Facultad de Química. Semestre Aplicaciones de Bioquímica y Biología Molecular

Transcripción

1 Facultad de Química Semestre Aplicaciones de Bioquímica y Biología Molecular Interacciones moleculares entre plantas y microorganismos. Diagnóstico y detección de enfermedades cuarentenarias en México Uso de técnicas moleculares Dr. Javier Plasencia de la Parra javierp@unam.mx Departamento de Bioquímica Facultad de Química UNAM Detección Molecular de Patógenos en Plantas Detección de un patógeno difícil de aislar y/o mantener en cultivo (virus, micoplasmas) Detección e identificación de un patógeno antes de la aparición de síntomas o en plantas asintomáticas. Manejo propicio de la enfermedad. Detección del patógeno en material propagativo (semillas, tubérculos, bulbos, stock) Certificación de lotes de semillas ( libre de virus ) Decisión sobre el manejo del material Medidas cuarentenarias Detección de reservorios de patógenos. Cuantificación de la biomasa del patógeno => Resistencia 1

2 Información sobre los síntomas permite ir delimitando la naturaleza del problema. Es un patógeno, un plaga o un problema abiótico? - síntomas y signos de la enfermedad - información sobre el medio ambiente y el cultivo Si se trata de un patógeno... - es hongo? - es bacteria? - es virus? - es viroide? - es fitoplasma? El primer paso: el aislamiento del agente causal 2

3 Medios diferenciales y selectivos Si se sospecha que el agente causal es una bacteria o un hongo, pero su identidad no es clara. Medios diferenciales y selectivos. Medios diferenciales: permite observar caracaterísticas particulares de la morfología colonial del patógeno. Medios selectivos: permiten el crecimiento del organismo. Medio King-B. Pseudomonas syringae presenta colonias fluorescentes. Xanthomonas campestris presenta colonias mucosas por la producción de xantanos. 3

4 Identificación de bacterias. Además de pruebas bioquímicas convencionales, se realizan pruebas in planta. Erwinia cartovora causando pudrición en papa. Pseudomonas syringae produce una reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco. Identificación de bacterias fitopatógenas Laboratory Guide for the Identification of Plant Pathogenic Bacteria 4

5 Uso de plantas indicadoras para identificar virus Ciertas especies y variedades de plantas muestran síntomas característicos al ser infectadas por un virus. La recopilación de la información permite determinar el tipo de virus. Inoculación mecánica, por insectos o a través de injertos. Pruebas de síntomas de virus en plantas indicadoras. TSWV: Tomato spotted wilt virus 5

6 Inoculación de virus usando insectos Transmisión de virus por injertos. Observación de síntomas en el injerto. 6

7 Purificación de las partículas virales a partir de tejido infectado. Precipitación con PEG. Centrifugación en gradiente de densidad. Cristalización. Cromatografía. Microscopía electrónica. Observación de cuerpos de inclusión en el tejido infectado para identificar virus Cuerpos de inclusión del virus de mosaico de la soya. Virus en cítricos Análisis por microscopía óptica. Mucha experiencia para la identificación e interpretación. 7

8 Identificación de hongos. Aislamiento en medios selectivos, semiselectivos. Obtención de un cultivo monoconidial. Crecimiento en medios de cultivo indicados: - Velocidad de crecimiento - Presencia de micelio aéreo y color de éste - Color de la parte posterior de la colonia - Color de la masa de esporas. - Tamaño de las conidias. - Forma de las conidias. - Forma de las células basales y apicales. - Forma de agrupamiento de las conidias. - Conidióforos. - Clamidoesporas. Aislamiento de Fusarium sp. en agar PCNB (pentacloronitrobenceno) Formación de picnidios en hoja de clavel. Obtención de cultivos monospóricos. Uso de claves y manuales para la identificación de hongos. 8

9 Identificación y análisis de micotoxinas Las micotoxinas son metabolitos secundarios de bajo P.M. Producidos por hongos filamentosos que crecen en granos pre y post-cosecha. Métodos tradicionales de detección: Extracción Purificación Análisis de la toxina (HPLC, TLC, GC) 9

10 Los análisis cuantitativos por ELISA se deben validar contra análisis cromatográficos: HPLC / GC-MS Se aprovechan las propiedades espectroscópicas de algunas toxinas (fluorescencia, absorción luz UV) para su detección. Se forman derivados para obtener un compuesto volátil (GC) o fluorescente (HPLC). Para muchos de los métodos de diagnóstico e identificación se requiere personal entrenado y con mucha experiencia para la: Interpretación de los síntomas Identificación de un hongo Purificación y caracterización de un virus La expresión de síntomas depende de muchos factores En cada población de patógenos hay una amplia diversidad y pueden predominar distintos genotipos que son indistinguibles morfologicamente pero que varían en: Virulencia Resistencia a fungicidas 10

