Instituto de Biotecnología

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1 Instituto de Biotecnología UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS CURSO DE MÉTODOS ESPECTROMETRÍA DE MASAS PRESENTA: GERMÁN PLASCENCIA VILLA JUNIO DE 2003 CUERNAVACA, MORELOS 1

2 Espectrometría de Masas INDICE INDICE 2 INTRODUCCIÓN 3 HISTORIA DE LA ESPECTROMETRIA DE MASAS 4 EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS 6 ENTRADA DE LA MUESTRA 8 MÉTODOS DE IONIZACIÓN 9 Impacto Electrónico (Electron Impact EI) 9 Ionización Química (Chemical Ionization CI) 10 Ionización de Campo (Field Ionization FI) 11 Desorción de Campo (Field Desorption FD) 11 Bombardeo con Átomos Rápidos (Fast Atom Bombardment FAB) 13 Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI) 14 Matrix-Assited Laser Desorption/Ionization (MALDI) 16 ANALIZADORES DE MASAS 19 Efecto de campos magnéticos sobre los iones 19 Principios de los analizadores de masas 19 Espectrómetro de masas de sector magnético (Magnetic Sector Mass Spectrometer) 20 Espectrómetros de masas de cuadrupolo (quadrupole) 21 Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF) 22 Analizadores de trampa de iones (Ion-Trap) 24 Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) 25 DETECTORES DE IONES 27 Copa Faraday 27 Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier) 27 Detector Daly 28 Detector de Microcanales 29 ADQUISICIÓN Y PROCESAMIENTO DE DATOS 30 Procesamiento de Datos 31 APLICACIONES 32 Análisis de estructura y masa 32 Sistemas acoplados 33 Análisis cuantitativos 34 Análisis de péptidos 35 Iones de péptidos 36 Secuenciación de péptidos 36 Identificación de proteínas 37 HERRAMIENTAS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS 38 DEFINICIÓN DE TÉRMINOS 39 REFERENCIAS 40 2

3 INTRODUCCIÓN La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñas (algunos pmoles) de muestra y obtener información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización. En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito explotan en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentación resultante así como los iones residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado como se huella química para caracterizar el analito. El proceso de análisis por espectrometría de masas comienza en llevar el compuesto a analizar a fase gaseosa, la muestra debe tener una presión de vapor de que 10-2 mmhg, debido a que las moléculas deben migrar por difusión desde el sistema de entrada hacia la cámara de ionización. Las muestras pueden ser introducidas al espectrómetro de masas usando una sonda directa o por entrada en lote (batch) para sólidos puros o líquidos volátiles. Analitos purificados por diferentes técnicas de separación (cromatografía de gases, cromatografía de líquidos, electroforesis capilar, etc.) pueden entrar al espectrómetro de masas tan pronto como vayan saliendo. Ya que las moléculas neutras difunden en forma aleatoria por la fuente de ionización, solo una porción es ionizada. El proceso de ionización más común en análisis en fase gaseosa es el de ionización electrónica (EI), en el cual se transfiere energía a la molécula neutra en estado de vapor, dándole suficiente energía para expulsar uno de sus electrones y de ese modo tener una carga residual positiva. Este proceso produce un ion con carga positiva y un electrón suelto. La molécula ionizada puede tener energía excesiva que puede ser disipada a través de la fragmentación de ciertos enlaces químicos. El rompimiento de varios enlaces químicos permite la producción de fragmentos de ion cuya masa es igual a la suma de las masas atómicas de un grupo de átomos que retienen la carga positiva durante el proceso de fragmentación. Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al pasar la solución por un campo eléctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom bombardment) o por interacción con especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Después de producir los iones, el siguiente paso es su análisis en el analizador de iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z). Los iones tienen una carga eléctrica que les permite ser controlados por campos eléctricos; son separados por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de analizadores de masas: magnéticos, de cuadrupolo, trampa de iones cuadrupolo, trampa de iones magnética, o tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia a lo largo de la escala m/z. Durante el proceso de adquisición de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en forma tabular o en formato de gráfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra analizada. 3

