PROTOCOLOS ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1

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1 CURSO DE POSTGRADO DE MEDICINA Técnicas de Biología Celular y Molecular Utilizadas en Investigación Científica Básica y Aplicada PROTOCOLOS ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1

2 Cortar el material en trozos pequeños INCLUSIÓN EN PARAFINA Fijación Este paso permite conservar la morfología y la composición de los tejidos. Se sumergen los tejidos en solución de formol al 4 % con buffer fosfato 0.05 M (PBS) durante 6 horas, respetando la proporción recomendada de fijador/muestra (20/1). Lavar el material fijado con PBS. Hacer bolsitas de gasa, colocar los tejidos con sus identificaciones y atarlas con hilo de algodón. Deshidratación La finalidad de este paso es eliminar el agua de los tejidos. - Colocar las muestras en una serie de alcoholes de graduación creciente de la siguiente manera: Alcohol 70% 30 min. a 1 h Alcohol 90% 30 min. a 1 h Alcohol 95% 30 min. a 1 h Alcohol 100% (1) 30 min. a 1 h Alcohol 100% (2) 30 min. a 1 h (el tiempo dependerá del tamaño del material) Aclaración Consiste en embeber la pieza con una sustancia miscible con la parafina - Clarificar las muestras en dos pasajes sucesivos por Xilol o Benzol durante 30 minutos a 1 hora en cada uno de ellos. Pre-inclusión La parafina penetra en los vasos, los espacios intercelulares e intracelulares haciendo más fácil la obtención de cortes en el micrótomo. - Sumergir las bolsitas en parafina fundida y se dejan 2 horas dentro de la estufa a 60º. Inclusión - Colocar en otra parafina fundida y dejar allí aproximadamente 2 horas más. Confección del bloque - Colocar la pieza en un molde rectangular que contiene parafina fundida, con su correspondiente identificación. Corte - Enfriar el bloque y la cuchilla - Colocar en micrótomo y cortar de aproximadamente 4 o 5 µm. - Recoger los cortes con pincel de pelo de marta en una cápsula de Petri que contenga agua destilada a temperatura ambiente. - Echar agua caliente por los bordes de la placa de Petri para planchar los cortes. - Montar en portaobjetos. - Dejar secar en estufa a 50º C. COLORACIÓN CON HEMATOXILINA/EOSINA Desparafinización e hidratación Sumergir los portaobjetos en distintos frascos de siguiente forma:

3 Xilol (1) 5 minutos Xilol (2) 5 minutos Etanol Absoluto (1) 5 minutos Etanol Absoluto (2) 3 minutos Etanol 95% 3 minutos Etanol 70% 3 minutos Agua destilada 3 minutos Coloración - Colocar los portaobjetos en el frasco con hematoxilina resguardado de la luz aproximadamente un 1minuto y medio. - Retirar el exceso con agua destilada - Virar en agua corriente durante 5 minutos. - Sumergir en la eosina 30 segundos. Deshidratación y montaje - Deshidratar en serie de alcoholes de graduación creciente (70%, 90%, 95%) - Hacer dos cambios en alcohol 100% - Hacer dos cambios en Xilol. - Montar con bálsamo de canadá o entellán. ARALDITA INCLUSIÓN EN RESINAS EPOXI Cortar el material en trozos pequeños. Fijar con solución de Karnovsky modificada (Formol al 4% y Glutaraldehído al 2%) por lo menos 4 hs. Solución A: Formol al 8% Formol 25 % 32 ml. Buffer Cacodilato ph 7,3 68 ml. Solución B: Glutaraldehído al 4% Glutaraldehído 10% 40 ml. Agua destilada 60 ml. Mezclar en partes iguales solución A y B en el momento de usar. Lavar el fijador con agua destilada, dos o tres lavados. Postfijación con Osmio Embeber el material con Tetróxido de Osmio al 1 % diluido en cacodilato 2 horas a temperatura ambiente en rotor. Este paso debe hacerse bajo campana pues el Osmio es muy tóxico. Hacer rótulos para cada taco con el nombre del material, estos rótulos deben ser deshidratados juntos con la muestra. Lavar el osmio con agua destilada. Deshidratación - Colocar los materiales en frascos pequeños y sobre ellos se van haciendo cambios de acetona de graduación creciente Acetona 50% 5 minutos Acetona 75% 5 minutos Acetona 90% 10 minutos Acetona 100% 15 minutos Acetona 100% 15 minutos