11 Métodos para la detección específica y de alta sensibilidad de macromoléculas ADN Transcripción ARN Traducción PROTEINA Métodos de detección de proteínas Inmunoquímicos (serológicos) Uso de anticuerpos para detectar e identificar patógenos. Rápidos, específicos, sensibles. Los anticuerpos detectan antígenos (generalmente proteínas) que se encuentran en la superficie del patógeno. Ampliamente usados para la detección e identificación de virus. También se han desarrollado métodos para bacterias y hongos. 11

12 En la respuesta inmune humoral de mamíferos se producen anticuerpos, que son proteínas que se unen específicamente a antígenos que se detectaron como extraños Anticuerpos Estructura cuaternaria de los anticuerpos Dos cadenas ligeras (25 kda c/u; ~220 aa) Dos cadenas pesadas (55 kda c/u; ~ 440 aa) Estabilizadas por puentes disulfuro y enlaces no covalentes. 12

13 Especificidad La capacidad que tiene el sitio de unión de un anticuerpo de reaccionar con un solo determinante antigénico. La capacidad de una población de anticuerpos de reaccionar con un solo antígeno. Reacción cruzada Anti-A Ab Anti-A Ab Anti-A Ab Ag A Ag B Epitopo compartido Ag C Epitopo similar La selección del inmunogéno es fundamental en el desarrollo de un inmunoensayo Virus: Fracción enriquecida con partículas virales y libre de proteínas de la planta. RNA cdna vector de expresión Proteína recombinante Bacterias: Fracción del LPS altamente inmunogénica. Desarrollado anticuerpos policlonales/ monoclonaes específicos de especie e incluso específicos para alguna cepa particular. Hongos: Esporas y extractos de esporas, fragmentos de hifas, proteínas secretadas al medio de cultivo, preparaciones puras de proteínas. Alta reactividad cruzada entre proteínas de distintas especies y géneros de hongos y también con proteínas vegetales. 13

14 Obtención de Anticuerpos Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales (hibridomas) Despliegue de bacteriófagos Métodos para detectar la reacción Antígeno-Anticuerpo ELISA: Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay. Prueba analítica muy versátil y sensible para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos o de antígenos. Hay varios formatos de ELISA pero siempre involucra la interacción específica entre un anticuerpo y un antígeno en el que uno de estos reactivos está inmovilizado a un soporte sólido. Antígeno inmovilizado: permite medir la unión de anticuerpos específicos. Anticuerpo inmovilizado: permite la detección y cuantificación del antígeno. La reacción Ag-Ac es amplificada y visualizada usando reactivos conjugados a enzimas que, dependiendo del tipo de ensayo, puede ser el mismo anticuerpo que interacciona con el Ag o bien un anticuerpo secundario que reconoce al primer anticuerpo. Un sustrato cromogénico revela la interacción que se puede cuantificar. 14

15 Métodos para detectar la reacción Antígeno-Anticuerpo ELISA: Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay. Antígeno Inmovilizado Anticuerpo Primario, dirigido vs. el antígeno. Anticuerpo Secundario, dirigido vs. el anticuerpo 1 Las enzimas que generalmente se utilizan para marcar a los anticuerpos son: Fosfatasa alcalina o peroxidasa. Ensayos directos: el anticuerpo primario está marcado. Ensayos indirectos: el anticuerpo secundario está marcado. El formato de ELISA permite el análisis de múltiples muestras (placas 96/384 pozos) Lectura visual o análisis cuantitativo por espectrofotómetro (lectores multiplacas) 15

16 Las técnicas de ELISA tienen sensibilidad comparables a los radioinmunoensayos (RIA) Técnica Inmuno-precipitación Difusión radial Inmunofluorescencia ELISA (color) ELISA (quimiolum.) Radioinmunoensayo Sensibilidad 10 μg/ml 1 mg/ml 10 μg/ml 1 mg/ml μg/ml ng/ml ng/ml ng/ml Desarrollo de kits de diagnóstico. Factores a considerar: 1. Presencia de distintas cepas, razas y patovares. 2. Cultivos y variedades de plantas en la que crecen los patógenos. 3. Interferencia potencial de la sabia de la planta y componentes del suelo. 4. Bajos niveles del patógeno en las plantas y el suelo. Formato del ensayo. Sencillo Robusto Específico Reactivos estables Extracción a partir del tejido vegetal Ruptura del tejido con agitador mecánico Molienda de las muestras en nitrógeno líquido. 16