4 HISTORIA DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS La espectrometría de masas tiene su origen en los experimentos desarrollados en el Cavendish Laboratory de la Universidad de Cambridge en Inglaterra en 1897 por Joseph John Thomson, él descubrió que descargas eléctricas en gases producían iones y que estos rayos de iones podían adoptar diferentes trayectorias parabólicas de acuerdo a su masa cuando pasaban a través de campos electromagnéticos. Thomson realizó la construcción del primer espectrómetro de masas, llamado parábola espectrográfica (Figura 1), para la determinación de la relación masa/carga de iones. Figura 1. Parábola espectrográfica construida por J.J. Thomson Uno de los estudiantes de Thomson, Francis William Aston fue quien diseño varios espectrómetros de masas en los cuales los iones eran dispersados por sus masas y enfocados de acuerdo a su velocidad. Esto permitió mejorar el poder de resolución de masas y el posterior descubrimiento de isótopos de diferentes elementos que están presentes en la naturaleza. Thomson recibió el Premio Nobel de Física en 1906 y Aston el Premio Nobel de Química en En la década de los 20 s, Arthur J. Dempster de la Universidad de Chicago, desarrolló un analizador magnético que enfocaba iones formados por impacto electrónico (electron impact) sobre un colector eléctrico. Este diseño fue adaptado por Josef Mattauch, Richard Herzog, Kenneth Bainbridge, Alfred Nier y otros, permitiendo importantes descubrimientos en física atómica y nuclear en los 30 s. Pero fue hasta la década de los 40 s que los primeros espectrómetros de masas comerciales aparecieron. Durante los 30 s y 40 s, Nier y algunos otros incorporaron las tecnologías de vacío y electrónica para mejorar el desempeño de los primeros diseños de espectrómetros. Instrumentos de doble enfoque, que combinan analizadores magnéticos y electrostáticos fueron introducidos permitiendo incrementar la precisión. Estos instrumentos fueron originalmente desarrollados con el propósito de determinar en forma precisa los pesos atómicos de los elementos y sus isótopos. En la década de los 40 s se construyeron los primeros espectrómetros de masas disponibles comercialmente por medio de diferentes compañías de Europa y Estados Unidos. En esta década también se desarrolló el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (time-of-flight, TOF), un concepto propuesto como un analizador mas barato y simple en el cual los iones son separados en base a sus diferencias en velocidad cuando son acelerados en un tubo de vuelo lineal. A principios de los 50 s, los patrones de fragmentación de los iones comenzaron a ser entendidos, aunque los aparatos disponibles estaban limitados en el rango de masas. Otro tipo de instrumento desarrollado para el propósito de acoplar el espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases fue el filtro de masas cuadrupolo, el cual usa un campo eléctrico cuadrupolar conteniendo componentes de radiofrecuencia y corriente directa para separar iones. En 1953 el analizador de masas cuadrupolo fue patentado. Este analizador fue reportado por Wolfgang Paul de la Universidad de Bonn, quien después ganó el Premio Nobel de Física en 1989 por su trabajo de trampa de iones (ion trapping). En 1956 las primeras muestras biológicas (esteroides) fueron exitosamente analizadas. En los 60 s la espectrometría de masas se estableció como una técnica para caracterizar compuestos orgánicos. Este fue asistido con la introducción de una fuente de ionización química. Otros métodos de ionización surgieron incluyendo desorción de campo, ionización secundaria (secondary ionization MS o SIMS), desorción de plasma y desorción láser. Aparecieron las primeras publicaciones científicas especializadas incluyendo Organic Mass Spectrometry. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) surgió con el desarrollo de procedimientos de disociación por inducción de colisión, permitiendo obtener información estructural de componente de una mezcla usando dos etapas de análisis de masas. 4

5 En 1974 se desarrollo la espectrometría de masas Fourier ICR (FT-ICR MS). Una importante ventaja de este sistema es que permite detectar simultáneamente varios iones y estos espectrómetros de masas también logran tener muy alta resolución de masas. En los 80 s se desarrollaron las técnicas de ionización capaces de ionizar eficientemente moléculas biológicas. Michael Barber en Manchester desarrollo la técnica FAB (Fast Atom Bombardment) la cual utiliza una fuente de átomos pesados neutrales para ionizar compuestos de una superficie de una matriz líquida. John Fenn de la Universidad Yale refinó la fuente de iones originalmente reportada por Malcolm Dole de la Universidad Northwertern casi dos décadas antes de la técnica de ionización de electrospray (ESI). Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) fue también desarrollada en los 80 s por Franz Hillenkamp y Michael Karas. En esta técnica, las moléculas son desorbidas por un láser de una superficie sólida o líquida conteniendo una matriz de compuesto orgánico. Las técnicas ESI y MALDI han permitido la introducción de moléculas biológicas de más de 1 millón de Daltons en los espectrómetros de masas como iones estables en fase gaseosa. Actualmente, los espectrómetros de masas son utilizados para el estudio de un amplio rango de sustancias y materiales con alta precisión y sensibilidad. Los campos de aplicación son desde estudios astronómicos del sistema solar, geofísica y geoquímica, hasta análisis químicos y en forma fundamental en investigaciones de química, toxicología, ciencias ambientales, y en forma creciente en ciencias biológicas y biomédicas. 5

6 EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS Un Espectrómetro de Masas es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que han sido convertidas en iones. Un espectrómetro de masas no mide la masa molecular directamente, pero mide la relación masa/carga de los iones formados de las moléculas. Los espectrómetros de masas tienen siete componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades del sistema. Figura 2. Componentes básicos de un espectrómetro de masas Los instrumentos usados están compuestos de una combinación de sistemas de entrada, fuentes de iones, y analizadores de masas (Tabla 1). Tabla 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masas COMPONENTE VARIANTES Sistema de entrada 1. Directo. 2. Columna capilar cromatografía líquida. Fuente de iones 1. Impacto electrónico. 2. Ionización Química. 3. Ionización de campo. 4. Deserción de campo. 5. Bombardeo con Átomos Rápidos. 6. Electrospray, incluyendo nanospray y microspray. 7. Matrix-assisted laser desorption (MALDI) Analizador de masas 1. Cuadrupolo. 2. Trampa de iones (Ion-trap). 3. Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF). 4. Analizador FT-ICR Los procesos básicos asociados con la espectrometría de masas abarcan desde la generación de iones en fase gaseosa de un analito, y la medición de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones. La formación de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerequisito esencial en el proceso del espectrómetro de masas en el proceso de verificación de masas moleculares o análisis. Aunque los primeros espectrómetros de masas requerían que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir muestras en soluciones líquidas o en una matriz sólida. Dependiendo del tipo de entrada y técnica de ionización usada, la muestra puede ya estar en forma de iones en solución, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilización por otros métodos en la fuente de iones. El estudiar el analito como un ion en fase gaseosa le dan dos características fundamentales. La primera característica fundamental es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma precisa en campos electromagnéticos que contienen los iones a estudiar y pueden ser manipulados para probar el movimiento del ion en el campo. Debido a que el movimiento de los iones es proporcional a la relación m/z del ion, esto justifica la medición de la m/z y por lo tanto la masa del analito. Los detalles concernientes a diferentes tipos de técnicas de análisis de masas y técnicas de ionización utilizadas determinan factores tales que la precisión y exactitud de la medición de m/z, la resolución, y el rango de m/z del analizador. La segunda 6

