Análisis de Proteínas por Western Blot

Transcripción

1 Página 1 1 de 10 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Fajardo Departamento de Ciencias y Tecnología Análisis de Proteínas por Western Blot Trasfondo El ensayo de enzima ligada a inmuno-absorbancia (ELISA) es un método inmunoquímico importante utilizado para la detección de niveles bajos de antígenos. Una reacción positiva en el ELISA requiere otras pruebas de corroboración. Se debe a que en ocasiones los anticuerpos pueden reaccionar con otras moléculas. Por ejemplo, es posible que un individuo posea unas moléculas IgG que no se pegan a virus específico pero que se une antígenos virales. Muchas veces de debe a epítopes comunes o similares entre dos antígenos distintos. La prueba ELISA sólo puede detectar la presencia de ciertos antígenos o anticuerpos. En el análisis por Western Blot el primer paso consiste del análisis por geles denaturantes de poliacrilamida. Esta gel separa proteínas a base de su tamaño. En la mayoría de los casos la conformación nativa de la proteína, su carga y su composición de aminoácidos no se afectan por la migración electroforética en la presencia de SDS (dodecilsulfato de sodio). SDS es un detergente que consiste de una cadena de hidrocarburos unida a un carga altamente negativa (un grupo sulfato). SDS se adhiere fuertemente a la mayoría de las proteínas y causa su desdoblamiento a una cadena larga en forma de vara. También les añade cargas netas negativas. No se rompen enlaces covalentes en el proceso. Por lo tanto, la composición de aminoácidos y secuencia de éstos se mantiene igual. Las proteínas que han perdido su patrones de doblamiento específico y actividad biológica pero que mantienen sus cadenas polipéptidas intactas se llaman denaturadas. Si las proteínas consisten de varias cadenas polipéptidas, éstas se separan con SDS. Si contienen enlaces bisulfidos covalentes entre dos cisteínas de cadenas distintas o en la misma cadena, los enlaces pueden romperse con agentes reductores fuertes como 2-mercaptoetanol. Durante la electroforesis las proteínas denaturadas con SDS migran hacia el polo positivo a una velocidad inversamente proporcional a su peso molecular. Las proteínas más pequeñas migran primero. El peso molecular de un desconocido puede determinarse al compararlo con unas proteínas de peso molecular conocido al concluir la electroforesis. El próximo paso en el Western Blot es la transferencia de las bandas de proteínas de la gel a una membrana cargada de nilón, nitrocelulosa o de floruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se somete a métodos inmuno-químicos. Las proteínas se absorben a la membrana por asociación hidrofóbicas. Al concluir la electroforesis, la membrana se coloca directamente sobre la gel. Se puede transferir por electroforesis

2 Página 2 2 de 10 en un aparato diseñado para esto. También puede hacerse por capilaridad o succión. Después de transferirse, las proteínas pasan a la membrana. Se puede visualizar las proteínas totales tiñiendo con tintes específicos para proteínas. Los tintes no ayudan a distinguir proteínas específicas. La detección inmunológica se realiza comenzando con amortiguadores bloqueadores que contienen detergentes y proteínas que se pegan a todos los lugares no ocupados en la membrana. La membrana se incuba en amortiguadores que contienen anticuerpos contra las proteínas musculares (actina y miosina) específicas de la membrana. Estos anticuerpos tienen ligados anticuerpos secundarios ligados covalentemente a su vez a enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de horseradish. Las membranas se lavan para eliminar el exceso de anticuerpos. Luego la membrana se incuba en una solución que contiene los sustratos de la fosfatasa o peroxidasa. Al estar en contacto con el sustrato se forman productos cromogénicos (con color). Descripción del experimento En este experimento los estudiantes utilizarán Western Blot para detectar proteínas específicas de actina y miosina en muestras de pescado. Las muestras se preparan para electroforesis hirviéndolas en una solución con SDS y 2-mercaptoetanol. Las muestras también contienen otras proteínas contaminantes. Los anticuerpos son antisueros policlonales contra proteínas seleccionadas y conjugadas con peroxidasa de horseradish (HRP) Objetivos: Al concluir el experimento los estudiantes podrán: 1. Montar, cargar y correr geles de poliacrilamida en aparatos verticales de electroforesis. 2. Denaturar proteínas. 3. Transferir proteínas separadas a una membrana. 4. Detectar proteínas por métodos inmunológicos. Antes del experimento 1. Lee el trasfondo y todas las instrucciones antes de comenzar el experimento. 2. Escribe una hipótesis que refleje el experimento y prediga los resultados del mismo en tu libreta de laboratorio. 3. Resume el procedimiento en tu libreta de laboratorio. 4. Contesta las preguntas siguientes y estúdialas para la prueba corta: a. A base de qué características se separaran las proteínas en Western Blots? b. Explica el rol del SDS en los Western Blots.

