BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR UNIDAD N 2: Marcadores Moleculares de ADN

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María Jesús Castro Escobar
hace 6 años
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1 BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR UNIDAD N 2: Marcadores Moleculares de ADN Lic. Gustavo Bich Dra. María Mercedes Tiscornia. Cátedra de Biotecnología Molecular INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MISIONES MARÍA EBE RECA

2 Unidad 2: Genómica Replicación del ADN. Genoma de células procariotas y eucariotas. Organización del genoma eucariota y procariota. Estructura génica. Marcadores Moleculares. Polimorfismos. Reacción en Cadena de la Polimerasa. Taller: Reacción en cadena de la polimerasa. Marcadores moleculares: Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción.

3 Dogma central de la biología molecular

División celular para la formación de células haploides Los cromosomas fueron descubiertos en 1.842. En 1.

4 División celular para la formación de células haploides Los cromosomas fueron descubiertos en En 1.902, Walter Sutton y Theodor Boveri, de forma independiente, relacionan estas leyes con los movimientos que los cromosomas experimentan durante la meiosis; nace de esta forma la teoría cromosómica de la herencia, que señala que los genes están situados sobre los cromosomas y ordenados de forma lineal.

5 El DNA contiene toda la información de un individuo Cómo se transmite esta información de célula a célula? REPLICACIÓN

6 Características SEMICONSERVADOR ORIGEN SECUENCIAL SIMULTÁNEA BIDIRECCIONAL SEMIDISCONTINUO

7 SEMICONSERVADOR Hebra nueva Hebra molde Hebra nueva

8 14 N-DNA 14 N 15 N-DNA 15 N-DNA

9 Semiconservativa Dispersa Conservativa

10 ORIGEN OriC Monofocal (procariotas) Multifocal (eucariotas)

11 SIMULTÁNEA Y SECUENCIAL Griffiths et al.: An introduction of genetic analysis. W. H. Freeman and Company,

12 BIDIRECCIONAL

13 SEMIDISCONTINUA Lodish et al.: Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company,

14 Sintetizan: DNA ó RNA Polimerasas Molde: DNA ó RNA sintetizan en dirección - DNA polimerasa dirigida por DNA: replicación DNA polimerasa dirigida por RNA: transcriptasa invers RNA polimerasa dirigida por DNA: transcripción RNA polimerasa dirigida por RNA: replicación de virus DNA Polimerasa dirigida por DNA Molde Cofactores Sustratos Cebador 5 exonucleasa (- ) Actividad catalítica - polimerasa exonucleasa (- )

15 Fragmentos de Okazaki Fragmentos de Okazaki DNA polimerasa a partir de un cebador sintetiza en dirección -

16 DNA polimerasas eucariotas α δ ε β γ Helicasa

17 TERMINACIÓN FEN1 + RNasa H1 DNA polimerasa δ/ε DNA ligasa I

18 TELÓMEROS Telomerasa DNA polimerasa α, δ, ε

19 Genomas Procariotas y Eucariotas. Conceptos referidos a marcadores moleculares.

20 Genoma procariota y eucariota

21 Genoma Nuclear 20% 80% Genes y secuencias relacionadas ADN no codificante 10% 90% ADN codificante ADN asociado a genes 30% 10% 60% Secuencias altamente repetitivas Secuencias moderadamente repetitivas ADN de copia única En Tandem ADN satélite, minisatélite y microsatélite Intercaladas Secuencias SINE y LINE

22 Genotipo y Fenotipo Genotipo: es la constitución genética de un individuo ya sea referida a uno solo, a varios o a todos los caracteres diferenciales. Fenotipo: es la manifestación externa o aparente del genotipo.

23 Ubicación física en el Genoma En términos de genética mendeliana se define locus como la posición de un gen sobre el mapa genético. Los genes alélicos están situados en loci idénticos en estructuras de ligamientos homólogas (los cromosomas). Desde el punto de vista molecular un gen es un segmento de ADN que contiene una determinada información genética funcional. Se podría definir locus como el segmento o par de bases de ADN que corresponde a un gen determinado o posición física en el genoma.

24 Alelo y Mutación El concepto molecular de alelo es: cualquier alternativa en la información genética contenida en un locus determinado. Molecularmente una mutación se entiende como cualquier cambio que modifica la secuencia de bases de un gen. En un sentido genéticamente funcional mutación es el cambio de un gen en su alelo.

25 Polimorfismo y mutación Cuando un alelo está en la población con frecuencia mayor al 1 % se denomina polimorfismos genético. También puede definirse como la aparición de 2 o más fenotipos distintos en la misma fase de la especie. Mutación es el cambio de una características en un organismos que se presenta súbita y espontáneamente.

MARCADORES MOLECULARES (MM) MARCADOR GENÉTICO O MARCADOR MOLECULAR: es un segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede identificar.

26 MARCADORES MOLECULARES (MM) MARCADOR GENÉTICO O MARCADOR MOLECULAR: es un segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede identificar. Puede ser un gen, o alguna sección del ADN sin función conocida. Ubicamos el Marcador Molecular dentro del genoma. Relacionar características fenotípicas con perfiles genéticos (genotipos). Establecer la diversidad poblacional y la riqueza alélica (variabilidad).