7 característica fundamental es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrómetro de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnéticos que permiten medir m/z también les provee contención y enfoque. Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los detectores de partículas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran sensibilidad debido a una combinación de señales de bajo fondo y la eficiente generación de electrones secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 10 5 o mayores. El mantenimiento de la precisión y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad del análisis requiere operación experta del sistema de espectrometría de masas. Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de generación de los iones y colocarlos en la fase gaseosa, además de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. El desarrollo de la ionización por electrospray y MALDI han aportado dos importantes métodos para la producción de iones de péptidos y proteínas en fase gaseosa. Otra consecuencia de la complejidad de los instrumentos es el alto precio de tales instrumentos en términos su adquisición y costos de mantenimiento. Sin embargo, en general y considerando la sofisticación, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados, se puede justificar que el costo de la espectrometría de masas es proporcional con los costos asociados con otros componentes en los proyectos de investigación que requieren este tipo de análisis. 7

8 ENTRADA DE LA MUESTRA Para sólidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra que es introducida dentro del espectrómetro a través de un sistema de vacío. La muestra es entonces evaporada o sublimada en una fase gaseosa, usualmente por medio de calor. Gases y líquidos pueden ser introducidos a través de sistemas de entrada diseñados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes), estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a través de un sistema de vacío hacia la fuente de ionización que esta a alta presión (Figura 3). Estas sondas pueden ser diseñadas para soportar muestras para ser ionizadas por distintos métodos. Una vez que la muestra está es fase gaseosa es ionizada y frecuentemente acompañado de fragmentación para proceder al análisis de masas. En algunas técnicas especializadas, la volatilización y la ionización de la muestra ocurren al mismo tiempo. Figura 3. Sondas directas (direct probes) Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes individuales deben ser separados antes del análisis de espectrometría de masas. La separación de los compuestos es necesaria para tener certeza de la identificación, ya que dos o más compuestos presentes en la muestra pueden crear espectros que se sobrelapen o mezclen ya que los iones generan fragmentos simples que dificultarían el análisis de los datos obtenidos. Desde que en la década de los 60 s se acopló la cromatografía de gases (GC) a la espectrometría de masas, esta conexión permite separar compuestos ya en fase gaseosa para su entrada al espectrómetro al entrar las diferentes fracciones en diferentes tiempos en forma continua permite un análisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografía de líquidos (LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar compuestos, se pueden acoplar a espectrómetros de masas para análisis de muestras complejas. 8

9 MÉTODOS DE IONIZACIÓN Un reto fundamental en la espectrometría de masas de cualquier tipo de analitos es la producción de iones en fase gaseosa de estas especies, y dificultades en la producción de estos iones en fase gaseosa pueden impedir el análisis por espectrometría de masas de ciertas clases de moléculas. Esta situación fue el caso de proteínas y péptidos. Las primeras técnicas que fueron aplicadas, ionización electrónica (electron ionization EI) e ionización química (chemical ionization CI), son procesos de dos etapas en los cuales los analitos son vaporizados con calor y la ionización ocurre una vez que el analito esta en fase gaseosa. Esta etapa de vaporización limitó los experimentos de análisis por espectrometría de pequeños péptidos, usualmente a máximo 4 o 5 aminoácidos. Adicionalmente, estos péptidos tenían que ser derivatizados para minimizar su polaridad y darles suficiente volatilidad. El análisis de proteínas no era simplemente posible, y problemas similares se encontraban en otras clases de moléculas polares. La ionización por bombardeo con átomos rápidos (fast atom bombardment FAB) fue el primer método de ionización que hizo posible analizar rutinariamente por espectrometría de masas a moléculas polares, también fue fundamentalmente diferente de otros métodos de ionización tal como ionización electrónica (IE) debido a que los iones en fase gaseosa fueron generados directamente de una solución del analito en fase líquida. Como resultado, las diferentes formas de vaporización y de ionización del analito se convirtieron en una etapa estrechamente ligada en el proceso total de análisis por espectrometría de masas. Impacto Electrónico (Electron Impact EI) El Impacto Electrónico (Electron Impact EI) o comúnmente llamado Ionización Electrónica (Electron Ionization EI) es un método clásico de generación de iones en espectrometría de masas utilizado aún en muchas aplicaciones. El analito es introducido dentro de la fuente de ionización que esta al vacío (<10-6 mbar) y sebsecuentemente ionizado por colisiones con un flujo de electrones (a 70 ev). M + e - _ M e - Los electrones para este proceso son generados por emisión térmica de un filamento caliente. El filamento esta típicamente hecho de tungsteno o de renio. Los electrones son subsecuentemente acelerados al aplicar un potencial entre el filamento y la muestra. El rayo de electrones cruza la fuente de iones, afectando las moléculas neutras que provienen de la muestra (Figura 4). La corriente típica del filamento es de 1x10-4 Amp. Figura 4. Ionización por Impacto Electrónico (EI) La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) operada de 20 a 500 C o por medio de un cromatógrafo de gases. Las muestras deben ser de polaridad baja o media y con cierta estabilidad térmica, además de que deben ser evaporadas antes de su ionización. El proceso de EI causa mucha fragmentación de las moléculas lo cual puede tener ventajas en la deducción de su estructura. El mecanismo de formación de iones para la especie AB es el siguiente: 1. AB + e -* _ A + + B - + e - 2. AB + e -* _ A + + B + 2e - 3. AB + e -* _ [AB + * ] + 2e - seguido de [AB + * ] _ AB + 4. AB + e -* _ [AB 2+* ]" + 3e - seguido de [AB 2+* ]" _ A + + B + - (muy baja abundancia) 5. AH + e -* _ AH* + e - seguido de AH* + AH _ [AH+H] + + A - 9