3 Página 3 3 de 10 c. Hacia qué polo migran las proteínas en una electroforesis con SDS? Por qué? d. Señala el rol del 2-mercaptoetanol en los Western Blots. e. Qué paso se realiza luego de la electroforesis? f. Cómo se detectan las proteínas específicas. Pre-evaluación 1. Evalúa tu habilidad para formular una hipótesis para este experimento utilizando una escala del 1 al 5 según se indica: Valor Significado 1 No tengo idea de dónde empezar 2 Puedo sólo señalar las variables del experimento. 3 Puedo identificar las variables del experimento pero desconozco cómo hacer inferencias o predicciones con éstas. 4 Sólo puedo señalar las variables y hacer una hipótesis en forma de pregunta. 5 Puedo formular una hipótesis que recoja las variables que considerará el experimento y unos resultados esperados. Auto preevaluación 2. Evalúa tu habilidad para trabajar con proteínas antes de empezar el experimento. Coloca una marca bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza. Pre-evaluación: Grado de Dominio de la Destreza 1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. El tiempo para realizar la tarea no me es suficiente. Suelo cometer errores continuamente. El resultado no es el esperado o no tengo resultados. 2. Aunque completo la Cargar geles de poliacrilamida Montar y correr geles de poliacrilamida en aparatos verticales de electroforesis. Destrezas Denaturar proteínas. Transferir proteínas separadas a una membrana Detectar proteínas por métodos inmunológicos.

4 Página 4 4 de 10 tarea me toma más tiempo del asignado. Cometo muchos errores y los resultados son ambiguos. 3. Realizo la tarea completa dedicándole más tiempo que los demás compañeros. Cometo algunos errores pero los resultados son más o menos aceptables. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la tarea. Medidas de seguridad Siempre debes utilizar guantes y protectores de ojos cuando trabajas con reactivos químicos. También debes utilizar rutinariamente tu bata de laboratorio y zapatos cerrados al frente. Utilizar guantes y gafas protectoras todo el tiempo Procedimientos experimentales Electroforesis de proteínas 1. Rotule los tubos de 1.5 ml con la letra correspondiente (A, B, C, D ect) de muestra de pescado y la palabra flip flop 2. Añada 250 ul de BioRade Laemmli buffer 3. Corte un pedazo de pescado de 0.25 cm cúbicos y transfieralo a los tubos. 4. Agite el tubo dando golpecitos con el dedo en la parte inferior por 15 veces. 5. Encube por 5 munitos a temperatura ambiente. 6. Transfiera el liquido virtiendo en otro tubo con rosca (no transfiera el pescado). 7. Caliente por 5 min a 95 0 C.

5 Página 5 5 de Prepare la cámara de electroforesis de proteínas. (Mini Protean) 9. Abre el paquete de la gel con tijeras. Remueve el cassette de la gel y colócalo sobre la mesa de laboratorio con el frente hacia arriba (placa más pequeña). 10. Si tiene una cinta adhesiva en el fondo de la placa, remueve la misma. 11. Coloca la gel en la unidad de electroforesis orientada correctamente. Sigue las instrucciones del aparato. 12. Al colocar la gel la placa mas corta debe ir hacia adentro de la cámara. 13. Remueve la peinilla colocando los dedos gordos en las hendiduras y presionando hacia arriba. 14. Coloque ambas geles a la vez presionando y luego suba los pinches hacia arriba para asegurarlas. 15. Coloca el lado rojo de los pinches hacia el lado rojo de la cámara e introdúcelo. 16. Añade ~150 ml del amortiguador diluído (TGS) en la cámara asegurándose de que cubre el lado corto de la placa. Los pozos y la placa trasera deben estar sumergidos. 17. Llene toda la cámara con ~700mL de 1xTGS amortiguador de electroforesis. Hasta que llegue a las líneas de las geles en el tanque. 18. Enjuaga cada pozo con un amortiguador de electroforesis y una pipeta de transferencia. 19. Practica cargando la gel con una punta fresca de micropipeta. Toma 20 μl de solución de práctica. 20. Coloca la porción final de la punta de la pipeta bajo la superficie del amortiguador directamente sobre el pozo. La punta debe estar en ángulo y señalando hacia el pozo. Debe tocar levemente la placa trasera pero con la abertura de la punta sobre el pozo (figura 1). No metas la pipeta entre las dos placas. 21. Suelta toda la muestra presionando contínuamente sobre la pipeta. No sueltes el dedo con el que vacías la pipeta hasta que salga toda la muestra y hayas sacado la pipeta del amortiguador. Figura Antes de cargar las proteínas para el experimento debes sacar la solución de práctica del amortiguador. Esto lo puedes hacer echando amortiguador de la gel sobre los pozos hasta que se diluya totalmente. Preparación del las muestras para electroforesis Proteínas denaturadas tienden a formar agregados supermoleculares y partículas insolubles. El calentar rompe los agregados de proteínas denaturadas. 1. Toma un vaso con agua y cubierto con papel de aluminio y hierve las muestras a 95 grados por 2-5 mins. Remueve del calor. 2. Mezcla en vortex.

