LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA APLICADA PRÁCTICA # 2 SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE PIGMENTOS VEGETALES Y SUS ESPECTROS DE ABSORCIÓN

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1 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 25 LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA APLICADA PRÁCTICA # 2 SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE PIGMENTOS VEGETALES Y SUS ESPECTROS DE ABSORCIÓN OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: 1. Preparar una columna para cromatografía. 2. Preparar un extracto de pigmentos de plantas. 3. Separar por cromatografía en columna la mezcla de pigmentos extraídos. 4. Obtener el espectro de absorción en la zona del visible de los pigmentos extraídos. 5. Explicar los conceptos fundamentales en los que se basa la cromatografía. INFORMACION GENERAL Pigmentos de las plantas Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre llevan a cabo un proceso llamado fotosíntesis, por el cual, mediante la energía solar, transforman el bióxido de carbono en carbohidratos como la glucosa y su polímero el almidón, que son compuestos con alto contenido en energía química y, por ello, estos seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiración, en el cual se oxida hasta CO 2 y H 2 O, obteniendo así la energía necesaria para llevar a cabo sus diversas funciones. Para atrapar la energía solar e iniciar el proceso de transformación de energía luminosa a energía química, las plantas superiores contienen en sus células un organelo llamado cloroplasto, en donde se encuentran los llamados centros de reacción, formados por proteínas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las clorofilas a y b se encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias fotosintéticas. Además de estas moléculas, los organismos fotosintéticos tienen otros pigmentos con capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por ejemplo a los carotenos, xantofilas, antocianinas y otras moléculas con colores característicos.

2 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 26 La estructura de estas sustancias se muestra en la fig. 1. Fig. 1. Estructura de algunos pigmentos de plantas Estas sustancias son coloridas por el número elevado de dobles ligaduras conjugadas que poseen, lo que permite que las excite la radiación con longitud de onda en la región del visible. La clorofila absorbe bien en la región del rojo y el azul y muy poco en la zona del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes porque la luz verde se refleja, no se absorbe. Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con solventes orgánicos cuando las células que los contienen se rompen. Los extractos tienen, además de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos incoloros. Entre los tipos de pigmentos más solubles en solventes orgánicos, se encuentran las clorofilas (azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las plantas (por ejemplo en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a xantocianinas, las cuales si son solubles en agua y no se extraen con solventes orgánicos. Métodos cromatográficos Los métodos cromatográficos son métodos de separación que involucran la transferencia reversible de un compuesto que está adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase móvil (solvente) que fluye a través de la fase estacionaria.

3 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 27 La separación surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, solvente y adsorbente. El adsorbente está presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir reversiblemente pequeñas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrostático. El solvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unión. Estos componentes son desplazados reversible y continuamente en la dirección del flujo del solvente. El proceso descrito puede escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una partición de los componentes entre la fase estacionaria y la fase móvil: componentes-adsorbente solvente-adsorbente componente-solvente Entre más polar sea un compuesto, más fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su migración a lo largo de ella es menor, siendo eluído (arrastrado) más lentamente por la fase móvil, que los compuestos menos polares. De este modo, la separación selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografía, se debe a las diferencias en la migración de los componentes individuales a lo largo de la fase estacionaria. En la cromatografía en fase líquida se usa una fase móvil (líquida) y una fase estacionaria (sólida), siendo los adsorbentes más comunes la sílica gel (SiO 2.H 2 O), alúmina (A 2 O 3 ) y celulosa. La distribución de los componentes entre la fase sólida y líquida es determinada, además de por la polaridad propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado de hidratación y de la polaridad del solvente). El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la polaridad del solvente. Una lista de los solventes más usados en los diferentes tipos de cromatografía, en orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre más polar sea un solvente, más rápido es el movimiento de los compuestos y menos efectiva la separación. Menos polar Más polar Hexano Tolueno Cloruro de metileno Cloroformo Éter Acetato de etilo Acetona Propanol Etanol Metanol Agua Ácido acético Tabla 1. Disolventes comunes para cromatografía de líquidos Cromatografía en columna La cromatografía en una columna de adsorbente proporciona un medio para la separación y aislamiento de los componentes de una mezcla. La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se deja pasar solvente a través del adsorbente. Este proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los compuestos individuales; estas bandas pueden ser eluídas (arrastradas) en secuencia por adición de más solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla usando el solvente menos