10 Donde: * = Especies de alta energía. = Radicales. " = Intermediarios de vida corta. En 1 y 2 se indican las especias de mayor abundancia las cuales sufren de fragmentación instantánea. En 3 indica especias de abundancia media. En 4 indica especies de abundancia muy baja. En 5 son especies que pueden formarse a altas presiones Ionización Química (Chemical Ionization CI) La Ionización Química (Chemical Ionization CI) es un método de ionización relativamente suave, y es el primer método de ionización suave introducido a la espectrometría de masas. La ionización es afectada por reacciones sobre la molécula con iones de un reactivo gaseoso generados por medio de ionización de impacto electrónico (EI) con moléculas del analito neutras. El reactivo gaseoso es empleado con un exceso de veces la molaridad del. Esto puede ser logrado al usar volumen de iones bastante pequeño en comparación a las condiciones de EI. El volumen de reactivo gaseoso se controla por medio de una válvula. Figura 5. Ionización Química (CI) Entre los agentes gaseosos utilizados se incluyen el metano, el isobutano y al amoniaco, formando iones CH 5 +, C 4 H 9 +, y NH 4 + respectivamente como especies predominantes. En caso del metano, el siguiente proceso es el que permite la formación de iones reactivos: 1. CH 4 + e - _ CH 4 +. Y fragmentos tales como CH CH CH 4 _ CH CH 3. (autoprotonación) 3. CH CH 4 _ C 2 H H 2 La protonación de un analito es dependiente de la diferencia de afinidades por protones en las bases correspondientes. Por ejemplo, el CH + 5 protona la mayoría de los analitos, mientras que el NH + 4 es más selectivo debido a que necesita un sitio ligeramente básico en las moléculas del analito. M + CH 5 + _ [M+H] + + CH 4 Los iones [M+H] + son llamados iones cuasi-molecular. La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operación de 20 a 500 C (para sólidos y líquidos de baja volatilidad, así como líquidos y gases) o por medio de un cromatógrafo de gases (mezclas). Los analitos deben tener polaridad baja o media, así como estabilidad térmica. La ionización química genera iones de energía interna relativamente baja, exhibiendo un bajo nivel de fragmentación, la evaporación del analito antes de su ionización es el paso crítico. 10

11 Tabla 2. Iones producidos por CI Tipo de analito Iones positivos Iones negativos dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado Polaridad baja [M+H] + M -. // [M-H] - Polaridad media [M+H] + // [M+R] + [2M+H] + M -. [M-H] - Polaridad alta [M+H] + [M+R] + // [2M+H] + [M-H] - // [M+R] - M -. Iones K + A - descomposición descomposición Ionización de Campo (Field Ionization FI) La Ionización de Campo (Field Ionization FI) es un método de ionización suave. La muestra es introducida por las mismas técnicas que en EI y CI. La ionización de campo lleva el riesgo de descomposición térmica de la muestra. Las moléculas son ionizadas por medio de ionización de campo (FI) en los bordes del campo del ánodo emisor. El emisor consiste de un alambre de tungsteno de 10-13mm de diámetro que es activado por un procedimiento especial creando miles de microagujas en su superficie. Un voltaje alto de kv es aplicado al emisor causando polarización y finalmente ionización de las moléculas que están cerca de las puntas de las microagujas donde el campo eléctrico alcanza una gran fuerza. Este proceso tiene una eficiencia de ionización muy baja y por lo tanto, FI produce una corriente de iones muy baja. FI produce iones del tipo M +. y/o [M+H] +, dependiendo del analito. Aunque los iones generados pueden estar casi libres de fragmentación, se prefiere la ionización CI en lugar de FI no puede ser utilizada debido a la volatilidad del analito. La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operación de 20 a 500 C (para sólidos y líquidos de baja volatilidad, así como líquidos y gases), el uso de un cromatógrafo de gases acoplado al espectrómetro de masas es complicado ya que las condiciones son difíciles de estabilizar en las corridas de las muestras. Mientras que FI genera iones con muy baja energía interna y casi nula fragmentación, la evaporación del analito antes de su ionización es la etapa crítica. Tabla 3. Iones producidos por FI Tipo de analito Iones positivos dominante // raramente detectado Iones negativos Dominante // raramente detectado Polaridad baja M +. // [M+H] + - Polaridad media M +. [M+H] + - Polaridad alta [M+H] + // M +. - Desorción de Campo (Field Desorption FD) La Desorción de Campo (Field Desorption FD) es un método de ionización muy suave utilizado en espectrometría de masas. Este método esta basado en el de Ionización de Campo (Field Ionization FI), FD ha sido desarrollado al combinar la desorción y la ionización del analito, pero no hay necesidad de evaporación antes de la ionización, generando iones con muy baja energía interna y casi nula fragmentación. En la Figura 6 se muestra un equipo de espectrometría de masas con una fuente de FD. Figura 6. Fuente de FD 11