6 Página 6 6 de Carga las muestras mientras estén calientes. a. Carril 1 &2 vacio b. Carril 3 Carga 5 μl del kaleidoscope estándar c. de los tubos A-D 5 μl a los carriles 4-8 en orden. d. Carril 9 5 μl de actina y miosina (estándar-am) 4. Dibuja la gel en tu libreta de laboratorio e identifica las muestras en cada carril. Corriendo la gel 1. Después de cargar las muestras, ponle la tapa hasta abajo hasta los terminales de los electrodos. Coteja que el enchufe negro esté en el terminal con el punto negro. 2. Inserta el enchufe negro en el power supply polo negativo. Inserta el enchufe rojo en el lado positivo del power supply. 3. Regula el voltaje según indicado en la tabla y corre la electroforesis por el tiempo recomendado. Asegúrate que esté pasando la corriente (debes observar burbujas en los electrodos). Tiempo y voltaje Tiempo recomendado Voltios Mínimo Optimo Al concluir el tiempo apaga el aparato, desconecta la unidad y remueve la cubierta. 5. Remueve la gel del aparato y seca un poco la misma con papel toalla. 6. Pon el casete en la mesa y remueve la placa del frente (más pequeña) pasando una espátula o dedo en la parte superior cerca de los pozos para levantar la placa. a. Nota : (opcional ) Se puede cortar una parte de la gel si la prepara doble. Puede usar para lavar la gel agua de pluma tres veces por 5 minutos. b. Descarte el agua y añada 50 ml de Coomasie Blue. Tiña la gel 1 hora en shaker. c. Descarte el tinte y lave con gran volumen de agua la gel 1 h o overnight. Cambie el agua una vez. d. Deben aparecer bandas azules en la gel luego de desteñir. Deje secar y fotografíe la misma. Descarte en la bolsa apropiada. 7. Si la gel se tiñe no se puede usar para transferencia a membrana. Si desea hacer la transferencia a membrana siga los pasos a continuación. Transferencia a membrana 1. Corta con una regla la parte superior de la gel quitando los pozos. 2. Equilibre la gel en blotting buffer por 15 min en shaker. 3. Moje los dos pedazos de fibra gruesa en blotting buffer 4. Marque la gel en una esquina con el numero de su grupo. 5. Coloque la membrana al tamaño de la gel y papel de filtro grueso (blotting) en blotting buffer.

7 Página 7 7 de Preparación del sándwich (Figura 2): a. En un envase un poco mas grande que el sandwich llene hasta 1 cm de profundidad con blotting buffer. b. Coloque el sándwich con la parte negra hacia abajo c. Coloque un pedazo de fibra gruesa d. Coloque sobre esta un pedazo papel de filtro grueso y pase un rollo para sacar las burbujas e. Coloque gel libre de burbujas f. Coloque la membrana sobre la gel libre de burbujas g. Coloque sobre esta un pedazo papel de filtro grueso h. Coloque un pedazo de fibra gruesa 7. Cierre el sándwich cassette y hale el clip blanco para unir ambos extremos. 8. Coloque el sándwich cassette dentro del modulo con ambos lados negros haciendo contacto. 9. Coloque el contenedor de hielo dentro de la cámara de transferencia (Figura 2). 10. Llene con blotting buffer hasta el clip blanco. 11. Coloque la tapa con los electrodos negro con negro y rojo con rojo. Conecte al power supply y seleccione en el mismo, 20 V por 2.5 horas. (luego pase a inmunodetección) 12. Nota: Si transfiere toda la noche (12-15 hrs) puede dejarlo a temperatura ambiente o puede sacar la membrana al finalizar la transferencia en blocking solution a 4 grados (nevera) overnight. Figura 2