17 Inmunoensayos de flujo lateral (Tiras reactivas) El ensayo de flujo lateral es una técnica inmunocromatográfica en el que el fluido o extracto en el que se encuentra el analito de interés se mueve a lo largo de un soporte polimérico pasando por varias zonas donde hay moléculas inmovilizadas que se utilizan para detectar al analito. Nanopartículas: oro coloidal, latex, selenio, carbón, liposomas. Membranas: Nitrocelulosa, nylon, poliétersulfonato, polietileno, silica ImmunoStrips Muestra Anticuerpo conjugado Soporte plástico Zonas o líneas de Rx Membrana 17

18 Immunostrip Tiras reactivas Anticuerpo 1 monoclonal específico para el antígeno El Ac está unido a una partícula. Anticuerpo 2 monoclonal específico para el antígeno unido a la membrana. Anticuerpo 3 específico para el anticuerpo 1 unido a la membrana Algunas características de los inmunoensayos por tiras reactivas. Ensayo de un solo paso; no es necesario realizar lavados. Rápido y de bajo costo; se requiere un pequeño volumen de muestra. Aplicación en campo pues no se requiere infraestructura costosa. Formatos versátiles que permiten desarrollo paras detección de distintos tipos de moléculas. Vida de anaquel larga, a veces sin necesidad de refrigeración. Diseñados para pruebas individuales y no para multiensayos. 18

19 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Thermus aquaticus Taq DNA Polimerasa Great Fountain Geyser, Yellowstone. Manantial Temperatura C El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente 19

20 Reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR) Primers, cebadores o iniciadores (sinónimos) DNA polimerasas termoestables Taq pol Pfu pol Vent pol Ácido nucleico a analizar Generalmente DNA Puede ser RNA, si se añade un paso extra de transcripatasa reversa Características de los cebadores Tipos de cebadores Específicos Al azar Longitud de los cebadores Temperatura de alineamiento Especificidad Composición de nucleótidos 20

21 Se requieren varios controles en la reacción de PCR Blanco de reacción (todos los componentes, excepto DNA molde. Control para descartar contaminaciones exógenas Control Negativo Controls para determinar la especificidad de la reacción de amplificación Contiene todos los componentes de la reacción y un DNA que carece de la secuencia blanco. Control Positivo Controls de especificidad y sensibilidad Contiente todos los componentes de la reacción y DNA que contiene la secuencia blanco. 21

22 Análisis de los productos de la reacción de PCR punto final por electroforesis horizontal 104 bp PCR tiempo real o PCR cuantitativo (qpcr) La reacción de PCR es cualitativa (+/-) o estimar niveles relativos del DNA blanco, según el diseño experimental. Otro formato de la rección de PCR en el que se añade una sonda (secuencia corta de DNA) o un fluoróforo que detecta los productos de amplificación de la reacción. El desarrollo de la reacción y la síntesis de los productos se sigue en tiempo real en termocicladores equipados con detectores de fluorescencia. 22

23 MODEL Curva OF de SINGLE amplificación AMPLIFICATION por PCR, tiempo PLOT real Señal Rn Muestra Baseline Sin DNA # de ciclos Ct PCR punto final vs. PCR tiempo real Las moléculas del fluoróforo se unen en el surco menor del DNA 23

24 PCR cuantitativa (qpcr) Se establece un nivel umbral de fluorescencia según la señal y el fondo. Una vez establecido ese umbral, se determina el ciclo en el cual se observa una señal detectable por encima del umbral. Threshold fluorescence level Threshold cycles for each sample Hay varios modelos de equipos de RT- PCR icycler BioRad 5700 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems real-time LightCycler Roche real-time PCR real-time real-time hardware FluorTracker Stratagene FluorImager Molecular Dynamics 24

25 Ventajas y Limitaciones de la reacción de PCR Específica Simple, rápida, Bajado costos Sensible, amplificación a partir de cantidades bajas de DNA No es indispensable que el DNA esté integro Flexible Su alta sensibilidad la hace susceptible a contaminación Complejidad en el diseño de cebadores específicos DNA polimerasas termoestables, sensibles a inhibición por contaminantes de la muestra. 25