4 Acetona 100% 15 minutos Las Acetonas 100% deben ser destiladas y deshidratadas sobre tamiz molecular Nº 3 (Merk). Preparación de la Araldita La mezcla está compuesta de: - Araldita 506 (48,5%) 5 ml. - Anhídrido dodecenilsuccínico(ddsa)(48,5%) 5 ml. - Diobutilftalato (DBP) (0,5%) 0,125 ml. - Acelerador dimetilaminobenceno (BDMA)(2,5%) 0, 25 ml. Infiltración con plástico-acetona - Embeber en una mezcla de partes iguales del medio de inclusión y acetona 100% y dejar en rotor 3 horas como mínimo. Pre-inclusión plástico puro - Realizar en mezcla completa de Araldita a temperatura ambiente durante 6-8 horas. Inclusión - Incluir en un molde plástico con Araldita, colocando el rotulo de cada material en la parte central. El material debe ir en la parte distal de cada taco. - Dejar el molde en estufa de 60º por 48 horas por lo menos. Corte semifino - Tallar el extremo del taco en forma de pirámide bajo lupa del ultramicrótomo. - Colocar en el porta espécimen del ultramicrótomo y ajustarlo. - Realizar cortes semifinos de aproximadamente entre 240 a 280 nm. de espesor. - Recoger los cortes con un pelo y colocarlos sobre una gota de agua destilada en un portaobjeto. - Desecar en una platina térmica para lograr la adhesión del corte al vidrio. - Colorear los cortes montados con Azul de toluidina al 1% sobre una platina a 70º C. Corte fino - Cortar los tacos con un espesor entre 90 a 120 nm. (color oro pálido). - Montar los cortes con una grilla sostenida con una pinza. - Guardar las grillas con los cortes finos en un porta-grillas. - Contrastar con Acetato de Uranilo y Citrato de Plomo. TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA PARA DETECCIÓN DE PROSTATIC BINDING PROTEIN (PBP) Desparafinización e hidratación. Bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena - Colocar una gota de H 2O 2 al 3% en metanol por 5 min. - Realizar 2 lavados con en PBS durante 5 minutos Bloqueo de uniones no específicas - Tratar los cortes con suero normal de cabra al 5% en PBS leche al 1,5%, incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. - Secar el excedente sin lavar. Incubación con anticuerpo primario

5 - En este caso se utilizará anticuerpo anti PBP. Para ello se realiza una dilución 1/6000 en PBS-BSA al 1%. - Colocar 50 µl sobre el corte y cubrir con film. - Incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda y luego toda la noche a 4º C. - Lavar bien con PBS Sistema de revelado Antisuero secundario - Se utiliza un anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado en una dilución de 1:150 en PBS - Incubar 1 hora a temperatura ambiente - Lavar bien con PBS. Sistema amplificador de señal ABC - Realizar una dilución de 1/100 en PBS - Colocar sobre el corte e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. - Lavar con PBS y luego con TRIS-HCl 0,2 M ph 7,6. Revelado - Incubar con DAB- H 2O 2 (2,5 mg. de DAB en 4 ml. de TRIS-HCl 0,2 M ph 7,6 al que se le agrega 50 µl de H 2O 2 al 3% diluido en agua destilada.) en oscuridad y hasta que aparezca la marca. - Frenar la reacción lavando con agua destilada. Contracoloración - Tratar los portaobjetos con hematoxilina durante 30 segundos. - Lavar con agua destilada - Poner los vidrios en agua corriente - Lavar con agua destilada. Deshidratación y montaje - Deshidratar los cortes en alcoholes de graduación creciente - Sumergir luego en 2 Xiloles - Agregar solución de montaje y montar con cobre-objetos. Dosaje de proteínas TÉCNICA DE WESTERN BLOT Dosar la cantidad de proteínas presentes en la muestra mediante el método de Bradford. Tratamiento de la muestra Colocar 100 µl de muestra con 20 µl de buffer muestra en un tubo eppendorff. Calentar en baño de agua a 95 ºC durante 5 minutos. Composición del buffer muestra: - SDS - ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol - azul de bromofenol - Buffer Tris-HCl ph: 6.8 (4x) Preparación de los geles de poliacrilamida

