MONITOREO DE FÁRMACOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN EL LABORATORIO CLÍNICO DEL HOSPITAL NACIONAL PSIQUIÁTRICO.

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1 MONITOREO DE FÁRMACOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN EL LABORATORIO CLÍNICO DEL HOSPITAL NACIONAL PSIQUIÁTRICO. DRUG MONITORING BY GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY IN NATIONAL PSIQUIATRIC HOSPITAL CLINICAL LABORATORY. ENSAYO Randall López González * RESUMEN La monitorización de fármacos partiendo de un análisis de laboratorio es una práctica común y objeto de actualización continua ya que las tecnologías modernas permiten medir sustancias para las cuales no existían métodos de detección. La monitorización de antipsicóticos en psiquiatría es fundamental, para determinar la adherencia terapéutica de los pacientes, así como para conocer de manera individualizada la concentración de fármaco en circulación, que influenciada por la variabilidad genética y por la interacción con otros psicofármacos, condiciona la variabilidad en la terapéutica interindividual. Los avances tecnológicos han facilitado este monitoreo para muchas sustancias, la tecnología de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, por sus siglas en ingles GC-MS, es una metodología aceptada para la identificación de compuestos que incluyen gran cantidad de drogas, medicamentos y otras sustancias. Estos instrumentos combinan las características de separación e identificación de la cromatografía de gases y espectrometría de masas para la identificación y cuantificación de algunas sustancias antipsicóticas diferentes dentro de una muestra en el laboratorio. Palabras clave: antipsicóticos, cromatografía de gases, monitoreo de fármacos. ABSTRACT The drug monitoring based on laboratory analysis is a common practice by physicians, the subject of continuous updating as modern technologies to measure substances for which there was no detection methods. Monitoring of antipsychotics in Psychiatry is essential to determine the adherence of patients and to meet individually drug concentration in circulation, influenced by the genetic variability and interaction with other psychoactive drugs, the variability in conditions individual therapeutic. Technological advances have facilitated this monitoring for many substances, the technology of gas chromatography coupled with mass spectrometry, for its abbreviation GC-MS; it is an accepted methodology for the identification of compounds including many drugs, medications and other substances. These tools combine the characteristics of separation and identification of gas chromatography and mass spectrometry for identification and quantification of different antipsychotic some substances within a sample in the laboratory. Keywords: antipsychotics, gas chromatography, drug monitoring. * Especialista en Química Clínica, Laboratorio Clínico Hospital Nacional Psiquiátrico, rjlopezg@ccss.sa.cr 17

2 REVISIÓN DEL TEMA La posibilidad de monitorear los niveles de ciertos medicamentos en pacientes psiquiátricos hace que sea muy necesario implementar tecnologías de punta para ofrecer resultados que hace unos años no era posible realizar, la cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas viene a ser la continuación del desempeño del Laboratorio Clínico del Hospital Nacional Psiquiátrico, que como hospital especializado se posiciona a nivel regional a la vanguardia del tratamiento de la población con padecimientos mentales. La cromatografía de gases, es una técnica relativamente reciente, los primeros pasos de ésta, donde se hace pasar una fase móvil gaseosa a través de una columna se dan en Esta técnica, descrita por Martin y James 1 en 1951, evoluciono a lo que es hoy en día un método usado ampliamente en muchas ramas de la química. Este facilita la separación de los componentes volátiles y semivolátiles de una muestra, aunque sean matrices complejas como la sangre, combinando temperaturas y presiones para lograr altas resoluciones, sensibilidad y tiempos de análisis cortos. Para 1960 ya estaba construido el primer espectrómetro de masas, lo que llevaría a un desarrollo paralelo y constante de ambas técnicas. El vertiginoso desarrollo de la farmacoterapia y la invariable necesidad de monitoreo de sustancias lleva a perfeccionar la técnica y el número de sustancias por detectar y cuantificar aumenta y evoluciona, se acopla la técnica de cromatografía de gas a la espectrometría de masas (GC-MS) 2. Desde entonces, el número de fármacos cuya concentración puede ser evaluada es cada vez mayor y la técnica se ha perfeccionado con la automatización de equipos y los avances de la informática, que permiten el análisis de un cromatograma y el espectro de masa atómica, preciso y en pocas horas. Es conveniente esbozar unos conceptos de manera muy general: Antipsicóticos: Los medicamentos antipsicóticos son fármacos se usan para el tratamiento de las psicosis. Actúan en el cerebro y pueden servir en tratamiento de la esquizofrenia para por ejemplo, para tratar las alucinaciones, delirios y comportamiento errático. Se han desarrollado varias generaciones de antipsicóticos, la primera la de los antipsicóticos típicos empezaron a descubrirse en los cincuentas. La segunda generación constituye un grupo de antipsicóticos atípicos, más recientes y de mayor uso actualmente. Ambos tipos de medicamentos, los típicos y los atípicos, tienden a bloquear los receptores de la vía de la dopamina en el cerebro 2-3. Cromatografía de gases: La cromatografía de gases es una metodología descubierta por James y Martin en 1952, inicialmente se creó para separar ácidos grasos 1. En esta técnica se usa una fase móvil en estado gaseoso para hacer pasar una mezcla de solutos volátiles a través de una columna que contiene a la fase estacionaria, estas columnas varían en tamaño y grosor, estando algunas en el orden de 30 metros de largo y 0.25 micrómetros de grosor, y trabajan en rangos de temperatura que van desde los 50 a los 300 grados 18