27 Valor analítico de las secuencias en la población Muy variables Muy conservadas Identificación de individuos Identificación de especies Identif. de regiones únicas Identif. de mensajeros

28 Estructura del gen

29 CLASIFICACION DE MARCADORES MOLOECULARES (Modificado de Azofeifa-Delgado, 2006). Basados en ADN MINISATELITE RFLP VNTR RAPD AP-PCR AFLP STS SSR EST APS SCAR D/TGGE SSCP ITS Basados de Proteínas ISOENZIMAS ANTIGENOS

30 Biotecnología Aplicación de la ciencia y la tecnología en organismos vivos, así como en partes de los mismos, sus productos o modelos para alterar organismos vivos o materiales para la producción de conocimiento, bienes y servicios.

32 Dogma central de la biología molecular

33 Material de partida Bacterias, vegetales, animales y humanos

34 Microtubo con ovillo de DNA

35 Amplificación de secuencias de ácidos nucleicos Objetivos: Conocer la importancia de la PCR, etapas, componentes, aditivos. Estudiar problemas prácticos de la PCR. Conocer las variaciones de la PCR para su aplicación..

36 PCR Método in vitro que permite la amplificación enzimática de un segmento de ADN situado entre dos regiones de secuencia conocida. Reacción catalizada por la ADN polimerasa

37 Cómo separamos la doble cadena del ADN? Temperatura Melting es cuando la mitad de los pares de bases son desnaturalizados y la otra mitad sigue unida. Temperatura de Hibridación es cuando se une el cebador al ADN molde.

38 Para qué se utilizan los cebadores en la PCR?

41 Práctico de PCR Consideraciones para tener en cuenta en la práctica

42 1. AGUA LIBRE DE NUCLEASAS 2. BUFFER Ci * Vi = Cf * Vf 3. MgCl 2 4. dntps 5. CEBADORES SENTIDO 6. CEBADORES ANTISENTIDO 7. TAQ POLIMERASA 8. ADN MOLDE

43 Control Negativo: Tiene todos los reactivos que se necesitan para amplificar pero sin el ADN molde. Control positivo: Colocamos un ADN que sabemos que amplifica porque ya fue probado anteriormente.

44 Factores que pueden afectar a la PCR Pureza del DNA: contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. Temperatura y ph: las enzimas son muy sensibles a temperatura y ph en lo que respecta a su estabilidad y actividad. Presencia de DNAsas: Estas degradan el DNA en presencia de Mg++. Contaminantes con carga (-). ADN contaminado con otro ADN.

45 Master Mix y tubos de reacción

46 Para qué se utilizan los cebadores en la PCR?

47 Características de un buen cebador La longitud debe ser entre bases. El contenido de G:C entre 40 y 60 %. Los dos cebadores deben tener temperaturas de hibridación cercanas, dentro de los 5 C. En el extremo 3`deben tener ambos cebadores bases púricas y no repetidas. Tener en cuenta la complementariedad entre los cebadores y consigo mismos.

49 CICLADO

51 Características de Proceso Especificidad: lograr obtener banda única. Capacidad de detección: Alta (bajo límite de detección) ya que permite amplificar una única molécula de ADN. Fidelidad: capacidad de copiar secuencias con precisión sin introducir errores. Rendimiento: número de copias obtenidas al final de la reacción.

52 PROTOCOLO DE TRABAJO 1) Extracción de ADN 2) Preparación de las muestras para la reacción de PCR Buffer Magnesio ADN Cebadores dntps Taq 3) Amplificación 4) Separación, mediante electroforesis, de los productos amplificados 5) Visualización de los fragmentos obtenidos

53 Evaluación resultados BANDA INTENSA BANDA DIFUSA Ausencia de banda Productos inespecíficos. PCR ha funcionado Falta de actividad en reacción Degradación de la muestra Problemas en el ajuste de la especifidad en la reacción.

54 Soportes para visualizar el ADN Gel de Agarosa 2 % Gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%

55 PCR larga : Regiones dianas de gran tamaño. PCR anidadas : Aumento de la especificidad realizando una segunda amplificación dentro del primer fragmento amplificado. PCR inversa : Se amplifica la región externa que flanquean los cebadores. Se utiliza para regiones desconocidas. PCR asimétrica : se añaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores. Se trata de generar copias de ADN de hebra simple. PCR Touch Down: se utilizan ciclos con temperaturas de hibridación decreciencientes. RFLP-PCR: Se utiliza para el estudio de polimorfismos de nucleótido simples (SNPs). Reacción en cadena de la polimerasa Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción. ARMS-PCR: Se utiliza para el estudio de polimorfismos de nucleótido simples (SNPs). Reacción en cadena de la polimerasa Sistemas de amplificación de mutaciones refractarias.

56 PCR Digestión enzimática

58 APLICACIONES Estudios moleculares de laboratorio para investigaciones. Diagnóstico médico (patología genética hereditaria, adquirida o enfermedades infecciosas ) Medicina forense y legal Biología evolutiva Genética de la producción -Detección de la presencia de HIV, HCV - Detección enfermedades prenatales -Identificación de personas Perfilado de ADN - Análisis de tejidos preservados, restos antiguos. - Identificación de caracteres fenotípicos en animales y vegetales de producción.

59 Muchas gracias por su atención!!

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