Validación de Métodos

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1 Validación de Métodos Francisco Rojo Callejas

2 Validación de Métodos Definiciones Parámetros básicos Requisitos

3 Validación de Métodos El proceso de definir las condiciones analíticas y confirmar que el método cumple los objetivos. El objetivo es garantizar que el método y el lugar donde se implementan son capaces de lograr resultados rutinarios dentro de las especificaciones del método y que sus resultados son confiables.

4 Parámetros que otorgan validez Selectividad y Especificidad Precisión Repetibilidad Reproducibilidad intermedia (intra-laboratorio) Reproducibilidad Inter-laboratotrio Incertidumbre combinada de la medición Exactitud Materiales de referencia (trazabilidad) Ningún error sistemático en todo el intervalo de trabajo Linealidad, intervalo lineal y de trabajo Límites de detección y cuantificación Ausencia de efectos de matriz Estabilidad de la muestra Robustez

5 Cuando hay que validar? Si se pretende una acreditación (EMA, ISO/CIEC 17025) o certificación (ISO 9000) Cuando se desarrolla un método nuevo Si se adquiere un equipo nuevo se necesita una transferencia de método. Cuando se le hace algún cambio significativo a un método validado. Cuando se quiere demostrar que el método propio es equivalente a uno publicado

6 Validación Las normas internacionales y las normas mexicanas de acreditación y certificación obligan a la validación de métodos. Opciones: Validación total de un método propio o nuevo: es necesario validar todos los parámetros Implementación de un método validado: Solo hay que evaluar linealidad, exactitud, repetibilidad y si aplica, límite de detección y cuantificacción.

7 Implementación de Métodos Validados Si se va a montar un método oficial, o previamente validado y publicado, solo se necesita evaluar: Linealidad Precisión (repetibilidad) Exactitud Incertidumbre de la medición Si aplica, límite de detección y cuantificación

8 Validación de Métodos La Selectividad y Especificidad es fundamental en ellos Se requiere evaluar casi todos los parámetros, puede que algunos no apliquen

9 Selectividad / Especificidad Es la habilidad del método para medir solo lo que se pretende. Debe confirmar que la medición obtenida proviene única y exclusivamente del analito, las interferencias pueden diferenciarse. Es muy común el uso de adiciones patrón (spiked samples) Si por la naturaleza de la medición el método es inherentemente específico, no se necesita evaluar (p. ej. ph) En cromatografía es necesario el uso de un segundo método, o segunda columna con selectividad diferente para demostrar especificidad.

10 Selectividad/Especificidad Que hacer Que medir Notas Analizar muestras y materiales de referencia por el método a evaluar y por otro método independiente, trazable. Confirmar que el método a validar únicamente mide el analito de interés, separado de las posibles interferencias. Planear el experimento ANTES de iniciar la validación, dependiendo del método, el analito y las interferencias. Analizar muestras conteniendo las posibles interferencias, en presencia del (los) analito (s). Investigar el efecto de cada interferencia, de haberlo, puede ser positivo o incluso negativo (quenching). Desde el desarrollo del método deben enumerarse las posibles interferencias, ANTES de iniciar la validación.

11 Ejemplo: especificidad de una cuantificación cromatográfica. 1) Blanco (matriz) sin analito 2 Matriz adicionada del analito 3) Matriz adicionada de interferencia 4) Matriz adicionada de otras interferencias (triangulo de Pascal) 5) Muestra sola 6) Muestra adicionada del analito 7) Muestra adicionada de interferencia 8) Muestra adicionada de otras interferencias

12 Selectividad/Especificidad Cromatográfica El método puede considerarse específico si: El analito solo aparece en la matriz adicionada del mismo y en las muestras La señal del analito se incrementa de la muestra sola a la muestra adicionada del mismo. Las interferencias dan picos separados del analito y no modifican su forma ni área. El uso de una segunda columna (o fase móvil en HPLC) con SELECTIVIDAD diferente confirma la identidad del analito Alternativamente, el uso de GC/MS o HPLC/MS corrobora la identidad.