3 centígrados. La fase móvil es un gas inerte, puede ser helio, hidrógeno o nitrógeno el cual se conoce como gas transportador o de arrastre que lleva las sustancias de interés en estado gaseoso a lo largo de la columna. Se desarrollaron dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía gas-sólido y la cromatografía gas-líquido, siendo esta la que se utiliza ampliamente, y que se conoce simplemente como cromatografía de gases y por sus siglas en ingles GS. La separación de los componentes del soluto se basa en la diferencia relativa en las presiones de vapor de los solutos individuales y las interacciones que establecen las diferentes moléculas con la fase estacionaria 3. De esta manera, un soluto más volátil eluye o sale fuera de la columna más rápidamente que uno menos volátil. Aparte que si un soluto interactúa selectivamente con la fase estacionaria eluye de la columna después que uno con menor interacción. El gas en la columna transporta los solutos separados al detector en el orden en que van siendo eluidos y estos solutos son identificados cualitativamente por sus diferentes tiempos de retención (TR) dentro de la columna 4. Con un tratamiento matemático la sustancia eluida en este tiempo de retención es graficada, generando un trazo y tamaño del pico, ya sea área o altura es proporcional a la cantidad de sustancia detectada y es usado para cuantificación. Espectrometría de masas: por sus siglas en ingles MS, es una técnica de analisis, tanto cualitativa y cuantitativa, que permite la deteccion y medición de iones derivados de moléculas, posterior a una tecnica de separacion como la cromatografia, las sustancias pasan por un dispositivo de ionizacion que genera fragmentos con carga electrica (z), que viajan a travez de una seccion del espectrometro llamado cuadrupolo que permite su separacion con base a la carga, y finalmente ser detectadas en funcion de su relacion masa-carga (m/z) en un modulo detector. El espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos. Los metodos de ionizacion son de principios variados, electricos, quimicos, laser etc La MS puede utilizarse para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto. Con frecuencia se encuentra como detector acoplado a un cromatógrafo de gases, en una técnica híbrida conocida por sus iniciales en inglés, GC-MS. El espectrómetro de masas mide relaciones de masa/carga (m/z) de iones resultantes, empieza calentando un haz de material del compuesto a analizar, ya separado en el GC hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos,el haz de iones produce un patrón específico en el detector, que permite analizar el compuesto, este se llama espectro de masas y es especifico para cada sustancia y permite su identificacion a nivel molecular. Los equipos pueden detectar un rango definido de masas atomicas que va de 50 a 500 uma y realizar lecturas de los espectro de masas de dos formas, escaneo total, llamado por sus siglas en ingles SCAN y en modo unico en determinados iones llamado SIM5. En la industria esta tecnica es altamente utilizada en el análisis elemental de multiples sustancias, biosensores y cadenas poliméricas 19

4 complejas, drogas, medicamentos, productos de químicos, pesticidas, plaguicidas, análisis forenses, contaminación ambiental y todo tipo de analitos que sean susceptibles de vaporizarse e ionizarse sin descomponerse. Aclarados estos conceptos, se entiende que al ser la sangre una muestra compleja, y contener infinidad de analitos que pueden interesar, es necesario primero eliminar de la muestra las sustancias que no son de interés, y que pueden interferir y enmascarar aquellas que realmente interesa detectar, para luego separarlas y caracterizar sus iones 6. Todo el proceso se puede separar de una forma somera en cuatro etapas 4, la primera es la preparación de la muestra y extracción de las sustancias de interés, donde se toma en cuenta las características particulares de la molécula a determinar cómo, masa atómica, polaridad, estructura, naturaleza, solubilidad y otras propiedades químicas. En esta etapa la muestra se extrae de su matriz biológica, puede ser extracción en fase sólida SPE por sus siglas en inglés 6-7, en fase liquida LPE, dispersiva o alguna de sus variantes. En esta parte se hace pasar la muestra de interés en una columna de extracción junto con varios solventes y soluciones que permitirán según sus reacciones e interacciones separarla de la matriz inicial, y obtenerla de una forma más pura. En la segunda etapa la muestra es inyectada en el GC, donde previamente fueron establecidas condiciones cromatografícas específicas, para el analito de interés, como presión, temperatura, y mediante la combinación de estos y la creación de rampas de temperatura y tiempos definidos se separaran las sustancias presentes en la muestra, estas salen de la columna en un tiempo específico para cada sustancia llamado tiempo de retención, que permite parcialmente identificar el componente separado. La tercera etapa inicia inmediatamente la sustancia separada entra al MS, donde se ioniza y fragmenta, y estos fragmentos cargados viajan a lo largo de un cuadrupolo que permite su separación a nivel molecular 2. Cuando solo unos cuantos analitos son de interés para el análisis cuantitativo y su espectro de masas es conocido, el espectrómetro de masas puede ser programado para monitorear solo esos iones de interés. Esta técnica de detección selectiva es conocida como monitoreo de iones seleccionados, SIM por sus siglas en ingles. Debido a que esta técnica se enfoca en un limitado número de iones, se pueden recolectar más señales electrónicas por cada masa seleccionada en un espacio de tiempo. Esto incrementa el desempeño del instrumento y mejora el límite de detección inferior. Una ventaja de esta técnica es la de usar una molécula marcada igual a la de interés como estándar interno, este componente marcado se comporta casi de manera idéntica que el compuesto nativo durante la preparación de la muestra y el análisis cromatografíco 4. La cuarta parte corresponde al análisis de los datos que consiste en una minuciosa revisión de cada uno de los cromatogramas, picos de señal, espectros de masas, intensidad de los iones, y detalles técnicos especializados 11. Aplicaciones clínicas de ambas técnicas Una de las aplicaciones más comunes de la GC-MS es el tamizaje de drogas y fármacos para propósitos clínicos o forenses

