PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS, BAM ONLINE

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1 PRT Página 1 de 8 1. OBJETIVO Aislar Listeria monocytogenes en matrices alimentarias. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento puede aplicarse a alimentos sólidos y líquidos. 3. FUNDAMENTO El método se basa en una etapa de pre-enriquecimiento no selectivo por 4 horas a 30ºC y en una etapa de enriquecimiento con agentes selectivos, seguido por el asilamiento de Listeria monocytogenes en medios selectivos los que a su vez son altamente inhibidores para la flora acompañante, habitualmente presente en los alimentos. Esto facilita el desarrollo de colonias de Listeria en los medios de aislamiento lo que permite su posterior identificación. Las colonias aisladas de Listeria son purificadas en medios no selectivos para ser sometidas a las pruebas bioquímicas de confirmación 4. REFERENCIAS 4.1 Food Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, BAM online chapter 10, January TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Materiales Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml graduadas en 0,1 ml Placas Petri 9 cm de diámetro o desechables de 8,5 cm de diámetro Tubos de ensayo de 13x100 mm, 18x180 mm Tubos tapa rosca de 13x100 mm, 16x160 mm, 18x180 mm, 20x150 mm Frascos de vidrio con capacidad para 500 ml Frascos de vidrio con tapa rosca con capacidad para 150 ml Asas de inoculación

2 PRT Página 2 de Medios de Cultivo y Reactivos Caldo BLEB, caldo de Enriquecimiento tamponado para Listeria (Caldo Soya Tripticasa con Extracto de Levadura al 0.6%, modificado. (Fórmula M-52 del BAM online) Solución acuosa de Acido Pirúvico (sal sódica) al 10% Solución acuosa de Acriflavina clorhidrato al 0.5% Solución acuosa de Acido Nalidíxico (sal sódica) al 0.5% Solución cicloheximida al 1% Solución de etanol al 40% (v/v) Agar LPM (Lithium Chloride Phenylethanol Moxalactam) Agar Oxford u OXA medium (Listeria Selective Agar Oxford Formulation) Agar PALCAM (Polymyxin Acriflavine Lithium Chloride Ceftazidime Aesculin Mannitol) Agar ALOA ( Agar Ottaviani-Agosti) o equivalente Agar MOX Suplemento Oxford Suplemento PALCAM Suplemento agar ALOA Solución de Moxalactam al 1% en Buffer Fosfato 0,1M ph Agar Soya Tripticasa con Extracto de levadura 0,6% (Agar TSA ye Caldo Soya Tripticasa con Extracto de levadura 0,6% ( Caldo TSB ye) Caldo de fermentación con púrpura de bromocresol (Fórmula M-130 del BAM online) Solución acuosa de glucosa, ramnosa, maltosa y xilosa al 20% Solución acuosa de manitol al 10% Caldo de fermentación (M130 del BAM) con esculina al 0,5% Agar SIM con nitrato de potasio al 0,1% Caldo Voges Proskauer Solución de α Naftol al 0,5% en Acido Acético 5N Solución al 0,8% de ácido sulfanílico en Acido Acético 5N Solución peróxido de hidrógeno al 3%

3 PRT Página 3 de Sangre de cordero desfibrinada Solución de α Naftol al 5% en Alcohol absoluto Solución de Hidróxido de potasio al 40% en agua destilada Solución de Rojo Metilo al 0,2% en Etanol de Tinción GRAM Nota: la preparación de los Medios de Cultivo y Reactivos está especificada en la guía respectiva ubicada en la sala Preparación de Medios de Cultivo (345) en la Sección Microbiología de. 6.3 Equipos Estufa de incubación a 30 ± 1 C Estufa de incubación a 35 ± 1 C Refrigerador (2º C a 4 C) Freezer -20 C Stomacher 400 y/ o Waring Blender Microscopio 7. DESARROLLO DEL PROCESO 7.1 RECEPCION Y PROCESAMIENTO Ver Procedimiento de Recepción de muestras PRT y Procedimiento de Procesamiento de muestras PRT Para la manipulación, transporte y almacenamiento se recomienda una temperatura de 4ºC en la cual Listeria monocytogenes crecerá pero lentamente, si otras condiciones lo permiten Si la muestra es congelada, no descongelar hasta su análisis Muestras compuestas: Para una gran cantidad de alimento se recolectan 10 sub-muestras (líquido, crema, alimento sólido) y porciones de 50 g o ml de cada una de la sub- muestra son utilizadas para formar dos compuestos de muestras de 250 g cada uno El primer compuesto de muestra se obtiene con 5 porciones de 50 g o ml de 5 submuestras las cuales se juntan.