4 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 28 polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad práctica. Generalmente es necesario ir cambiando a solventes más polares para efectuar la elusión de los compuestos, dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eluído más rápidamente, dependerá de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2. El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas (separadas). Las sustancias demasiado polares, como azúcares o aminoácidos, no pueden separarse de sus mezclas por cromatografía en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua o ácido acético porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ahí al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los componentes de la mezcla se eluyen simultáneamente. VELOCIDAD menos polar más polar RAPIDEZ DE ELUSIÓN más rápido más lento GRUPO FUNCIONAL alcanos halogenuros de alquilo alquenos dienos hidrocarburos aromáticos halogenuros aromáticos éteres ésteres cetonas aldehídos aminas alcoholes fenoles ácidos carboxílicos ácidos sulfónicos Tabla 2. Velocidades relativas de elución para diferentes grupos funcionales En la práctica, los pasos de desarrollo y elusión frecuentemente son distinguibles, ya que la banda que se mueva más rápido puede empezar a emerger de la columna antes de que se complete la separación de las bandas que se mueven más lentamente. Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse las bandas. En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeño. se evapora el solvente y los residuos se comparan por cromatografía en placa delgada para determinar cuáles fracciones tienen igual composición y pueden ser reunidas. La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapón de algodón o lana de vidrio cubierto con una capa de arena para retener partículas finas. La relación usual de diámetro de la columna a altura del adsorbente es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la columna para permitir que haya solvente arriba del adsorbente. Si el tubo tiene un diámetro de 1 cm o mayor, se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se añade el adsorbente, ya sea seco, dejándolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendiéndolo en un vaso de precipitados con el mismo solvente y añadiendo la suspensión a la columna. Mientras se añade el adsorbente, debe mantenerse entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un diámetro menor a 1 cm (como las usadas en técnicas de microescala, en las que se puede usar una pipeta