6 Las cantidades expresadas son suficientes para preparar 2 geles de 1,5 mm de espesor empleando vidrios de 8.2 cm x 10 mm (vidrio externo) y 7.2 cm x 10 cm (vidrio externo). Gel de corrida (15 %) - H2O bidestilada: ml ml Tris-HCl ph:6.8: 3.75 ml - SDS 10 %: 150 µl - acrilamida (29.2%)-bis/acrilamida (0.8 %): 5 ml - persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): µl - TEMED: µl Una vez preparado el gel se coloca entre los vidrios (hasta aprox. 5 cm de altura) y se agrega isopropanol (200 µl por gel) para una correcta polimerización. Esperar 20 minutos hasta observar la aparición de la fase gel y proceder al lavado del alcohol. Secar y preparar el stacking gel. Stacking gel (4 %) - H2O bidestilada: 6.1 ml ml Tris-HCl ph:6.8: 2.5 ml - SDS 10 %: 100 µl - acrilamida (29.2%)-bis/acrilamida (0.8 %): 1.33 ml - persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): 75 µl - TEMED: 15 µl Antes de preparar el gel colocar los peines con la cantidad de calles a sembrar (en general 10). Electroforesis Colocar los geles en la cuba electroforética y agregar buffer de corrida en cantidad necesaria. Sembrar el volumen de muestra correspondiente a la cantidad de proteínas calculada, sembrar marcador de peso molecular y aplicar una corriente constante (30 ma). Controlar el frente de corrida y detener la electroforesis antes de llegar al borde inferior del gel. Transferencia Eliminar el stacking gel y colocar los geles de corrida en el panel de transferencia entre dos papeles de filtro con la membrana de nitrocelulosa (o PVDF) de manera que quede orientada hacia el polo positivo. Cerrar el panel de transferencia y aplicar una corriente constante de 300 ma durante 60 minutos. Una vez transcurrido el lapso de tiempo programado quitar la membrana de nitrocelulosa y realizar un lavado con buffer fosfato salino (PBS). Para verificar una correcta transferencia colorear las proteínas utilizando una solución de rojo ponceau (0.3 % en acético al 1 %). Remover el colorante con lavados sucesivos empleando PBS. Inmunodetección de la proteína en estudio