13 Precisión Las mediciones tienen baja dispersión Repetibilidad Una vez fijas las condiciones de trabajo, al realizar n veces la medición de una muestra la dispersión de los resultados es aceptable. (mismas condiciones, mismo operador) Reproducibilidad (intra e inter-laboratorio) Si se cumplen las condiciones del método, se logran resultados similares, independientemente del operador, el lugar, el instrumento o los materiales.

14 Precisión La precisión se evalúa a tres niveles: Repetibilidad: El análisis repetido de una muestra, por el mismo analista, con el mismo instrumento en un lapso corto de tiempo. La mayoría de las normas aceptan valores del 2% relativo o menores. Reproducibilidad intra laboratorio: El análisis repetido de la misma muestra por diferentes analistas, con instrumentos diferentes, en diferentes días, en el mismo laboratorio, en un intervalo de tiempo amplio. La AOAC le llama ruggedness, variabilidad. Reproducibilidad ínter laboratorios: El análisis repetido de la misma muestra en laboratorios diferentes, con analistas y equipos diferentes, en un intervalo amplio de tiempo

15 Exactitud Mide la diferencia entre el valor real, o aceptado como tal, y el valor obtenido por el método propuesto

16 Exactitud Es la medida de que los resultados obtenidos son comparables con los valores aceptados de un material de referencia o estándar certificado. Si no existen materiales de referencia, es posible usar materiales propios, perfectamente caracterizados. La exactitud nos permite garantizar la ausencia de errores sistemáticos.

17 Aspectos generales: Trazabilidad La trazabilidad es importante, ya que permite la comparación de los resultados propios con los de otros laboratorios. La trazabilidad se logra: Usando estándares para la calibración del equipo (materiales de referencia, balanzas certificadas, etc.) Usando materiales de referencia puros, trazables a estándares internacionales (p. ej. NIST). Usando materiales de referencia certificados en matrices apropiadas, también trazables a estándares internacionales. Usando un método validado ya publicado. Comparando los resultados logrados contra los de un método publicado.

18 Trazabilidad Al adquirir materiales de referencia puros y/o certificados, vienen acompañados de certificado impreso, con pureza y contenidos. Si no existen materiales de referencia, se deben adquirir los de mayor pureza disponible. Si no existen en el mercado, solo entonces es posible utilizar muestras propias.

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20 Exactitud Para implementar métodos oficiales de análisis (EPA, AOAC, ASTM, USP, etc.) Usar materiales de referencia (p. ej. NIST), preferentemente uno de baja concentración y otro de alta concentración.

21 Exactitud Para métodos de uso interno: Se estudian muestras enriquecidas con un estándar puro del compuesto de interés y se demuestra que la cantidad adicionada y la medida son iguales en todo el intervalo de trabajo.

22 Linealidad Se necesita un mínimo de seis puntos de calibración MAS el blanco, espaciados uniformemente en todo el intervalo de trabajo. El factor de correlación r 2 debe ser mayor de 0.99 Es obligatorio trazar el gráfico de residuales y observar una distribución aleatoria en el. La frecuencia de re-evaluación es variable. Al desarrollar métodos es necesario evaluar el intervalo lineal y el intervalo de trabajo

23 Linealidad Linealidad del sistema La respuesta del proceso de medición es lineal en el intervalo de concentraciones requerido. Determinar intervalo lineal e intervalo de trabajo. Linealidad del método: Es la exactitud de la medición en todo el intervalo de trabajo.

24 Linealidad Intervalo lineal: Intervalo, desde el límite de detección, hasta la máximo concentración en que la respuesta del método se comporta linealmente. Intervalo de trabajo: El intervalo que se utilizará en el trabajo rutinario, las muestras estarán dentro de los límites de este y debe ser menor al intervalo lineal.

25 Linealidad, intervalos de trabajo Tipo de análisis Compuesto principal Impurezas Compuestos cuyo contenido varía Intervalo de trabajo % de la concentración de las muestras % del contenido máximo aceptable Desde 20% por debajo de la especificación mínima hasta un 20% por encima de la máxima

26 Definiciones de límites Límite de decisión (Lc) Aquella cantidad que si decimos que está presente podríamos equivocarnos, pues probablemente no esté presente. POR DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL RESULTADO ES CERO. Límite de detección (Ld) Cantidad que si decimos que no hay, podríamos equivocarnos, lo mas probable es que sí esté presente. POR ENCIMA DEL LIMITE DE DETECCIÓN ESTAMOS SEGUROS DE LA PRESENCIA DEL ANALITO. Límite de cuantificación (Lq) Cantidad que podemos reportar con una incertidumbre máxima aceptable.

