Espectrometría de masas Instrumentación y aplicaciones
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- Francisco Javier Gil Gómez
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1 Clase 01 Espectroscopía de Compuestos Orgánicos MALDI-MS ESI-MS Espectrometría de masas Instrumentación y aplicaciones
2 Espectrometría de Masa Espectrometría de Masa (MS: Mass spectrometry) Espectroscopía o Espectrometría?? Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra la relación masa(m):carga (z); m/z Analogía entre un espectrómetro de masa y un prisma
3 Espectrometría de Masa Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry) Espectroscopia o Espectrometria?? Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra Energía M M + la relación masa(m):carga (z); m/z f 1 + f + 3 M f + + f f + f muestra ionización f + 4 fragmentación f 2 + separación m/z Espectro de Masa
4 Espectrometría de Masa Espectro de MASA de una molécula, % de abundancia relativa vs. relación MASA/CARGA Espectro de Masa de metanol
5 Espectrometria de Masa - Información Identificación de compuestos desconocidos (masa del compuesto o de sus fragementos) biomoléculas grandes, presición de 0.01% ( Da error de 4Da) moléculas pequeñas, presición de 5 ppm o menores (suficiente para confirmar la masa molecular de un compuesto) determinar la composición isotopica de un elemento en una muestra determinar la estructura de un compuesto (patrón de fragmentación) cuantificación de un compuesto en una mezcla (diseño de método, MS no e stécnica cuantitativa)
6 Espectrometria de Masa - Aplicaciones Industrial o Académica (para procesos de rutina o de investigación) Campos de aplicación: Bioquímica-Biotecnología: análisis de proteínas, peptidos, oligonucléotidos Química farmacéutica: descubrimiento de drogas, química combinatoria, farmacocinética, metabolismo de drogas Bioquímica clínica: test de drogas Analisis Ambientales: calidad de agua, contaminación de alimentos Geología: composición de hidrocarburos
7 Espectrometria de Masa - Revisión histórica 1897 J.J. Thomson, primer medida m/q de partículas elementales corpúsculos A. Dempster & F. Aston, primer espectrógrafo de masa 1951 W. Pauli & H. Steinwedel, espectrómetro de masa de cuadrupolo 1959 K. Biemann, MS electroionización aplicada a péptidos M. Dole, polimeros naturales y sintéticos en fase gaseosa a presión atmosférica 1974 D. Torgerson, plasma desorption MS (fisión de 252 Cf) 1974 B. Mamyrin, contribución al desarrollo de TOF MS 1978 N. Commisarow & A. Marshall, adaptación de métodos de transformadas de Fourier a ICRS, ion cyclotron resonance spectrometry 1981 M. Barber, FAB; fast atom bombardment, masa de Met-Lys-bradykinin M= R. Willoughby & M. Aleksandrov (trabajos independientes) proponen acoplar LC a MS 1988 J. Fenn & M. Yamashita (trabajos independientes) macromoléculas biológicas en fase gaseosa a presión atmosférica, ESI, electrospray ionization. M. Karas & F. Hillencamp y K. Tanaka (trabajos independientes) desrrollan MALDI, matrix assisted laser desorptionionization. 2002, K. Tanaka recibe premio Nobel Especificidad y Sensibilidad MALDI-MS 2000-presente Desarrollo de MS como técnica analítica en ciencias biológicas
8 Espectrometria de Masa - Revisión histórica
9 Espectrometría de Masa What is Mass Spectrometry? John B. Fenn, the originator of electrospray ionization for biomolecules and the 2002 Nobel Laureate in Chemistry, probably gave the most apt answer to this question: Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine their molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient, frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species. To practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte, then measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to various combinations of electric and magnetic fields. Clearly, the sine qua non of such a method is the conversion of neutral analyte molecules into ions. For small and simple species the ionization is readily carried by gas-phase encounters between the neutral molecules and electrons, photons, or other ions. In recent years, the efforts of many investigators have led to new techniques for producing ions of species too large and complex to be vaporized without substantial, even catastrophic, decomposition.
10 Espectrometria de Masa - Aplicaciones Biológicas Desde 1930, MS técnica analítica importante para Biología Estructural Producción de iones de alto peso molecular en fase gaseosa (macromoléculas biológicas) Desarrollo de técnicas de ionización como FAB, MALDI, ESI Desarrollo de métodos ultrasensibles para caracterización de proteínas basados en Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTIR-MS), límite de detección de 30 zmol (30x10-21 mol) para proteínas de masa molecular 8 20 kda. Utilización de MS: Determinación precisa de masa molecular de proteínas y ac. nucleícos, amplio rango de masas Secuenciación de péptidos y oligonucleótidos Identificación de modificaciones post-traduccionales Cambios estructurales en proteínas, plegamiento y dinámica Identificación de proteínas (cantidades subpicomolares) de 2D-electroforesis Identificación de marcado isotópico
11 Espectrometría de Masa - Iones en campos eléctricos y magnéticos ión acelerado por una fuente externa, adquiere E. cinética (E kin ) E kin = z * V acc = mv 2 2 Z: carga del ion Vacc: diferencia de potencial en región de aceleración m: masa del ion v: velocidad del ion partícula cargada, en campo magnético homogéneo (B), perpendicular a trayectoria, fuerza de Lorentz F, trayectoria, círculo de radio r. Relación m/z m Z = B2 r 2 = 2Vacc F = zvb = mv2 r Partícula cargada en campo Eléctrico y Magnético
12 Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición de masa Resolución, R: medida de la habilidad de un instrumento para separar iones de masas similares, m y m+dm, de igual intensidad, con superposición de señal de 10% Ejemplo: R=1000 (sector magnético), permite separar masas de 1000 y 1001 Da. R=100000, permite distinguir masas de y Da, 10 ppm. m Dm m+dm Definir la extensión de la superposición de picos adyacentes 10% valley definition (2 picos adyacentes contribuyen con 5%) Full width, half maximun (FWHM),masa del pico (Da) dividido el ancho del pico a la mitad de la altura R (FWHM) aprox. 2 veces R (10%) 10% R=m/Dm
13 Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición de masa
14 Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición de masa Presición de la medida de masa molecular es la diferencia entre la masa medida y la calculada para cierto ión Expresada como: o % de la masa medida: masa molecular = ± 0.01% ppm de la masa medida: masa molecular = ± 100ppm -Presición en las determinaciones de masa molecular, no requieren alta resolución - Factor limitante en la presición de la determinación de masa molecular para macromoléculas de alta masa es la superposición de picos
15 Espectrometría de Masa Error y Precisión según la masa molecular Para moléculas pequeñas Error menores de 5 ppm permiten identificar la formula molecular inequivocamente Ej: C 23 H 37 NO 3 Masa esperada uma C 23 H 37 NO 3 Masa encontrada uma Error = [( )/ ] * 1E 6 = 2.2 ppm = Diferencia = uma Para biomoleculas de alto MW se pueden determinar con alrededor de 0.5 Da Ej.: PM 50 kda con 2.2 ppm de error masa encontrada Da Diferencia = 0.11 uma 1 Da = 1 uma
16 Espectrometría de Masa Resolución de masa y presición de masa, masa promedio
17 Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición de masa, masa promedio.