12 Moléculas neutras son ionizadas principalmente por FI en el borde del campo del ánodo emisor, los cationes son desorbidos tal cual. Un alto voltaje de kv es aplicado al emisor causando polarización y finalmente ionización de las moléculas que están cerca de las puntas de las microagujas donde el campo eléctrico alcanza una enorme fuerza (Figura 7). Un ligero calentamiento de la muestra ayuda a mantener el equipo limpio al evitar su acumulación. Figura 7. Esquema general de ionización por FD Usualmente, se pasa una corriente de 50 ma sobre el emisor (un alambre de 10mm) o incluso hasta ma en emisores de 13mm. Esto incrementa la movilidad de las moléculas sobre la superficie del emisor, ayudando a la migración hacia las puntas de las agujas. El emisor puede resistir hasta 800 C. La muestra es introducida dentro de la fuente de iones por medio de una sonda directa que lleva el emisor de campo en su punta (Figura 8), el alambre activado entre las dos puntas de acero inoxidable es de 5mm de longitud. Este par de alfileres de acero están aislados eléctricamente mutuamente por medio de una pieza de cerámica. La sonda transfiere el emisor FD dentro de la muestra y se suministra un alto voltaje para la desorción/ionización y ocurre el calentamiento del emisor. Figura 8. Sonda y emisor de FD El emisor FD consiste de un alambre central de tungsteno de 10-13mm de diámetro. La activación a alta temperatura esta basada en una descomposición térmica de la superficie del alambre de tungsteno caliente al vacío. La activación crea miles de microagujas en la superficie del emisor (Figura 9). Figura 9. Supericie del emisor (80x80mm) La muestra es introducida como una solución (1 a 2 ml a mg/ml en solventes volátiles) hacia el emisor. Durante este proceso una solo gota colgante en la punta de una jeringa de un microlitro puede tocar la superficie del emisor, de otra manera se rompería el emisor (Figura 10). 12

13 Es preferible que la muestra sea soluble en solventes volátiles, se pueden analizar compuestos de baja o alta polaridad, inclusive es posible analizar mezclas de compuestos, aunque solo se pueden cuantificar compuestos puros. Si la muestra esta contaminada con sales inorgánicas puede ocurrir daño en los componentes del sistema. Se pueden analizar muestras de amu. Tipo de analito Figura 10. Proceso de montaje de una gota de 1.5ml sobre el emisor activado. La gota permanece en el alambre donde el solvente se avaporará para permitir tener solo una delgada capa de muestra. Tabla 4. Iones producidos por FD Iones positivos dominante // raramente detectado Polaridad baja M +. // [M+H] + M 2+ [2M] +. - Polaridad media M +. [M+H] + // [M+Cat] + M 2+ [2M+H] + [2M+Cat] + - Polaridad alta [M+H] + [M+Cat] + [2M+H] + [2M+Cat] + // M +. M 2+ [M-H] - // [M+An] - Iones K + A - K + [K n +A n-1 ] + // [KA] +. A - [A n +K n-1 ] - Cat: cationización por Li +, Na +, K +, y otros iones metálicos. An: anionización por Cl -, Br -, I -, HSO 4 -, y otros aniones. Iones negativos dominante // raramente detectado Bombardeo con Átomos Rápidos (Fast-Atom Bombardment FAB) Los métodos de desorción de partículas fueron desarrollados en los 70 s y 80 s, y a diferencia del método de desorción de campo (field desorption), evito complicaciones en diseño de equipo y preparación de la muestra. FAB es un método de ionización suave, resulta de la combinación de desorción del analito desde una fase condensada (mezcla de analito sólido+matriz) con su subsecuente ionización. La matriz esta formada de moléculas orgánicas (glicerol o 3-nitrobencil alcohol) que mantienen una superficie homogénea para el bombardeo. Ocurre el bombardeo de la muestra con átomos rápidos (Ar o Xe de 3-10 kev) o iones rápidos (Cs + arriba de 35 kev) (Figura 11). Si se utilizan iones rápidos la técnica se conoce también como liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS o liquidsims). En la práctica, no hay una diferencia significativa entre los espectros obtenidos por FAB o LSIMS. Figura 11. Sistema general de FAB El rayo primario de átomos rápidos es librado por una pistola de átomos rápidos (FAB gun) (Figura 12) o por una pistola de iones Cs + que utiliza un horno conteniendo CsI como fuente de Cs +. La pistola FAB esta localizada fuera de la fuente de iones, a través de ella pasa un flujo de Xe neutro, los iones Xe son generados 13

14 por EI. Los iones son acelerados, enfocados y neutralizados por intercambio de cargas con Xe neutro al haber colisión. El rayo de átomos pega con una gota de muestra y debido a colisiones y disrupciones se forman iones secundarios que son expulsados de la superficie de la muestra, los iones generados son acelerados y enfocados al analizador. Figura 12. FAB gun La muestra es introducida por medio de una sonda directa. Básicamente la sonda FAB consiste de una simple barra con un contenedor para la muestra donde se dirigen los átomos rápidos que soporta la gota de la solución de analito contenida en una matriz. Este contenedor de la muestra esta aislado eléctricamente. La función de la matriz es absorber energía de las partículas primarias que la impactan, actuar como solvente para el analito, refrescar la superficie de la gota y ayudar en el proceso de ionización, ya que puede ser aceptor/donador de protones o electrones. Para que una matriz lleve a cabo todas sus funciones es necesario que la muestra sea 100% soluble en ella, solo aquellos solventes con baja presión de vapor pueden ser usados fácilmente, el solvente debe tener una viscosidad suficientemente baja que permita la difusión de los solutos a la superficie, ser químicamente inerte. Las muestra que pueden ser analizadas por FAB deben ser altamente solubles, e incluso altamente polares (péptidos, oligosacáridos), ionicos (sales), o apolares (compuestos neutros, oligomeros sintéticos). FAB puede ser utilizado para detección directa de iones positivos o negativos. El rango de masa es desde 300 amu hasta 5000 amu, en compuestos de menor masa resultan algunas complicaciones en la detección de los picos del espectro y en moléculas mayores se presentan problemas en la desorción. Los iones secundarios generados pueden permanecer estables por varios minutos, ya que poseen baja energía interna y exhiben un bajo nivel de fragmentación. Tabla 5. Iones producidos por FAB Tipo de analito Iones positivos Iones negativos dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado Polaridad baja M +. // [M+H] + M -. // [M-H] - Polaridad media M +. [M+H] + // [M+Cat] + M -. [M-H] - Polaridad alta [M+H] + [M+Cat] + // M +. [M-H] - // [M+An] - M -. Iones K + A - K + [K n +A n-1 ] + // [KA] +. A - [A n +K n-1 ] - // [KA] -. Cat: cationización por Li +, Na +, K +, y otros iones metálicos. An: anionización por Cl -, Br -, I -, HSO 4 -, y otros aniones. Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI). La Ionización por Electrospray (ESI) es uno de los métodos de ionización mas recientemente desarrollados en espectrometría de masas. El diseño y operación de fuentes de ionización por electrospray usadas comúnmente en los espectrómetros de masas están basados en diseños descritos por Fenn y colaboradores en Este método es llevado a cabo a presión atmosférica a diferencia de otros métodos, por lo que se le conoce también como un método de ionización a temperatura ambiente (atmospheric pressure ionization API). ESI es 14

15 ampliamente utilizado en aplicaciones de ciencias bioquímicas y biomédicas debido a su capacidad de analizar moléculas altamente polares tales como péptidos, oligonucleótidos y oligosacáridos. En el proceso general de electrospray, que ocurre en la punta del emisor (capilar o aguja), una solución acuosa ácida o básica (dependiendo del la muestra) diluida del analito ( molar) es rociada desde la punta del emisor en el cual se aplica un potencial de 3-4 kv, la solución debe proveer conductividad eléctrica que puede ser obtenida por el uso de analitos iónicos o aditivos iónicos tales como buffers o por algún grado de disociación electrolítica del solvente. El líquido comienza a salir de la aguja, incrementa su carga y asume una forma cónica, llamada cono de Taylor, en honor a G.I. Taylor quien describió este fenómeno en 1964 (Figura 13). El líquido asume esta forma cuando incrementa su carga ya que una forma cilíndrica puede retener mas carga que una esfera. En la punta del cono, el líquido cambia de forma a una línea fina, que se vuelve inestable ya que es forzado a retener mas y más carga, y finalmente llega a un punto crítico donde no puede soportar mas carga eléctrica y la solución entonces se dispersa en forma de niebla de pequeñas gotas (de menos de 10 mm de diámetro) altamente cargadas que vuelan buscando una superficie de carga opuesta. Debido a que las gotas están altamente cargadas con la misma carga eléctrica se repelen fuertemente, las gotas vuelan y se dispersan cubriendo un área cada vez mayor y se van reduciendo de tamaño ya que las moléculas de solvente se evaporan en su superficie, y la distancia entre las moléculas cargadas disminuye dramáticamente. Si la gota no encuentra donde disipar su carga, las cargas eléctricas llegan a un estado crítico y la gota explota violentamente (Figura 14). Este proceso fue originalmente observado por el físico John Zelany en Figura 13. Cono de Taylor Figura 14. Reducción de tamaño de gota en ESI Aún no existe una explicación 100% aceptada de lo que le sucede a las gotas, pero algunas de las teorías son: 1. Modelo de Residuo Cargado (charged residue model) de Dole. Las gotas sufren repentinamente de explosiones coulombicas produciendo gotas más pequeñas y más pequeñas que finalmente contendrán solo una molécula cargada y quizá algunas moléculas de solvente. 2. Modelo de Evaporación Iónica (ion evaporation model) de Iribarne y Thomson. Ocurre la expulsión de moléculas cargadas para reducir la densidad de carga de la superficie. 3. La gota original sobrevive después de haber expulsado algunas micro gotas cargadas. De cualquier forma, el proceso termina con moléculas cargadas que pueden todavía llevar moléculas de solvente. El proceso de evaporación y rompimiento de gotas se repite hasta que el tamaño y carga de las gotas desorba moléculas protonadas dentro de la fase gaseosa, donde pueden ser dirigidas en el espectrómetro de masas por medio de campos eléctricos apropiados (Figura 15). El proceso de evaporación puede ser suplementado con un flujo de gas (típicamente nitrógeno) y calor. Figura 15. Proceso general de Ionización por Electrospray (ESI) Una característica de ESI es que debido a las condiciones ácidas usadas para producir las gotas cargadas positivamente se tienden a protonar todos los sitios básicos en las moléculas de analito. Una segunda característica de ESI es la eficiencia del proceso de ionización y, como resultado, la sensibilidad de los experimentos basados en esta forma de ionización, la eficiencia en la protonación de estos sitios básicos en 15

16 ambientes ácidos parece contribuir a la sensibilidad. Una tercera característica es su compatibilidad con los solventes de HPLC de fase reversa (reverse-phase high-performance liquid chromatography), ya que las mezclas agua/solvente tienen excelentes propiedades compatibles con ESI. Figura 17. Rociador (sprayer) de ESI y el orificio del capilar (0.4mm de ancho). La señal observada en el proceso ESI es proporcional a la concentración del analito en la solución que esta siendo rociada pero no a su velocidad de flujo. Esto es debido a que un incremento en la velocidad de flujo simplemente provoca tener que eliminar un mayor porcentaje de solvente, debido a que en muchas ocasiones se tienen muestras biológicas en un volumen pequeño y en poca cantidad, es preferible poder rociar un volumen extremadamente pequeño, por lo que a partir de ESI que maneja flujos de ml/min se han derivado el micro ESI que maneja una velocidad de flujo de 0.5-5ml/min y el nano ESI ml/min (Figura 17). Figura 17. ESI, microesi y nanoesi En dirección contraria, se han diseñado ESI asistidos neumáticamente, llamados Ion Spray (ISP) donde una corriente de gas inerte es aplicada en conjunto con un alto voltaje para ayudar al proceso de rociado de volúmenes grandes. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Esta técnica de ionización, comúnmente llamada MALDI, fue descrita por Karas y Hillenkamp en En este método de ionización los analitos son disueltos en una solución de un compuesto que absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrómetro de masas. Debido a que los solventes se van secando, los compuestos de la matriz cristalizan y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales (Figura 18). Figura 18. Proceso de Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) 16

17 Pulsos de láser de luz UV (3-5 ns, 337 nm, 10 7 W/cm 2 ) son utilizados para vaporizar pequeñas cantidades de la matriz donde se incluyen los iones del analito y llevados a fase gaseosa en el proceso (Figura 19). La ionización ocurre por protonación en el ambiente ácido producido por los compuestos de la matriz y por la adición de ácido diluido en la muestra. La protonación de péptidos es particularmente eficiente en ambientes ácidos, haciendo de MALDI, un método efectivo para producir péptidos protonados. Debido a que con la desorción por láser la producción de iones es discreta y es pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad. Figura 19. Laser UV Mientras que ESI es afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunos contaminantes. Cada pulso láser genera una pequeña cantidad de plasma que se expande en vacío, del cual se extraen los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de kv y controlados por medio de campos electromagnéticos. Debido a diferencias de velocidades que resultan de sus diferencias en masas los iones llegan al detector en diferentes tiempos. Los tiempos de vuelo son del rango de ms. Una muestra de 1 ml de la solución del analito o de la solución analito/matriz es aplicada en un contenedor y se seca, formando una capa delgada y cristalina. Los contenedores son de acero pulido, plata o cromo plateado (Figuras 20 y 21). Figura 20. Contenedor de plata para 10 muestras, cada pozo mide 23 mm de diámetro. Figura 21. Detalle del pozo 10 del contenedor. El rectángulo muestra el lugar donde impactará el láser. La línea blanca es un rasguño. La muestra aplicada es una solución en acetona que formo una capa cristalina. Se necesitan entre disparos del láser para evaporar la capa completamente. La función de la matriz es en primer lugar absorber la energía del láser. Por lo que las matrices para MALDI están formadas de compuestos aromáticos (Figura). La ionización del analito puede ser afectada por deprotonación, al aceptar o ceder un electrón, por unión de cationes o fotoionización, por lo que los iones generados por MALDI son de una amplia variedad de moléculas, ya que dependiendo de la combinación entre el analito y la matriz será el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido. 17

18 Figura 22. Compuestos utilizados en las matrices MALDI Tabla 6. Iones producidos por MALDI Tipo de analito Iones positivos Iones negativos dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado Polaridad baja M +. // [M+H] + M -. // [M-H] - Polaridad media M +. [M+H] + // [M+Cat] + [2M+H] + M -. [M-H] - // [2M-H] - MW > 3000: [M+nH] n+, n = 2, 3 MW > 3000: [M-nH] n-, n = 2, 3 Polaridad alta [M+H] + [M+Cat] + // [2M+H] + [2M+Cat] + [M-H] - // M -. [2M-H] - MW > 3000: [M+nH] n+, n = 2, 3 MW > 3000: [M-nH] n-, n = 2, 3 Iones K + A - K + // [K n +A n-1 ] + [KA] +. A - // [A n +K n-1 ] - [KA] -. Cat: cationización por Li +, Na +, K +, y otros iones metálicos. An: anionización por Cl -, Br -, I -, HSO 4 -, y otros aniones. Residuos de la matriz pueden formarse con todos los analitos dando: [M+H+matriz] +. 18