5 Muchas drogas tienen pesos moleculares relativamente pequeños y propiedades volátiles y/o no polares, lo cual las convierte en adecuadas para el análisis por GC-MS. La ionización de electrones con detección de masas de escaneo completo es el abordaje más ampliamente usado para el escrutinio exhaustivo de drogas. La identificación de componentes desconocidos puede ser lograda por comparación de su espectro de masas completo con una biblioteca o base de datos de espectros de masas Una limitación importante de la GC-MS es el requisito de que los componentes sean lo suficientemente volátiles para permitir la transferencia de una fase sólida al transportador móvil de gas y así eluir de la columna analítica al detector. Aunque muchos componentes biológicos son tratables con separación cromatografíca con GC, existen muchos componentes que son muy polares o muy grandes para ser analizados con esta técnica. El sistema de análisis por cromatografía de gases con detector de masa cuenta con algunas ventajas 4, por ejemplo: Velocidad de análisis. Permite analizar muestras con muchos componentes Sensibilidad (subpicogramos). Bajo costo por muestra. Bajo costo de mantenimiento anual. Más de 10 años de vida útil. Especificidad a nivel molecular Tecnología de punta CONCLUSIÓN La implementacion de esta metodología en el Hospital Nacional Psiquiátrico, iniciando con la deteccion del antipsicótico Clozapina 12 ha seguido un camino extenso y conlleva el esfuerzo de muchos colaboradores, abocados a iniciar este proyecto y más recientemente a hacerlo funcionar, lo que permitirá el monitoreo de sustancias y el beneficio para los pacientes al poder ser tratados según sus niveles terapéuticos. Estos análisis que no se han analizado antes en el país, inician lo que en un futuro sera un laboratorio innovador, donde se efectúen una amplia variedad y cantidad de pruebas permitiendo ubicar al Laboratorio Clínico y al Hospital Nacional Psiquiátrico como un Centro Médico Especializado. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Martin A, Synge R. A new form of chromatogram employing two liquid phases. A theory of chromatography. Biochem Journal, 1941; 35(12), Dart R, editor. Medical Toxicology. 3rd ed. Philadelphia. Lippincott Williams & Wilkins Fauci AS, Kasper DL, Braunwald E, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, editors. Harrison s principles of internal medicine. Vol 1. 17th ed. New York: McGraw Hill; McNair H M, Miller J. Basic Gas Chromatography, Techniques in Analytical 21

6 Chemistry. 2nd ed. New Jersey; Wiley and Sons, Burtis CA, Ashwood ER, Burns DE. Tietz Textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics. 5th ed. St Louis; Elsevier; Supelco. A practical guide to quantitation with solid phase microextraction. Bulletin 929, T Bellefonte: PA:.Supelco; Snow NH. Solid-phase micro-extraction of drugs from biological matrices. J Chromatogr A 2000; 885: Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology. J.Anal.Toxycol. 2013; 37: Vardakou I, Dona A, Pistos C, et al. Validated GC/MS method for the simultaneous determination of clozapine and norclozapine in human plasma. Application in psychiatric patients under clozapine treatment. J.Chromatogr. B.2010; 878 : Pomilio AB, Vitale AA.Técnicas para determinación cuali/cuantitativa de drogas de abuso en fluidos biológicos. Acta Bioquím Clín Latinoam 2006; 40 (3): Guodong Z, Terry VA, Bartlett M. Bioanalytical methods for the determination of antipsychotic drugs. Biomed Chomatogr. 2008; 22: Langel K, Gunnar T, Ariniemi K, et al. A validated method for the detection and quantitation of 50 drugs of abuse and medicinal drugs in oral fluid by gas chromatography mass spectrometry. J. Chromatogr. B.2011; 879: