígera, pero difieren en varios detalles de su genitalia (Hardwick. 1965). Figura 1. Estadios de larva, pupa y adulto de H. zea. 7

20 5.2. Características de Gossypium hirsutum El algodón pertenece al género Gossypium, familia Malvaceae, el cual comprende un amplio número de especies. Citológicamente las especies de este género se pueden dividir en: diploides (n=13) y tetraploides (n=26), cuya distribución geográfica se encuentra por todo el mundo. De las especies diploides únicamente G. herbaceum y G. arboreum han sido cultivadas comercialmente, y aún son importantes en áreas restringidas de la India, Asia y África. Entre las tetraploides, del Nuevo Mundo, solamente G. hirsutum y G. barbadense se les cultiva ampliamente y son las responsables del 98% de la producción mundial de fibra de algodón. La especie de algodón que se cultiva comercialmente en el país es Gossypium hirsutum L. y es originaria de México y Centro América, en donde se pueden encontrar plantas nativas creciendo como arbustos de carácter perenne y crecimiento indeterminado. A través del mejoramiento genético el hábito de crecimiento de esta planta ha sido modificado para adaptarla a la producción comercial, pasando de las plantas nativas, perennes e indeterminadas a plantas anuales y de crecimiento más o menos determinado que producen algodón semilla más temprano que las plantas nativas (Cadena. 2000). Existen actualmente zonas de producción en diversos estados del norte del país. - La Comarca Lagunera (Coahuila y Durango) es la zona en la que se cultiva la mayor cantidad de algodón en México. Los estados en los que el algodón se cultivó con éxito durante 2011 fueron: Sinaloa, Sonora, Baja California, Chihuahua, Tamaulipas, Coahuila y Durango. De acuerdo con el Comité Nacional Sistema Producto Algodón, A.C., el historial de producción máxima en México se ilustra en la tabla Algodón GM en México Desde hace 15 años, la ingeniería genética, también llamada tecnología del ADN recombinante, se está aplicando para obtener plantas de algodón GM (Genéticamente Modificados) resistentes a insectos y tolerantes a herbicidas, existiendo un gran potencial para introducir otras características deseables en la planta. Esta nueva tecnología es considerada como un instrumento alternativo para modificar y mejorar los cultivos; particularmente en el caso del algodón donde las pérdidas por insectos y malezas son altamente significativas. Según la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), el uso de semillas GM en los cultivos de algodón reduce significativamente el volumen del agua requerido para el riego. Además, los cultivos son menos dañinos para el medio ambiente debido al uso racional de pesticidas. El algodón GM puede aumentar la productividad y la renta notablemente y, por tanto, pueden ser un motor de crecimiento económico rural que contribuya a mejorar las condiciones de vida de los agricultores. 8

21 Tabla 1. Historial de producción máxima de algodón (Adaptada del Comité Nacional Sistema Producto Algodón, A.C, 2011). SUPERFICIE Y PRODUCCIONES POR CICLO AÑO MILES DE HAS. MILES DE TON. RENDIMIENTO (TON./HA) , , Hasta el año 2010 se han aprobado 182 permisos de liberación al ambiente de algodón genéticamente modificado, es decir el 58.5% del total de permisos de OGM s otorgados por el gobierno mexicano. La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) afirmó que los cultivos GMs son una de las herramientas claves para permitir que la actividad agrícola siga siendo productiva (Agro-Bio México, 2011). 9

22 Tabla 2. Historial de producción de Algodón GM en México (Adaptada de Medel. 2011). AÑO SUP. TOTAL Ha Algodón GM (Ha) Algodón GM (%) , % ,378 16, % ,602 35, % ,229 18, % ,166 26, % ,898 25, % ,482 15, % ,892 26, % ,007 65, % ,533 78, % ,655 54, % ,575 58, % ,741 63, % ,251 39, % 5.4. Características de B. thuringiensis Es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta, que durante su ciclo de vida presenta dos fases principales: crecimiento vegetativo, donde las bacterias se duplican por bipartición, y esporulación, un programa de diferenciación de bacteria a espora. Bt es considerada una bacteria ubicua, ya que se ha aislado de todas partes del mundo y de muy diversos sistemas, como suelo, agua, hojas de plantas, insectos muertos, telarañas, etc. A Bt se le caracteriza por producir un cuerpo paraesporal conocido como cristal durante su fase de esporulación, el cual es de naturaleza proteínica y tiene propiedades insecticidas (Soberón y Bravo. 2007) Cristales paraesporales Desde el instante en el que ocurre el englobamiento de la pre-espora hasta su maduración, en simultaneidad con la formación de la espora, tiene lugar en B. thuringiensis la síntesis de uno o varios cristales parasporales, que pueden representar hasta un 30% del peso seco del esporangio (Bulla et al., 1980). Estos cristales pueden presentar distintas morfologías y pueden clasificarse en bipiramidales, cúbicos, cuadrados aplanados, esféricos y otras formas atípicas menos frecuentes (Khetan. 2001). Se logró en muchos casos establecer asociaciones entre la morfología del cristal, sus proteínas Cry constituyentes, el peso molecular de éstas y su espectro de actividad insecticida (Tabla 3) (López e Ibarra. 1996). 10