7 - Bloqueo: Incubar las membranas en un recipiente adecuado durante 1h en solución de PBS-Tween 0.1 %-Leche descremada 5 % (buffer de bloqueo) a temperatura ambiente. - Incubación con anticuerpo primario: Incubar las membranas durante 2h en una dilución adecuada de anticuerpo primario en buffer de bloqueo a temperatura ambiente. - Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0.1 % durante 30 minutos (aproximadamente 5 cambios de solución de lavado). - Incubación con anticuerpo secundario: Incubar con una dilución adecuada de anticuerpo secundario acoplado a enzima (generalmente peroxidasa) diluido en buffer de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. - Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0.1 % durante 30 minutos (aproximadamente 5 cambios de solución de lavado). Revelado con quimioluminiscencia El revelado con quimioluminiscencia se lleva a cabo en un laboratorio fotográfico en oscuridad siguiendo los siguientes pasos: 1- Preparar reactivo quimioluminiscente (ECL o SuperSignal) de acuerdo a lo indicado por el fabricante. 2- Colocar reactivos de revelado fotográfico (revelador, ácido acético al 5-8 % y fijador) en recipientes adecuados. 3- Escurrir la membrana a revelar e incubar con reactivo quimioluminiscente durante 1 minuto a temperatura ambiente. 4- Colocar la membrana entre dos films transparentes dentro de la caseta de revelado. 5- Colocar placa fotosensible sobre la membrana (que se halla bajo el film transparente) y cerrar la caseta; dejar en la misma el tiempo necesario (dependiendo del antígeno a analizar) 6- Quitar la placa de revelado con cuidado y colocarla en el reactivo revelador, al observar la aparición de bandas detener la reacción con solución de ácido acético y colocar en fijador de 2 a 5 minutos. 7- Lavar la placa de revelado con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente. NOTA: Los pasos 1 a 4 se llevan a cabo con luz natural. Los pasos 5-6 con ilumincación de lámpara roja. Densitometría Sobre las bandas obtenidas (por triplicado para cada experimento) se hace un análisis densitométrico aplicando el software Scion Image. El valor obtenido corresponde a un área debajo de la curva, proporcional a la intensidad de la banda (y por lo tanto a la concentración de proteína en la muestra). Finalmente, con los datos obtenidos aplicamos un método estadístico acorde al diseño experimental ejecutado y expresamos los resultados gráficamente empleando un software apropiado (Sigma Plot o Infostat).

8 TECNICA DE CULTIVO DE CÉLULAS ADENOHIPOFISARIAS -Decapitar los animales, extraer las hipófisis y colocarlas enteras en una cápsula de petri con medio de cultivo, SMEM. Hasta 30 hipófisis por cápsula. -Trasvasar las hipófisis con pinza estéril a un vial siliconado con 5 ml. de medio SMEM. -Pasar con pinza estéril a una cápsula de petri plástica y cortar el conjunto de glándulas en varios sentidos, varias veces. -Transferir a un tubo de centrífuga con pipeta pasteur -Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min. -Agregar la tripsina con pipeta pasteur e incubar en dubnoff a 37º C durante 20 min. con agitación. -Agregar el inhibidor de tripsina e incubar en dubnoff 3 min. -Transferir a uno de los tubos de centrífuga con pasteur el material incubado con tripsina del vial. Centrifugar a 1000 rpm durante 3 min. -Decantar y agregar 5 ml. de SMEM (sin resuspender) -Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 3 min. -Dispersión mecánica con pipetas Pasteur: Aspirar y expeler con pasteur flameadas de calibre cada vez menor cinco a seis veces con cada pipeta. Transferir con la última pasteur al tubo de centrífuga con medio Dulbecco. -Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. (el sobrenadante queda turbio por lípidos) -Decantar y resuspender en SMEM, aspirar y expeler nuevamente con pipetas pasteur. Transferir al vial. -Preparar un tubo de Khan para analizar el rendimiento y la viabilidad celular: Suspensión celular...50 ul SMEM ul Trypan Blue ul -Cargar en una cámara de Neubauer una gota de la suspensión. Se cuentan los 4 campos grandes y se saca un promedio. Este número se lo multiplica por y por los mililitros de la suspensión obteniendo el Nº total de células. -Suspender las células con medio SMEM para tener una concentración final de 10 6 células/ml.

9 -Sembrar 0,5 ml. de suspensión de células en cada well de 35 mm. -Agregar 2 ml. de Dulbecco a cada well. -Cambiar el medio de cultivo a las 72 horas y luego cada 24 horas hasta finalizar los experimentos. Hipófisis anterior Dispersión mecánica tripsina 0.4% 20` 37º C Dispersión enzimática Siembra 5 x 10 5 células 2 ml Dulbecco Dispersión celular