5 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 29 Pasteur como columna)) no se pone solvente y el adsorbente se añade en seco. En cualquiera de los casos, la columna debe ser compacta y uniforme; una columna no uniforme, en la que haya capas disparejas de adsorbente, cuarteaduras o burbujas, no es utilizable. Arriba del adsorbente se coloca una pequeña capa de arena para prevenir que la parte superior del adsorbente sea alternada. El exceso de solvente es drenado de la columna, justo hasta arriba del adsorbente y entonces se añade, usando una pipeta Pasteur, la muestra disuelta en un volumen mínimo de solvente. La muestra debe adsorberse en la zona más angosta posible, ya que las bandas se vuelven más difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo un cromatograma es importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente para prevenir la formación de cuarteaduras en el adsorbente. Las mezclas complejas de pigmentos de plantas presentan un gran problema de separación. Generalmente la separación completa de todos los pigmentos de un extracto no se logra en un solo cromatograma; por ejemplo, las diferentes clorofilas pueden separarse utilizando azúcar pulverizada como adsorbente pero la separación de carotenos, menos polares, requieren de un adsorbente más activo. Esta separación fina no se llevará a cabo en esta práctica. En las condiciones de separación usadas en esta práctica ocurren algunos cambios en los pigmentos más sensibles durante la extracción y cromatografía, lográndose únicamente una separación parcial; además, los compuestos incoloros se detectarían en el residuo si se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizará la pureza de las fracciones para comprobar que la separación fue completa; sin embargo, los principios del método si podrán ser observados. Los resultados de esta cromatografía dependerán de variables como la fuente de los pigmentos, la eficiencia de la extracción, la actividad de la alúmina utilizada como adsorbente, las dimensiones de la columna, los volúmenes de cada solvente y las mezclas de cada solvente utilizadas en el desarrollo. Cambios muy pequeños en algunos de estos factores pueden afectar la separación e incluso causar cambios en las posiciones individuales de los pigmentos en el cromatograma. Ya que es imposible especificar todas estas variables, no importa que tan detallado sea el procedimiento indicado para llevar a cabo el cromatograma, no en todos los casos se obtendrán resultados óptimos. En el procedimiento dado en la parte experimental, se sugiere una secuencia general de cambio de solventes y recolección de fracciones pero los detalles dependerán del cromatograma individual. El principal objetivo es obtener tantos pigmentos individuales como sea posible en tubos de ensaye separados. Espectroscopía de absorción La espectroscopía de absorción es la medición de la cantidad de radiación que absorbe un compuesto como función de la longitud de onda de la radiación que incide sobre ella. En general, se irradia una muestra con una fuente de radiación y se mide con un detector la cantidad de radiación transmitida a diversas longitudes de onda. Las principales técnicas espectroscópicas (y otras relacionadas), que constituyen herramientas poderosas para la elucidación de estructuras en química orgánica son las siguientes: - Espectroscopía de infrarrojo, que observa las vibraciones de los enlaces y da evidencia acerca de los grupos funcionales presentes en una molécula. - Espectroscopía de ultravioleta-visible, que observa las transiciones electrónicas y da información acerca de los electrones, especialmente de los no compartidos y de los sistemas de enlaces múltiples en la muestra.

6 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna Espectroscopía de resonancia magnética nuclear, que da información sobre el entorno de todos los átomos de hidrógeno de la molécula en estudio y, por lo tanto, sobre la estructura de la cadena alifática y/o aromática y sobre los grupos funcionales cercanos a los hidrógenos. - Espectrometría de masas, técnica en la que se bombardean las moléculas con electrones para romperlas. El análisis de las masas de los fragmentos obtenidos da información sobre el peso molecular, los heteroátomos y los grupos funcionales presentes en la molécula original. El espectro electromagnético incluye todas las posibles frecuencias, desde cero hasta infinito. En la práctica, el espectro abarca desde frecuencias muy bajas, como las de radio utilizadas para la comunicación con submarinos, hasta frecuencias muy altas, como las de los rayos gama. La Tabla 3 muestra la frecuencia, la longitud de onda y las relaciones de energía de las diversas zonas del espectro electromagnético. mayor frecuencia menor longitud de onda longitud de onda región del espectro energía por mol m rayos gama 10 6 kcal efectos moleculares 10-8 m rayos X 10 4 kcal ionización Ultravioleta 10 2 kcal lejano Ultravioleta cercano transiciones electrónicas 10-6 m Visible 10 kcal color 10-4 m Infrarrojo 1 kcal vibraciones moleculares 10-2 m Microondas 10-4 kcal movimiento rotacional 10 0 m 10 2 m Radio 10-6 kcal transiciones en el spin del electrón Tabla 3. Espectro electromagnético El espectro electromagnético es continuo y la posición exacta de la división entre cada región es más o menos arbitraria. En la parte superior se encuentran las frecuencias más altas y, por lo tanto, longitudes de onda más cortas y mayor energía. En la parte inferior se encuentran las frecuencias menores y, por lo tanto, longitudes de onda mayores y menor energía. Las moléculas orgánicas sufren diferentes efectos de acuerdo a la energía de la radiación que incide sobre ellas: Si se utilizan ondas de radio de baja frecuencia, se puede modificar el spin de los electrones, en especial el del hidrógeno, lo que aprovecha la técnica de NMR. La energía en la región de las microondas permite la rotación de las moléculas. En la región del infrarrojo hay vibración de los enlaces entre los átomos de una molécula. En el ultravioleta los electrones se excitan y pasan a niveles de energía más altos dentro de las moléculas. Los rayos X tienen tanta energía que excitan los electrones por encima de los niveles de energía del enlace y permiten la ionización de la molécula.