8 Página 8 8 de 10 Inmunodetección 1. Desmantela el montaje que hiciste. Remueve cuidadosamente la membrana de la gel con una espátula. Verifica la transferencia al ver los marcadores preteñidos en la membrana. 2. Haz un corte diagonal pequeño en el lado izquierdo de tu membrana. 3. Transfiere la membrana a una bandeja pequeña o bolsa plástica sellada que contenga 25 ml de solución de bloqueo. La membrana debe estar sumergida en la solución. Agita ocasionalmente por 15 min a 2 horas a RT en shaker a velocidad moderada. 4. Descarta la solución. Coloca la membrana en 10 ml de solución de bloqueo fresca que contenga el anticuerpo primario en una dilución. Coloca en un rotador o plataforma agitadora por min a temperatura de salón. 5. Descarta la solución y lava la membrana en 50 ml de wash buffer. 6. Descarte el buffer. 7. Incuba con 10 ml anticuerpo secundario por 5-15 min agitando a velocidad rapida. 8. Descarta la solución y lava la membrana con wash buffer. 9. Repite el lavado por 3 min en shaker en velocidad moderada. 10. Descarte el buffer. 11. Añade solución de sustrato preparada por el instructor. Coloca la membrana en 10 ml de solución de sustrato e incuba hasta que desarrolle el color aprox min. 12. Lava la membrana dos veces con agua destilada y puedes colocar una servilleta en el extremo de la membrana y luego deja secar al aire de 30 min a 1 hr. 13. Cubra con plástico. 14. Compara el tamaño de las muestras conteniendo varias concentraciones con los marcadores estándares de proteínas. 15. Toma una foto digital de la membrana teñida para tu portafolio. 16. Deja secar tu membrana sobre un papel absorbente. Después de seca cúbrela con papel plástico y colócala en tu libreta de laboratorio cinta adhesiva. Análisis de los resultados 1. Compara tus muestras con el marcador estándar. Cuál es el tamaño aproximado de la proteína? 2. A qué se deben las bandas en la parte superior? 3. Analiza tus resultados y acepta o rechaza tu hipótesis. 4. Por qué se transfieren proteínas fraccionadas por electroforesis a una membrana para la detección inmunológica? 5. Que información nos da el western blot de cada una de las muestras de pescado? 6. Las proteinas de miosina son iguales o diferentes a través de las distintas especies de pez? Como se calculan los pesos de las proteínas? 7. Explique para que se utiliza el anticuerpo secundario en el western blot.

9 Página 9 9 de 10 Post-evaluación 1. Evalúa tu habilidad para trabajar con proteínas después de realizar el experimento. Coloca una marca bajo la alternativa que mejor describe tu habilidad o dominio de la destreza. Post-evaluación: Grado de Dominio de la Destreza 1. No tengo idea de cómo realizar la tarea. El tiempo para realizar la tarea no me es suficiente. Suelo cometer errores continuamente. El resultado no es el esperado o no tengo resultados. 2. Aunque completo la tarea me toma más tiempo del asignado. Cometo muchos errores y los resultados son ambiguos. 3. Realizo la tarea completa dedicándole más tiempo que los demás compañeros. Cometo algunos errores pero los resultados son más o menos aceptables. 4. Puedo realizar la tarea esperada y en el tiempo máximo asignado. Los resultados son buenos y no suelo comentar errores. 5. Domino la tarea en un tiempo mínimo. Los resultados son excelentes. Me siento seguro(a) realizando la Cargar geles de poliacrilamida Montar y correr geles de poliacrilamida en aparatos verticales de electroforesis. Destrezas Denaturar proteínas. Transferir proteínas separadas a una membrana Detectar proteínas por métodos inmunológicos.

10 Página de 10 tarea. 2. Luego de evaluar tu desempeño en las tareas asignadas haz una reflexión sobre tus experiencias durante este laboratorio. Debes incluir lo siguiente: a. Te gustó o no te gustó y por qué. b. Destrezas que mejor dominas. c. Destrezas que necesitas mejorar. d. Destrezas previas que no dominas o condiciones como tu preparación previa al experimento, las situaciones personales o deficiencias que arrastras que no te permiten tener los resultados que esperas. 3. Establece un plan de trabajo con metas personales claras para mejorar tus ejecutorias en el laboratorio. Nota: Los procedimientos, materiales y figuras utilizadas en este experimento provienen de BioRAD Prepadado por MLG-01-15