23 Tabla 3. Asociaciones entre los principales tipos de cristales de B. thuringiensis, proteínas Cry y su espectro de actividad insecticida (Adaptada de Sauka. 2008). Tipo de Cristal Grupo Peso Toxicidad molecular (kda) Bipiramidal Cry Lepidópteros Cúbico Cry Lepidópteros y Dípteros Cuadrado Cry Coleópteros aplanado Esférico Cry4A,Cry4B, Cry10 y Cry , 128.0, 78.0, 72.0 Dípteros Sin embargo, existen trabajos en los que se describieron cristales parasporales que, a pesar de tener morfologías asociadas a una toxicidad específica, no parecen poseer actividad insecticida alguna. Los cristales de B. thuringiensis pueden ser degradados por la acción de los microorganismos del suelo (West. 1984) y, al igual que sus esporas, también pueden ser inactivados por la acción de la luz ultravioleta (Pusztai et al., 1991). El cristal parasporal se ubica en el interior del esporangio y, por lo general, fuera del exosporio de la espora, y ambos son finalmente liberados tras la lisis celular. Figura 2. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una cepa de B. thuringiensis en estado de esporangio. C: cristal parasporal; E: espora. Barra, 0,5 mm (Imagen tomada de Sauka. 2008). Existen algunos casos donde se describieron cristales dentro del exosporio, por lo que estos continúan junto a las esporas tras la lisis. En otro caso muy atípico, se pudo observar que los cristales se forman fuera del exosporio, pero ambos permanecen 11

24 indefinidamente dentro de un esporangio que no se lisa, preservándolos de una rápida degradación. Cada cuerpo de inclusión cristalino puede estar constituido por proteínas Cry de una o varias clases que se agrupan entre sí mediante puentes disulfuro (Knowles. 1994). La estabilidad de estas uniones condiciona el ph de solubilización particularmente en el caso de los cristales bipiramidales. El cristal proteínico está constituido por proteínas denominadas δ-endotoxinas también conocidas como proteínas Cry. Se han encontrado δ-endotoxinas activas contra insectos lepidópteros (mariposas y palomillas), coleópteros (escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también contra otros invertebrados como nematodos, gusanos planos y protozoarios (Soberón y Bravo, 2007) Modo de acción de las toxinas Cry Los síntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles ingieren los cristales y esporas de Bt son: cese de la ingesta, parálisis del intestino, diarrea, parálisis total y finalmente la muerte. De manera general se acepta que las toxinas Cry son toxinas formadoras de poro que ejercen su actividad tóxica al provocar un desequilibrio osmótico en las células epiteliales donde se insertan en la membrana. Soberon y Bravo ( 2007) proponen el modo de acción donde existe la formación de un poro lítico una vez que las toxinas se insertan a la membrana. Las proteínas Cry son producidas como protoxinas que requieren ser procesadas proteolíticamente por proteasas presentes en el intestino de insectos susceptibles. Este procesamiento proteolítico libera fragmentos tóxicos de 55 a 65 kda que interaccionan con proteínas receptoras presentes en la microvellosidad de las células intestinales de los insectos blanco. Posteriormente, las toxinas se insertan en la membrana formando un poro lítico. A la fecha se han resuelto las estructuras tridimensionales de varias toxinas Cry activas contra insectos coleópteros, lepidópteros, dípteros y una con actividad dual. A pesar que la identidad entre estas toxinas es baja (en algunos casos menores al 25 %), muestran una estructura similar compuesta por tres dominios. El dominio I está constituido por siete hélices a antiparalelas y anfipáticas. Seis de éstas forman un ramillete que rodea a la hélice α 5. Éste es el dominio que forma el poro iónico 12

25 Bacillus thuringiensis (Bt) Solubilizacion Activacion Maiz Bt Algodón BT 1 Cadherina 4 Septicemia Muerte de la larva Unión con el receptor Monomero Toxico 3 Inserción en membrana Células del intestino medio 2 Muerte Celular Activación de la vía de muerte celular Figura 3. Posterior a la ingesta, solubilización y activación en el intestino medio, el modo de acción celular es: 1) Unión de la toxina a cadherina y corte desde su extremo C-terminal para generar la forma monomérica activa; 2) inicio de la cascada de señalización dependiente de Mg2+, estimulación de exocitosis de cadherina desde vesículas intracelulares hacia la membrana apical y consiguiente muerte celular; 3) formación de la estructura oligomérica pre-poro; 4) unión del oligómero a la aminopeptidasa N (APN) y/o fosfatasa alcalina (ALP) y migración a zonas específicas de la membrana, formación del poro y, finalmente desequilibrio osmótico y consiguiente muerte celular (Imagen tomada de Jurat-Fuentes) (Bravo et al., 1998; Zhang et al., 2006). El dominio menos conservado en secuencia y estructura terciaria entre las toxinas Cry es el dominio II. Este dominio está formado por tres láminas plegadas b y por tres asas. En las asas de estas láminas β se observa la mayor diferencia estructural. El dominio II juega un papel fundamental en la especificidad de la toxina, donde las asas interaccionan con el receptor localizado en las microvellosidades de las células epiteliales del intestino medio. El dominio III está formado por dos láminas plegadas β antiparalelas formando un sándwich. El dominio III también está involucrado en la interacción con receptores. 13

26 Figura 4. Estructura tridimensional de diferentes toxinas Cry, el dominio I, dominio II y dominio III están mostrados en rojo, verde y azul respectivamente. El dominio de la protoxina N-terminal de Cry2Aa esta mostrado en amarillo (Imagen tomada de Piggot y Ellar. 2007). Las proteínas que se han propuesto como posibles receptores de las toxinas Cry1A en insectos lepidópteros son la aminopeptidasa N (APN) y una proteína de la familia de las cadherinas (BtR). La APN es una proteína con masa aparente de 120 kda que se encuentra anclada a la membrana a través de un grupo glicosilfosfatidilinositol (GPI), mientras BtR tiene una masa de entre 175 a 210 kda dependiendo del insecto lepidóptero. La interacción de la toxina con el receptor cadherina promueve un corte adicional del extremo amino terminal, facilitando la formación de un oligómero o preporo formado por cuatro monómeros que es el responsable de la inserción a la membrana y la formación del poro. Para que el pre-poro se inserte a la membrana, se requiere que interaccione con el receptor APN. Las proteínas ancladas a la membrana por GPI se distribuyen de manera preferencial en regiones específicas de la membrana, conocidas como balsas lipídicas, que tienen características particulares debido a su alto contenido de colesterol y glucolípidos. La interacción del pre-poro de la toxina Cry con la APN facilita la inserción del oligómero en las balsas lipídicas membranales, lo que resulta en la formación del poro (Soberón y Bravo. 2007). 14

27 5.7. Receptores asociados a la resistencia a las toxinas Cry La unión de las toxinas Cry en los receptores epiteliales del intestino medio de insectos es un importante factor determinante de la especificidad. La correlación entre los unión y la toxicidad se demostró primero en las vesículas del intestino medio (BBMV por sus siglas en inglés) preparado a partir de microvellosidades mediante el uso de una técnica desarrollada por Wolfersberger (1984). Después de haber sido demostrado la alta afinidad y la toxicidad en los sitios de unión presentes en el intestino medio del insecto, los esfuerzos para identificar y clonar los receptores se intensificaron. Muchos posibles receptores de las toxinas Cry ya se han informado, de los cuales el mejor caracterizado es el receptor aminopeptidasa N (APN) ( Knight et al., 1994; Rajagopal et. al., 2003) y los receptores de cadherina (Gahal et al., 2001; Nagamatsu et al., 1998) identificados en lepidópteros. Recientemente se ha estudiado otro posible receptor, la fosfatasa alcalina (ALP) (Jurat-Fuentes; 2004, 2006; Caccia et al., 2012) y se ha asociado a la resistencia adquirida hacia las toxinas Cry. En las siguientes secciones, cada clase de receptores se ser discutido con un enfoque particular en las interacciones de unión del receptor de la toxina y la capacidad de los receptores para conferir susceptibilidad a la toxina APN La familia APN es una clase de enzimas que desdoblan aminoácidos neutros desde el extremo N-terminal de los polipéptidos. Tienen una variedad de funciones en una amplia gama de especies, pero en la intestino medio de larvas de lepidópteros, trabajan en cooperación con endopeptidasas y carboxipeptidasas para digerir proteínas derivadas de la dieta del insecto (Wang et al., 2005) APN como una proteína de unión a toxinas Cry Las proteínas Cry son tóxicas para los lepidópteros, y varias toxinas diferentes, incluyendo, Cry1Aa Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ba, Cry1C, ay Cry1Fa, han demostrado que se unen a la APN (Piggot y Ellar. 2007). Sobre la base de los experimentos llevados a cabo hasta el momento, APN y proteínas dentro de estas familias muestran diferentes patrones de unión. Algunas APN se unen a múltiples toxinas Cry y algunas toxinas Cry se unen a múltiples APN, y en otros casos, los pares únicos de APN- Toxinas han sido reportados. Mientras que muchas combinaciones de unión a la toxina-apn aún no se han probado, los datos preliminares están proporcionando una idea de los factores determinantes de la unión al receptor. La importancia biológica de la interacción entre las APN y las toxinas Cry demuestra la importancia en el proceso de resistencia. Hasta la fecha, diecisiete diferentes APN han sido reportadas para unirse a las toxinas Cry y, sin embargo, sólo 2 15

28 han demostrado mediar en la susceptibilidad de la toxina. Doce de las diecisiete APNs no se han estudiado para identificar la funcionalidad por cualquier método. Los métodos in vivo para probar la funcionalidad de las APN han mostrado una promesa considerable, y el uso de estos métodos para estudiar las APNs restantes puede conducir a una mejor comprensión de la importancia global de esta clase de receptor de la toxina Cry (Piggot y Ellar. 2007) Cadherinas La superfamilia de proteínas cadherina es muy diversa y sirve en una variedad de funciones, incluyendo la adhesión celular, la migración, la organización del citoesqueleto, y la morfogénesis (Angs et al., 2001). La expresión de cadherinas está muy regulada, tanto espacial como temporalmente, y es a menudo única para un tipo de célula particular. La proteínas se definen por la presencia de repetidos dominios de unión de calcio o repeticiones de cadherina de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud. La proteína receptora para CryIAb (BT-R,), fue el primer receptor que se clonó y expresó a partir de un cdna de Manduca sexta, este receptor mostró un 30-60% de similitud y un 20-40% de identidad a los miembros de la familia de las cadherinas, que son glicoproteínas transmembranales encargadas de mediar la agregación celular, dependiente de calcio; pueden estar involucradas en el transporte membranal, posiblemente esta función es similar al transporte de péptidos en las proteínas tipo cadherinas de humanos (Vadlamudi et al., 1995). En H. virescens se rebeló la identificación de una cadherina como proteína de unión a la toxina Cry esto se logró por Gahan y cols. (2001), donde se estudió una cepa de laboratorio de H. virescens, YHD2, con un máximo nivel de resistencia recesiva a Cry1Ac (relación de resistencia, 10,128X). Los estudios genéticos revelaron que un solo gen fue el mayor responsable de 40 a 80% de la resistencia. Con el conocimiento que en algunos insectos, la resistencia va acompañada de una pérdida en la unión de la toxina, los investigadores analizaron los genes de las conocidas proteínas de unión a la toxina Cry para ver si se asignan a la región que confiere resistencia. Dos genes de codificación de APNs (clase 1 y clase 3) se les realizaron pruebas de la vinculación, pero dieron un resultado en el cual se unían a diferentes regiones del genoma. Se sabía que era una cadherina la encargada de la unión a la toxina Cry pero aún no se podía aislar en H. virescens. Por esta razón, los investigadores buscaron y encontraron un homólogo BtR175 en una cepa susceptible. El gen era 70% idéntica a BtR175 y fue nombrado HevCaLP. Posteriormente, el gen fue cartografiado en resistente insectos y se han encontrado a residir en el locus de resistencia (Gahan et al., 2001). A la fecha, todos los genes clonados y expresados de cadherina en cultivos celulares, han demostrado que se unen a la toxina. El éxito de este enfoque puede ser debido en parte al hecho de que la glicosilación hace parecer no ser esenciales para la 16

29 unión a la toxina, y por lo tanto las diferencias en la glicosilación entre las proteínas expresadas en el intestino medio y proteínas expresadas en las células cultivadas pueden ser irrelevantes. Por lo tanto, la validación de las proteínas cadherina como receptores de la toxina comparativamente más fácil que la validación de APN, donde glicosilación, en algunos casos, es crítico para la unión. Aunque las proteínas cadherina como mediadores son claramente importantes de la susceptibilidad de las toxinas Cry, parece poco probable que sean receptores de la toxina Cry universales. Por ejemplo, en la cepa de H. virescens YHD2 expresa una forma truncada de HevCaLP y es altamente resistente a las toxinas Cry1A pero muestra poca resistencia cruzada a Cry2Aa, Cry1Ca, o Cry1Ba (Gould et al., 1995) ALP Las ALP (alcalino fosfatasas) también han sido identificadas como receptores de la toxina Cry. Sin embargo, el trabajo es muy limitado en comparación con la investigación sobre la APN y los receptores de cadherina, no obstante, los resultados preliminares sugieren que la ALP puede actuar como un receptor de Cry1Ac en M. sexta (McNall y Adang, 2003) y H. virescens (English y Readdy. 1989, Caccia et al., 2012) y como un receptor Cry11Aa en Aedes aegypti. En H. virescens, ALP es una glicoproteína GPI anclada en la membrana de 68-kDa (Jurat-Fuente y Adang. 2004). La unión a Cry1Ac se demostró por análisis de transferencia de ligando de BBMV y parece ser dependiente la presencia de un oligosacárido enlazado a la sección N- terminal que contiene un residuos de GalNAc. Curiosamente, los niveles de expresión de fosfatasa alcalina se redujeron en una cepa resistente de H. virescens, lo que sugiere una papel funcional en la toxicidad. La presencia de un anclaje de GPI y la importancia de GalNAc en la unión de la toxina muestra un claro paralelismo a la APN y su interacción con Cry1Ac (Knight et al., 1994). En M. sexta, una proteína de 65 kda en las BBMV se identificó como un proteína de unión a Cry1Ac por electroforesis en gel de dos dimensiones seguido por un análisis de transferencia de ligando (McNall y Adang. 2003). Se identificó como ALP por las búsquedas de bases de datos de huellas dactilares de masas de péptidos y detección con un anticuerpo ALP-específico. La proteína se predijo para ser una GPI anclada, pero no estaba presente en las proteínas liberadas de las BBMV por tratamiento con PI-PLC. El papel de las ALP en M. sexta como mediadora de la susceptibilidad a Cry1Ac tiene todavía que ser establecido, al igual que la importancia de la glicosilación de ALP en la unión a la toxina, sin embargo, la proteína se ha demostrado que acopla con las toxinas Cry1A en las microvellosidades de las celulares epiteliales del intestino medio de M. sexta (Chen et al., 2005). 17

30 5.8. Resistencia a toxinas de B. thuringiensis. Debido al gran uso de formulaciones de Bt, los insectos han estado expuestos en continuas generaciones a las toxinas y por lo tanto desarrollando una condición ideal para la resistencia. Las cepas resistentes de Filipinas (PHI), Hawai (NO-QA) y Pensilvania (PEN) desarrollaron resistencia a tres toxinas presentes en el formulado (Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac) y permanecen susceptibles a Cry1C y otras toxinas no presentes en el formulado. Ballester y cols. (1999), sugirieron que Cry1Aa y Cry1F poseen diferentes determinantes de unión pero se unen al mismo sitio, interfiriendo la unión de Cry1Ab y Cry1Ac. Además, propone modelos de unión donde Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y Cry1F comparten el mismo sitio y Cry1B posee un solo sitio de unión a lo igual que Cry1C. Un comportamiento similar es encontrado en la cepa PHI la cual es resistente a Cry1Ab y posee un diferente determinante de unión que puede cambiar sin afectar la unión de otras toxinas. Esto es encontrado también en una cepa de Malasia donde se observa una unión reducida para Cry1Ab pero no hacia Cry1Aa, Cry1Ac y Cry1C. Algunos cambios ocurridos en el receptor han ocasionado que una toxina, por ejemplo, posea 2 sitios de unión de alta afinidad pero no es suficiente para indicar toxicidad. Por otro lado se ha demostrado en una muestra que una toxina no relacionada (Cry1C) es efectiva en superar la resistencia hacia Plodia interpunctella, dado que incremento la sensibilidad y la cantidad de receptores para Cry1C en el insecto, el cual había mostrado una disminución en la sensibilidad a Cry1Ab. Ferré y cols. (2008), trabajando con una cepa resistente de Plutella xylostella encontraron que dicha población del campo es menos susceptible a Cry1Ab, debido a la disminución en la concentración de receptores y en la unión a la toxina. Además encontró insectos susceptibles a Cry1B y Cry1C, proteínas no presentes en el formulado Dipel. Esto demuestra que la resistencia a Cry1Ab no causa resistencia cruzada a toxinas no presentes en el formulado. Los mecanismos de acción de las proteínas con actividad insecticida es un proceso de dos pasos: 1) la unión específica y 2) el rompimiento de la membrana. Esto podría decir que la toxicidad es solamente en parte determinada por las características de unión. La unión específica parece esencial para la toxicidad pero quizás no es suficiente, dado que algunas toxinas se unen a la membrana del insecto sin ser tóxicas (Ferré et al., 2008). Aunque en muchos casos una correlación positiva entre parámetros de unión (Kd y concentración de sitios de unión) y toxicidad fue asociada, algunos autores han reportado excepciones en el cual esta correlación no es directa, por ejemplo en Phthorinaea operculella se presenta una alta afinidad de unión hacia Cry1Ab y Cry1C, pero a aun posee la misma afinidad la toxicidad para Cry1Ab es cinco veces mayor que para Cry1C (Pigott y Ellar. 2007). 18

31 Pruebas de Selección en laboratorio de otros insectos. El estudio de las bases moleculares de la resistencia contra toxinas seleccionadas hacia insectos plaga merece un intensivo estudio y podría proveer un importante indicio para el entendimiento de la resistencia y el desarrollo de apropiadas estrategias. Es por eso que se han realizado algunos avances para el entendimiento de las bases bioquímicas de la resistencia. La selección artificial en el laboratorio que ha producido un número de líneas resistentes en diferentes especies: P. interpunctella, H. virescens, Leptinotarsa decemlineata entre otras, permitirá entender la resistencia (Gould et al., 1992). P. interpunctella que fue el primer insecto plaga en el que se estudió la resistencia en laboratorio hacia B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, se encontró que al utilizar toxinas de otra cepa de Bt la resistencia disminuía. Una hipótesis atractiva es que la cepa seleccionada es resistente solamente a toxinas Cry1A pero no a otras toxinas. Los insectos que han desarrollado tolerancia a toxinas de Bt, han mostrado un mecanismo que interfiere en algún paso involucrado en el modo de acción. Este evento fue demostrado en P. interpunctella donde la base molecular de la resistencia involucró un cambio en el receptor y una correlación entre la reducción de la toxicidad y disminución en la afinidad de unión. La unión al receptor ha sido caracterizada, así como analizada la usando vesículas (BBMV) del intestino de varias larvas de lepidópteros y de ciertas proteínas de Bt. Los sitios de alta afinidad fueron identificados y correlacionados con la toxicidad observada. Wolfersberger (1990) reportó una correlación cualitativa de actividad insecticida y unión a dos toxinas de B. thuringiensis, Cry1Ac y Cr1Ab, donde a su vez más tarde encuentra relación inversamente cuantitativa entre la actividad insecticida de estas proteínas y la unión al receptor para Lymantria dispar. En un ensayo con una cepa sensible de H. virescens se observó que las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac compiten de igual manera por el mismo sitio. En cambio en una cepa del mismo insecto seleccionada artificialmente en laboratorio, se observó que Cry1Ab es menos efectiva para desplazar a Cry1AC. Estos datos sugieren que la especificidad al receptor, en el insecto resistente ha sido modificada a estas dos proteínas. Las cepas resistentes producidas en laboratorio poseen algunas desventajas biológicas a las que no son sometidas como los insectos resistentes del campo, tal como son: migración del insecto, refugios, un vasto número de insectos presentes en el campo, además los factores estresantes en el campo son mayores (Ferré et al., 2008). 19