7 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 31 En la práctica # 1 se puede utilizar la espectroscopía de infrarrojo para determinar la presencia de los grupos funcionales en una muestra problema. En esta ocasión, utilizaremos la espectroscopía de ultravioleta-visible, únicamente en la región de visible, para determinar las longitudes de onda de absorción de algunos de los pigmentos de plantas, que fueron separados por cromatografía en columna. Posteriormente se verificarán los resultados con los datos reportados en la literatura. Espectroscopía en la región del ultravioleta-visible La excitación de los electrones de una molécula orgánica puede requerir desde 40 a 300 kcal/mol. Las longitudes de onda correspondientes a estas energías abarcan la región del visible ( nm), el ultravioleta cercano ( nm) y el ultravioleta lejano ( nm). La información más útil se obtiene de los electrones π y los pares de electrones no compartidos, pues estos enlaces son más débiles y requieren menos energía (y mayor longitud de onda) para pasar del estado basal al estado excitado. En especial en los alquenos, el fotón absorbido corresponde a la energía requerida para la transición π π*. A estos grupos que facilitan la absorción de energía para la transición electrónica se les llama cromóforos. Si el alqueno está conjugado, y entre mayor sea el número de dobles enlaces conjugados, la energía requerida para llevar a cabo esta transición disminuye (y la longitud de onda aumenta), como puede observarse en la siguiente tabla: nombre estructura (nm) etileno CH 2 =CH ,3-butadieno CH 2 =CH-CH=CH ,3,5-hexatrieno CH 2 =CH-CH=CH-CH=CH ,3,5,7-octatetraeno CH 2 =CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH Si el cromóforo se sigue extendiendo, la longitud de onda de la transición π π* se desplaza a la zona del visible, en donde se da el máximo de absorción (λ max ). En esa situación, la sustancia tendrá color. Ya que la longitud de onda absorbida estará en la zona azul del espectro, el compuesto se verá amarillo. El color cambiará a rojo cuando la energía del fotón requerido para excitar a la molécula sea todavía menor. La transición π π* se observa abajo de 190 nm. En el caso de los compuestos que tienen el cromóforo carbonilo: >C=O, éste también absorbe radiación en la región del ultravioleta., Sin embargo, el carbonilo contiene un átomo de oxígeno con pares de electrones no compartidos que se encuentran en el estado basal n y que pueden ser excitados al orbital π*. La energía necesaria para esta transición n π* es menor que la del alqueno y la absorción se encuentra en la región del UV cercano (270 nm para la acetona). La λ max que presenta un cromóforo en particular es muy sensible a los cambios estructurales en el sistema π, es decir, al grado de sustitución que tengan las dobles ligaduras, a la presencia de anillos aromáticos, de heteroátomos, etc. Es posible calcular la λ max de un compuesto en especial siguiendo las reglas de Woodward-Fieser. Refiriéndonos específicamente al caso de esta práctica, si se observa la estructura de los carotenos (de color naranja) se verá que son polienos conjugados. En las clorofilas (de color verde o azul-verde), el cromóforo es más complejo, pero básicamente también corresponde a un sistema poliénico altamente conjugado, con pares de electrones no compartidos en los átomos de nitrógeno (ver la Fig. 1). A continuación se incluyen los espectros de visible-uv de los pigmentos aislados en dos cromatografías de extractos de espinaca. Los espectros de la primera cromatografía se reunieron en tres fracciones: 1) de polaridad baja, 2) de polaridad intermedia y 3) de polaridad alta. Los espectros de la segunda cromatografía en cuatro fracciones.

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9 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 33 ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA DE LAS FRACCIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DE PIGMENTOS DE PLANTAS Tubo 2. Fracción de menor polaridad, de color amarillo, eluída con hexano. Tubo 3. Fracción de polaridad baja, de color verde, eluída con cloruro de metileno.

10 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 34 Tubo 4. Fracción de polaridad media, de color amarillo, eluída con acetato de etilo. Tubo 5. Fracción de polaridad alta, de color verde, eluída con metanol.

11 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 35 Nombres: Equipo: Grupo: TÉCNICA EN MICROESCALA: PREGUNTAS PARALELAS: a) Preparación de la muestra de pigmentos: Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas pequeñas y colócalas en un mortero con media cucharadita de arena y 3 ml de metanol. Muele con la mano del mortero hasta obtener una papilla, añade 6 ml de hexano y muele otra vez. Para qué sirve la arena en la molienda? Por qué se extrae primero con metanol y luego con hexano? Con una pipeta Beral pasa el líquido a un embudo de separación chico, a través de un embudo de vidrio con un pedacito de algodón del tamaño de un chícharo. Trata de dejar el sólido en el mortero. Repite la molienda con otros 6 ml de hexano y reúnelos con el primer extracto en el embudo de separación. Añade 10 ml de agua de la llave a la solución de hexano, tapa el embudo y agita. Deja separar las fases y remueve la capa acuosa inferior, poniéndola en un vaso de precipitados. Para qué se extrae con agua? Porqué es mejor que sea de la llave y no destilada? Repite el lavado del hexano con una segunda porción de 10 ml de agua de la llave. Tapa, agita y deja separar muy bien las fases. Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo más posible toda el agua. Reúne esta segunda fase acuosa con la primera, para posteriormente deséchelas al drenaje. A partir de este momento, todo el material debe de estar bien seco. Lávalo sólo si es necesario. Para secarlo, escurre bien el agua, enjuaga con una cantidad pequeña de acetona, que puedes usar para varias piezas, escurre nuevamente y termina de secar la pieza con vacío. Transfiere la solución de hexano a un matraz Erlenmeyer de 25 ml. Añade a este matraz suficiente sulfato de sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5 minutos agitando de vez en cuando. Si no queda polvo fino de sulfato anhidro, añade un poco más del sufato y deja reposar otros 5 min. Qué contiene este extracto y por qué puede desecharse al drenaje? Cómo afecta el agua a la cromatografía? Si ya se separó el agua, por qué se necesita el sulfato de sodio anhidro? Con una pipeta Pasteur pasa la solución colorida a otro matraz Erlenmeyer de 25 ml. Enjuaga el sulfato de

12 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 36 sodio con porciones de ml de hexano. y con la pipeta reúnelas al matraz con la solución de los pigmentos. Marca el matraz con tu número de equipo, ponle unas tres piedras de ebullición y evapora la solución, en una parrilla en la campana, a un volumen aproximado de 2-3 ml. Ten cuidado de no evaporar todo el solvente para evitar la descomposición de los pigmentos. Qué pasaría si se omiten las piedras? b) Preparación de la columna de cromatografía: Prepara la columna en una columna pequeña con llave. Si no dispones de estas columnas, puedes usar una pipeta Pasteur corta, adáptale en la punta un tubo capilar de plástico obtenido de una pipeta Beral; esto te permite tener un tamaño de gota muy pequeño y también, si es necesario, detener el flujo de la columna. En la parte superior de la pipeta enrolla una liga, para poder sostener la pipeta con una pinza, sin que se resbale. Con la ayuda de un alambre de cobre, coloca un pedacito de algodón, que no debe estar apretado, en la parte donde la columna se angosta. Cubre el algodón con una capa de arena de 3-4 mm de altura. Golpea ligeramente la columna para que la superficie de la arena esté bien horizontal. Añade en seco el adsorbente para cromatografía a la columna, de preferencia sílica gel (también puede ser alúmina pero no es tan conveniente). Deja caer el adsorbente dentro de la columna como un chorro muy fino. La altura del adsorbente en la columna debe ser de unos cm (si es un pipeta de 6 a 8 cm) dejando espacio adicional en la columna para permitir que haya suficiente solvente arriba del adsorbente. Golpea muy ligeramente la columna, para que el adsorbente quede uniforme y su superficie horizontal. Evita golpearla mucho para que no se compacte demasiado. Arriba del adsorbente coloca una pequeña capa de arena, de 3 a 4 mm de altura. Para qué sirve la arena en la parte inferior de la columna? Por qué es importante que el adsorbente esté horizontal y que no tenga ni estratos más compactos, ni grietas, ni burbujas? Para qué sirve la arena en la parte superior de la columna? Sujeta con una pinza la columna ya preparada en un soporte, a una altura adecuada para que puedas recoger las fracciones en tubos de ensaye sostenidos en una gradilla o un vaso y cambiar estos tubos con facilidad. c) Cromatografía: Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8 mm, marcándolos con masking tape. Acomódalos en una gradilla.

13 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 37 Con una pipeta Pasteur añade a la columna de cromatografía parte del extracto en hexano de los pigmentos de espinaca. Como la cantidad de adsorbente en la columna es pequeña, añade sólo una pipeta del extracto. Qué pasa si usas todo el extracto o si el extracto está en un volumen grande de solvente? La muestra debe adsorberse en una zona de la columna lo más angosta posible, ya que las bandas se vuelven más difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo una cromatografía es importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente. Por qué es importante que el solvente no baje de la arena? Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior de la columna con cantidades muy pequeñas de hexano hasta que todo el pigmento haya entrado en la columna. Continúa añadiendo porciones de 2-3 ml del hexano y anota todos los cambios en la apariencia de la columna. Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos separados en los tubos de ensaye numerados. Por qué se separan en bandas los componentes de la mezcla, en vez de bajar todos juntos? Cambia de tubo cuando esté lleno hasta dos terceras partes o antes, si notas un cambio de coloración en el eluyente. Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una velocidad apreciable, continúa añadiendo porciones del mismo solvente, no importa cual sea el volumen utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo eluyente. Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empieza a usar como eluyente el solvente puro o la mezcla de la siguiente polaridad y continúa con el mismo solvente hasta que nuevamente ya no haya cambios. Continúa eluyendo los pigmentos con solventes y mezclas de solventes de polaridad creciente. El orden de solventes que debe seguirse, para esta práctica es el siguiente: Hexano, Hexano con 10% de cloruro de metileno, Cloruro de metileno puro, Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo, acetato de etilo puro, acetato de etilo con 10% de metanol, metanol puro. Cómo notarías si una columna no estuvo bien preparada? Por qué todos los solventes deben de estar bien secos? Por qué es necesario hacer los cambios de polaridad tan paulatinamente?

14 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 38 Cuando se tienen mezclas muy complejas pueden utilizarse, además de éstos, otros disolventes y hacer los cambios aun más paulatinamente, por ejemplo pueden usarse secuencias de mezclas de 5%, 10% y 20%. Ve anotando tus resultados en la tabla: los colores de las fracciones recolectadas, el solvente con el que se eluyó cada una de ellas y el volumen aproximado de cada fracción. Al terminar la cromatografía, observa los tubos y en base a los colores determina cuales de ellos corresponden al mismo pigmento. Anótalo en la tabla asignándole el mismo número de compuesto a las fracciones iguales. De acuerdo con las profesoras, reúne en los matraces que se te indique el contenido de los tubos que correspondan al mismo pigmento. Esto debe hacerse con especial cuidado para no volver a mezclar los diferentes componentes ya separados. Qué pasaría si los cambios se hicieran solamente con solventes puros sin usar mezclas? Cuántos componentes diferentes puedes apreciar que se separaron? Cuántas clorofilas y cuantos carotenos se separaron? Cuál fue la secuencia de clorofilas y de carotenos de menor a mayor polaridad? Al terminar la práctica, las maestras se encargarán de evaporar en la campana el solvente de cada uno de los componentes, hasta un volumen pequeño y con estas muestras se obtendrán los espectros de ultravioleta visible de cada una de los pigmentos separados. Para en análisis de resultados se usarán los espectros obtenidos en semestres anteriores, que ya fueron incluidos en el instructivo.

15 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna. 39 HOJA DE RESULTADOS Nombres de los integrantes del equipo: # de equipo: Grupo: 1. TABLA DE RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA: Número de la fracción Solvente Color e intensidad del color de la fracción Volumen aproximado de la fracción Clase y número del compuesto separado (clorofila 1, 2 o caroteno 1, 2 ) 2. TABLA DE RESULTADOS DE LOS ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE Anota las λ max, de mayor a menor, en los espectros de las páginas del instructivo. Fracción λ max 1 λ max 2 λ max 3 λ max 4 λ max 5 λ max 6 λ max 7 λ max 8 Cromatografía 1 1. polaridad baja 2. polaridad media 3. polaridad alta Cromatografía 2 1. polaridad baja 2. polaridad media baja 2. polaridad media alta 3. polaridad alta PREGUNTAS DE PRELABORATORIO 1. El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta, explique porqué la extracción de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al hexano. Sería conveniente extraer directamente con hexano? 2. Cuál sería el efecto en los resultados de la cromatografía en columna si ocurriera alguno de los siguientes errores: a) Al añadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente. b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta. c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la cromatografía.

16 Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Práctica 2. Cromatografía en columna Diga cuáles son algunas de las aplicaciones más importantes de la cromatografía en columna. 4. Qué información, en general, nos da el espectro de absorción en UV de un compuesto y para qué sirve esta información? 5. Responda a la pregunta de la página 712 del capítulo 15 del libro Química Orgánica de Wade. (La copia de la información necesaria está incluida en el manual de este laboratorio). PREGUNTAS DE POST LABORATORIO: 1. El extracto de las plantas, además de pigmentos contiene compuestos incoloros. Explique qué haría para detectar estos compuestos y tener una buena separación entre estos compuestos y los pigmentos. 2. En un cromatograma de un extracto de hojas verdes, se separaron cuatro bandas coloridas en la siguiente secuencia: 1:amarillo-naranja, 2:verde, 3:amarilla, 4: verde. Asumiendo que estas bandas corresponden a los dos carotenos y a las dos clorofilas cuya estructura se da en este instructivo, indique cuál compuesto corresponde a cada una de las bandas 1 a 4 y explique su respuesta. 3. Cree que la cromatografía que hizo podría optimizarse? Cómo? 4. Existen otros tipos de cromatografía en las que también se utilizan columnas: a) la cromatografía de intercambio iónico; b) la cromatografía de gases; c) la cromatografía de líquidos de alta presión. Diga cuáles son las principales características, las diferencias entre ellas y las aplicaciones de estas técnicas. 5. Busque en el Merk Index u otro manual las λ max de los α- y β-carotenos y de las los α- y β-clorofilas. 6. Qué información dan los datos espectroscópicos de los componentes separados en esta cromatografía? Compara los datos experimentales de la tabla 2 con los valores reportados (pregunta 5)? Qué conclusiones pueden sacarse de esta información respecto a la identidad y pureza de los compuestos separados? REPORTE 1. Entrega la HOJA DE RESULTADOS con la información obtenida en la práctica. 2. Conclusiones de los datos obtenidos en la hoja de reporte. 3. Responde a las preguntas de postlaboratorio. BIBLIOGRAFIA Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach, 2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, pp y UV Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, pp Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed., Heath and Company, USA, pp Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, pp