4 PRT Página 4 de El segundo compuesto de muestra se realiza con 5 porciones de 50 g o ml de las 5 sub- unidades de muestras restantes Tomar las precauciones de obtener sub-muestras representativas del alimento considerando las zonas internas como externas Agregar a cada compuesto de muestra de 250 g un volumen de 250 ml de caldo BLEB basal con piruvato de sodio y sin los agentes selectivos. Homogeneizar en Stomacher o Blender Normalmente 50 g de cada compuesto de muestra homogeneizado con el caldo BLEB basal (equivalente a 25g de muestra más 25 ml de caldo BLEB) son mezclados con 200 ml de caldo BLEB basal Como se trata de dos compuestos de muestra el resultado final es de dos porciones analíticas de 25 g en 225 ml de caldo BLEB basal Para cada sub-muestra un total de 50 g del compuesto de muestra es analizada. Una alícuota de 50 ml del compuesto de muestra homogeneizada debería ser retenido a 5ºC pero no inferior a 0ºC para una posible enumeración del patógeno Muestras no compuestas: Si compuestos de muestras no son requeridos, una porción analítica individual de 25 g de muestra es homogeneizada en Stomacher o Blender con 225 ml de caldo BLEB basal Guarde un porción de 25 g de muestra para enumeración del patógeno si es necesario y mantenga a 5ºC si el producto no es congelado, si es congelado mantenga en un congelador que no descongele. 7.2 PRE- ENRIQUECIMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO Incubar por 4 h a 30º C los veinticinco gramos de muestra homogenizada en caldo BLEB basal Una vez cumplidas las 4 h de incubación con caldo BLEB basal, agregar los siguientes agentes selectivos: 0,455 ml de solución acuosa de acriflavina clorhidrato al 0,5%, 1,8 ml de solución acuosa de sal sódica de ácido nalidíxico al 0,5% y 1,15 ml de solución de cicloheximida al 1% en etanol al 40% Si no dispone de cicloheximida puede utilizar pimaricina o natamicina 25 mg/l que es mucho más seguro su uso que la cicloheximida. Otra posibilidad es que si las matrices de interés (por ejemplo: leche y crema pasteurizada, yogurt y productos de origen marino precocidos congelados) poseen baja cantidad de mohos y levaduras

5 PRT Página 5 de 8 puede prescindir de un anti- fúngico. Esto no es recomendable para quesos madurados con mohos, mariscos ahumados o deshidratados y productos frescos Continuar la incubación para completar las 48 h, siempre a 30ºC. 7.3 MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA SCREENING DE MUESTRAS ENRIQUECIDAS Los kits de screening deben seguir las instrucciones del fabricante y asegúrese que el protocolo esté conforme a la AOAC y no esté sujeto a desvíos Revisar el campo de aplicación o alcance debido a que los kits son aprobados para determinadas matrices y varían de un sistema a otro y para matrices distintas a las aprobadas se requiere de una validación interna por el laboratorio. Esto se debe a que la validación convencional del kit no contempla la variación cualitativa y cuantitativa de la flora competitiva acompañante Los umbrales de detección de los kit son más altos (>10 4 ufc/ml del cultivo de enriquecimiento) que los métodos de cultivo en placa (alrededor de 10 2 ufc/ml del cultivo de enriquecimiento) y si a esto se le añade el acompañamiento con una microflora competitiva, los kits podrían dar resultados falsos negativos Para todas las matrices de alimento, un resultado positivo por kit debe ser confirmado por un cultivo de Listeria monocytogenes. 7.4 AISLAMIENTO A las 24 y 48 h, traspasar por aislamiento una asada del cultivo del caldo BLEB sobre los siguientes medios selectivos que contienen esculina: OXA o PALCAM o MOX o LPM fortificado con esculina y Fe 3+. Estos medios que contienen esculina están ordenados por preferencia de uso, sujeto a la disponibilidad del laboratorio Incubar a 35º C por h las placas de Agar Oxford, PALCAM o MOX y a 30ºC por h las de LPM Es muy recomendable que en uno de los agares de tipo selectivo-diferencial para L. monocytogenes L ivanovii tales como BCM, ALOA, RapidL`mono o CHROMagar Listeria se realice traspaso a las 48 h (opcionalmente a las 24h) además de los traspasos en agar con esculina del punto Esto para reducir el problema de enmascaramiento de L. monocytogenes por L. innocua.