27 Límite de decisión (Lc) Límite de decisión (Lc) Aquella cantidad que si decimos que está presente podríamos equivocarnos, pues probablemente no esté presente. POR DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL RESULTADO ES CERO. α L c = t n 1 α s n blanco L c

28 Límite de detección (Ld) Cantidad que si decimos que no hay, podríamos equivocarnos, lo mas probable es que sí esté presente. POR ENCIMA DEL LIMITE DE DETECCIÓN ESTAMOS SEGUROS DE LA PRESENCIA DEL ANALITO blanco α L d L d = 2t n 1 α s n

29 Límite de cuantificación La cantidad mas pequeña que podemos reportar con determinada variación máxima. L = µ ± IC q q q tal que : IC µ L q q q variacion aceptable ( E%) 100 = t E% α 2 ˆ σ n

30 Límite de detección, cálculo Diferentes opciones, dan diferentes resultados. 3 veces el nivel del ruido (α=0.04%) Estimado a partir de la curva de calibración Usando la incertidumbre de un estándar cercano al Ld (EPA, CFR). Usando la incertidumbre del blanco

31 Robustez En que medida el método analítico resiste cambios pequeños, pero deliberados de sus parámetros operacionales. Nos da información de su confiabilidad durante el uso rutinario. Nos indica como se comportará el método si no se implementan perfectamente sus condiciones experimentales. Prueba cuáles son las variables críticas del método, generalmente estas se identificaron durante el desarrollo. Si el método involucra extracciones, es obligatorio evaluar el recobro

32 Evaluación de la Robustez Procedimiento Cálculos Notas Listar variables críticas y normales. Diseñar experimentos que prueben los efectos sobre exactitud y precisión Cuantificar efectos relativos de cada variable, ordenarlas en función de la magnitud del efecto. Garantizar que en todo el experimento las variables críticas permanecen bajo control. En cromatografía es necesario probar la validez del método (Especificidad). Todos los parámetros cromatográficos Resolución > 2 Coleo < 1.8 Número de platos acorde a la técnica y dimensiones de la columna

33 Robustez, efecto de la concentración del analito Procedimiento Cálculos Notas Analizar matriz, muestras puras y enriquecidas a diferentes concentraciones, por lo menos seis veces cada una. % Recobro = (Ci C2)/ C3 x 100 C1 = concentración medida en la muestra o matriz enriquecidas. C2 = Concentración medida en la muestra, o matriz sin enriquecer. C3 = Concentración adicionada. si usa un estándar certificado, calcule el recobro en base al valor certificado. Generalmente se obtienen resultados superiores a los de muestras reales, ya que en estas últimas el analito está generalmente mas retenido por la matriz. Pueden resultar recobros mayores al 100% dada la relativa falta de exactitud y/o precisión del método

34 Incertidumbre combinada (Propagación del error) Al realizar una medición se involucran diversos pasos, cada uno de ellos tiene una determinada incertidumbre, y los errores de cada paso se van acumulando hasta afectar la incertidumbre d ela medición final.

35 Incertidumbre combinada (Propagación del error) Cuatro pasos para estimarla: 1: Definir el mesurando 2: Identificar las fuentes de incertidumbre 3: Cuantificar cada fuente de incertidumbre. 4: Calcular la incertidumbre combinada.

36 Fuentes típicas de incertidumbre Muestreo Almacenamiento Instrumentos de medición Pureza de reactivos En pruebas microbiológicas, eficiencia del medio Condiciones de medición (T, P, g, A SNM, hora, etc) Efectos de matriz Cálculos numéricos (dígitos de cálculo de ordenador y redondeo) Aproximaciones Blanco Operador Efectos aleatorios

37 Expresión del Resultado Final Reporte sus resultados junto con la incertidumbre como: Resultado ± Incertidumbre combinada con factor de cobertura unidades con un `nivel de confianza Ejemplo: Silicio, ± 0.11 mg/l al 95 % de nivel de confianza Exprese la incertidumbre combinada con máximo dos dígitos.

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