18 Espectrometría de Masa Espectrómetro de Masa Tratamiento de la muestra INYECCIÓN de la muestra, directa o con tratamiento previo (sample injector) IONIZACIÓN de la muestra (ion source) SEPARACIÓN de los iones con diferentes m/z (mass analyzer) DETECCIÓN del número de iones producidos (detector) COLECCIÓN de datos, generación del espectro de masa
19 Espectrometria de Masa Electrón Primer espectrómetro de masa: 1913, J.J. Thomson Campos eléctricos y magnéticos fijos para separar isótopos de Ne, por diferencia de comportamiento de partículas cargadas (diferentes momentos y energías) en un campo electromagnético. Muestra Fuente de ionización Analizador de masas DETECTOR Análisis de Datos
20 Espectrómetro de Masa SAMPLE ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS 3 partes básicas, alto vacio (no siempre) Muestra ionización- analizador de masa, separación de acuerdo a su relación m/z detección señal enviada a sistema de análisis de datos (abundacia en función de m/z) Generación del Espectro de masa, % abundancia relativa vs. m/z
21 Espectrometría de Masa
22 Espectrometría de Masa Figure 1.2. Components of a mass spectrometer. Note that the ion source does not have to be within the vacuum of the mass spectrometer. For instance, ESI and APCI are at atmospheric pressure and are known as atmospheric pressure ionization (API) sources.
23 Espectrómetro de Masa Muestra + _ Fuente de ionizacion Analizador de masas Detector
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25 Espectrómetro de Masa Instrumentación Generación iones Separacion de iones Detección de iones Métodos de ionizacion - Impacto electrónico - Ionizacion Química - MALDI - Electrospray - APCI Análizadores de masas Cuadrupolo Tiempo de vuelo Trampa de iones Orbitrap Ciclotrón En tandem QqQ / QTof / Tof-Tof / IT-Tof Espectro de masas Análisis en bases de datos
26 Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización Impacto electrónico (EI - Hard method) Moleculas pequeñas, Daltons Fast Atom Bombardment (FAB Semi-hard) peptidos, azucares, hasta 6000 Daltons Electrospray Ionization (ESI - Soft) peptidos, proteinas, hasta 200,000 Daltons Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI-Soft) peptidos, proteinas, DNA, hasta 500 kd
27 Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización Impacto Electrónico Renombrado como ionización electrónica Calentamiento electrodo, produce e - Energía electrón: l = h/mn Dualidad onda-párticula
28 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
29 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
30 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica Aproximadamente UN ión por cada 1000 moléculas ( 70eV) 10 ev energía necesaria para ionizar una molécula. Exceso de energía?? I = NpiV I = número de iónes producidos N= constante, p= presión, i=corriente
31 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
32 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
33 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica
34 Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica En lugar de bombardear las moléculas con electrones se usan moléculas cargadas. Fuente de ionización mixtas, pueden usar ionización química y electrónica.
35 Espectrómetro de Masa - Ionización química
36 Espectrómetro de Masa - Ionización química Reacciones en ionización química Dependiente de las características de la molécula a ionizar, (heteroátomos, aceptores protón) GH + transfiere un protón a la muestra GH + + M G + MH +
37 Espectrómetro de Masa - Ionización química
38 Espectrómetro de Masa - Ionización química 1) Formación de aductos 2) Reacciones de transferencia de carga Se usan gases utilizados
39 Espectrómetro de Masa - Ionización química
40 Espectrómetro de Masa - Ionización química Metano Reacciones CH 4 + e -----> CH e > CH 3+ + H. CH CH > CH 5+ +CH 3. CH CH > C 2 H 5+ + H 2 + H.
41 Espectrómetro de Masa - Ionización química Isobutano Reacciones i-c 4 H 10 + e -----> i-c 4 H e i-c 4 H i-c 4 H > i-c 4 H C 4 H 9 +H 2
42 Espectrómetro de Masa - Ionización química Amoníaco Reacciones NH 3 + e -----> NH e NH NH > NH NH 2. NH 4+ + NH >N 2 H 7 +
43 Espectrómetro de Masa - Ionización química
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