UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA CIENCIAS DE LA SALUD LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR PRÁCTICA 5: MICROSCOPÍA / DIVERSIDAD CELULAR I Introducción La microscopia es una de las herramientas que utiliza la biología celular para la realización de múltiples investigaciones. Esta es una herramienta muy importante puesto que sin ella, el descubrimiento de muchas células no habría sido posible. El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Este instrumento óptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. Es un elemento esencial para los estudios generales de histología puesto que es el que nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos El microscopio compuesto consta de dos lentes llamados objetivo y ocular. El primero recoge la luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que forma la imagen que observamos. El objetivo es un sistema de focal pequeña que forma una imagen real e invertida del objeto próxima al foco del ocular. Éste se encarga de formar una imagen virtual de la anterior ampliada y situada en un punto en el que el ojo tenga fácil acomodación (a 25cm o más). Dada la reducida dimensión del objeto, se hace imperioso el recolectar la mayor cantidad de luz del mismo, utilizando sistemas de concentración de la energía luminosa sobre el objeto y diseñando sistemas que aprovechen al máximo la luz procedente del objeto. El microscopio está compuesto por varias partes (Fig.1): Oculares: Son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos. Todos los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los microscopios actuales se les llama binoculares. Las magnificaciones de los objetivos más usados suelen ser de 10x, 20x, 40x y 100x. Platina: Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con la muestra. Condensador: Es un dispositivo que contiene una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de la muestra.

2 Diafragma: Se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste de la muestra y la profundidad de campo, es decir el espesor de la muestra que está enfocado. Lámpara luminosa: Es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de la muestra. Tornillos macrométrico y micrométrico: El enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de la muestra a la lente del objetivo. La primera permite movimientos ascendentes y descendentes amplios de la platina y la segunda ajustes finos. Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular,etc. Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. Objetivos: - Conocer las partes del microscopio y el manejo del mismo. - Reconocer las formas celulares del reino Fungi. - Observar y comparar células del dominio Eubacteria. Material: Reactivos: Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Piceta con agua Asa bacteriológica Mechero Bunsen Azul de metileno Kit de tinción Gram Aceite de inmersión

3 Metodología: - USO DE MICROSCOPIO o Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. o Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. o Comenzar la observación con el objetivo de 4x o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Para realizar el enfoque: a) Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b) Mirando, ahora sí, a través de los oculares, separe lentamente el objetivo de la preparación con el tornillo macrométrico y, cuando se observe nítida la muestra, girar el tornillo micrométrico hasta obtener un enfoque fino. c) Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele sersuficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso a. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. Empleo del objetivo de inmersión (100x) a) Bajar totalmente la platina. b) Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que colocar el aceite de inmersión. c) Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a la mitad entre éste y el de x40. d) Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e) Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

4 f) Observando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g) Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h) Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación. i) Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j) Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x esté perfectamente limpio. - EUBACTERIA Obtención: o Utilizando técnica aséptica, tome una muestra de cultivo bacteriano y colóquela sobre un portaobjetos. o Fije la muestra pasándola brevemente sobre la llama del mechero o utilizando Citospray. Tinción de Gram: o Agregue Cristal violeta a la muestra hasta cubrirla y deje actuar por 1 minuto. o Enjuague la muestra con agua destilada gentilmente por hasta 5 segundos. o Agregue Yodo Gram hasta cubrir la muestra y deje actuar 1 minuto. o Enjuague gentilmente la muestra con alcohol por hasta 3 segundos, seguido de un enjuague con agua destilada. o Agregue Safranina y deje actuar por 1 minuto. o Enjuague gentilmente con agua destilada. Observación: o Siga las indicaciones contenidas en la sección sobre uso de microscopio.

5 - FUNGI o Utilizando técnica aséptica transfiera una muestra de cultivo fúngico y colóquela sobre una gota de azul de metileno, previamente colocada en un portaobjetos. o Monte el cubreobjetos y observe siguiendo las indicaciones. Preguntas: 1.- Qué es refracción y para qué sirve el aceite de inmersión? 2.- Cómo se calcula el aumento total de una muestra observada con cada objetivo? 3.- Dibuja y explica la composición molecular y organización estructural de las paredes celulares en organismos Gram positivos y Gram negativos. Explica brevemente la relación entre la pared celular y la diferencia en el resultado de la tinción Gram. 4.- Investiga 3 organismos patógenos de cada uno de los siguientes grupos: Dominio Eubacteria y Reino Fungi. Elabora una tabla que contenga el nombre científico, explique la enfermedad que causa y los síntomas que pueden presentar los contagiados. 5.- Elabora una tabla donde describas las diferencias entre las distintas presentaciones que tienen los hongos, como sus estructuras reproductoras o su micelio vegetativo.