6 PRT Página 6 de REAISLAMIENTO Las colonias de Listeria son negras con un halo negro sobre los medios que contienen esculina Otras bacterias pueden formar colonias débilmente negras marrón, pero el desarrollo del color requiere dos días Transferir 5 o más colonias típicas desde el agar OXA y PALCAM o LPM modificado o del agar MOX a placa de agar soya tripticasa con extracto de levadura al 0,6% (TSAye). Sembrar por aislamiento para obtener colonias aisladas típicas y puras Si en las placas de agar BCM se observan colonias azules, éstas son presuntivas de L. monocytogenes ya que L. ivanovii no es comúnmente reportada de alimentos En el agar ALOA L. monocytogenes y L. ivanovii presentan colonias azules y una zona de lipólisis alrededor de ellas La purificación sobre agar TSAye es un paso obligatorio en el análisis convencional porque colonias aisladas sobre un medio selectivo pueden estar en contacto con un competidor invisible inhibido débil o parcialmente Al menos 5 aislados son necesarios porque más de una especie de Listeria puede ser aislada a partir de la misma muestra El uso de agar BCM y agar ALOA ayudará a reducir el número de colonias que necesitan ser traspasadas L. monocytogenes y L. ivanovii pueden ser distinguidas usando un medio comercial confirmatorio (Biosynth International, Inc) o por caldos o agares convencionales para fermentación de ramnosa y xilosa Incubar las placas de agar TSAye a 30ºC por h Las placas de TSAye pueden ser incubadas a 35ºC si las colonias no serán utilizadas para estudio de motilidad mediante observación en húmedo Para métodos rápidos aprobados, usar el agar selectivo para aislamiento recomendado por el fabricante, pero como se menciona anteriormente también es recomendado el uso de los nuevos agares auxiliares de tipo diferencial para L. monocytogenes L. ivanovii. 7.6 IDENTIFICACION La identificación se realiza a partir de colonias puras Kits de identificación rápida a nivel de género o especie están disponibles para facilitar las baterías bioquímicas.

7 PRT Página 7 de Examinar las placas de agar TSAye para buscar las colonias típicas. La observación con la iluminación de Henry puede ser de utilidad para este paso pero no es obligatorio A partir de una colonia típica del agar TSAye traspasar a un tubo con caldo soya tripticasa con extracto de levadura 0,6% (TSBye) para realizar las pruebas de fermentación de carbohidratos, reducción nitrato a nitritos, prueba de motilidad en agar SIM o MTM. Incubar el tubo con caldo TSBye a 35ºC por 24 h A partir de colonias típicas de las placas de agar TSAye realizar las pruebas de motilidad, catalasa, tinción Gram, hemólisis, test de CAMP Seguir conforme al Procedimiento para identificación bioquímica de cepas de Listeria monocytogenes aisladas de alimentos y ambiente PRT SUBTIPIFICACION las cepas aisladas de alimento y confirmadas bioquímicamente como L. monocytogenes se envían al Centro de Referencia para realizar la subtipificación Los aislados son tipificados serológicamente mediante antisueros comerciales y genéticamente por estudio de fragmentos de restricción de ADN mediante electroforesis de campo pulsado PFGE. 7.8 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Diagnosticar como Listeria monocytogenes los cultivos que sean bacilos Gram positivos, móviles, β hemolíticos, que fermenten glucosa, maltosa, ramnosa y esculina y no fermenten xilosa ni manitol; que sean catalasa, Voges Proskauer y Rojo Metilo positivos, y nitratasa negativos. 7.9 INFORME El resultado se expresa como Hubo desarrollo, Detectado o Presencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra o No hubo desarrollo, No Detectado o Ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra, según se hubiere diagnosticado o no, la presencia de esta bacteria en la muestra. 8. REGISTROS Registro Resultados Análisis Listeria monocytogenes 9. ANEXOS Anexo Nº 1 Tabla diferenciación especies de Listeria

8 PRT Página 8 de 8 Anexo Nº 1 Tabla diferenciación especies de Listeria Producción de ácido a partir de Especies β-hemólisis a Manitol Ramnosa Xilosa Virulencia b L. monocytogenes L. ivanovii c L. innocua - - V d - - L. welshimeri - - V d + - L. seeligeri L. grayi e - + V d - - a Agar sangre de cordero b Test en ratón c Cepas fermentadoras de ribosa clasificadas como L. ivanovii subsp ivanovii y no fermentadoras de ribosa como L. ivanovii subsp. londiniensis. d V, biotipos variables e Incluidos dos subespecies- L.grayi subsp murrayi reduce nitratos, L grayi subsp grayi no reduce nitrato