19 ANALIZADORES DE MASAS Todos los espectrómetros de masas combinan la formación de iones, el análisis de masas, y la detección de iones. Los analizadores de masas llevan a cabo la separación de los iones producidos por diferentes métodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) para que puedan llegar al detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th). En los experimentos de espectrometría de masas aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular, que es la molécula completa del analito, y fragmentos iónicos, los cuales contienen solo una parte de la estructura. El peso molecular de una molécula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la información estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de masas están disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magnético (magnetic sector), ciclotrón (ion cyclotron resonance) y otros. Cada tipo de analizador posee características y aplicaciones especiales, así como beneficios y limitaciones. La selección del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicación se le dará, el costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias características del resultado del experimento, entre estas la resolución y el rango de m/z de los iones que pueden ser medidos. Efecto de campos magnéticos sobre los iones Todos los analizadores de masas comúnmente usados utilizan campos eléctricos y magnéticos para aplicar una fuerza a partículas cargadas (iones). La relación entre fuerza, masa y los campos aplicados puede verse a través de la segunda ley de Newton y la ley de Lorentz. Segunda ley de Newton Ley de Lorentz F=ma F=e(E+vB) Donde, F= fuerza aplicada al ion, M= masa del ion, a= aceleración, e= carga iónica, E= campo eléctrico, vb= producto de la velocidad del ion y el campo magnético aplicado. De la segunda ley de Newton se observa que la fuerza aplicada causa una aceleración que es dependiente de la masa del ion, y la Ley de Lorentz indica que la fuerza aplicada es también dependiente de la carga del ion. Por lo tanto, los espectrómetros de masas separan los iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) y no solo a partir de la masa únicamente. Principios de los analizadores de masas Un analizador de masas es análogo al equipo utilizado en espectroscopia óptica para el análisis del contenido de color de luz visible. En espectroscopia óptica, se inicia con luz visible que esta compuesta de colores individuales (a diferentes longitudes de onda) que están presentes en diferentes intensidades. Un prisma separa la luz es sus diferentes longitudes de onda, y pequeña salida es usada para seleccionar cual longitud alcanza el detector. Las diferentes longitudes de onda son barridas o escaneadas al otro lado de la salida del detector y la intensidad de luz es registrada como una función del tiempo (longitud de onda) (Figura 23). En espectrometría de masas, se inicia con una mezcla de iones que tienen diferentes relaciones masa/carga y diferentes abundancias relativas. Campos electromagnéticos separan los iones de acuerdo a sus relaciones masa/carga, y una hendidura es usada para seleccionar cuales iones llegan al detector. Las diferentes relaciones masa/carga son entonces analizadas en la salida del detector y las corrientes de iones son registradas como una función del tiempo (figura 23). 19

20 Figura 23. Comparación entre espectrofotómetro y espectrómetro de masas Espectrómetro de masas de sector magnético (Magnetic Sector Mass Spectrometer) En un espectrómetro de masas de deflección magnética, los iones que llegan de la fuente de iones son acelerados a una gran velocidad. Los iones entonces pasan a través de un sector magnético (magnetic sector) en el cual se aplica un campo magnético en una dirección perpendicular al movimiento de los iones. Cuando se aplica aceleración perpendicular al movimiento de los iones, su velocidad permanece constante, pero se mueven en dirección circular, es por esto que el sector magnético tiene forma de arco, el radio y el ángulo del arco varían de acuerdo a diferentes diseños. Un sector magnético por si mismo es capaz de separar iones de acuerdo a su relación masa/carga, pero su resolución se ve limitada ya que no todos los iones que llegan de la fuente de iones tienen la misma energía ni la misma velocidad. Para tener una mejor resolución se añade un sector eléctrico (electric sector) que enfoca los iones de acuerdo a su energía cinética, esto se realiza aplicando una fuerza perpendicular a la dirección del movimiento de los iones, también en forma de arco. Figura 24. Espectrómetro de masas de sector magnético. La configuración de este aparato es también llamada de geometría reversa, ya que el sector magnético esta antes del sector eléctrico. La operación del espectrómetro de masas se logra manteniendo constantes el potencial de aceleración y el potencial del sector eléctrico y variando su campo magnético. Los iones que tienen una energía cinética constante, pero una relación m/z diferente son captados por el detector a diferentes fuerzas de campo magnético. La dependencia de la relación m/z sobre los campos eléctrico y magnético es deducida a partir de que todos los iones formados en la fuente de iones son acelerados a una energía cinética (T) de acuerdo a: 20

21 Despejando velocidad (v) tenemos: De la Ley de Lorentz, el campo magnético aplicado a una fuerza evb debe ser igual a la fuerza centrípeta mv 2 /r ya que los iones se mueven en un arco a través del sector: Substituyendo velocidad (v), se llega a la ecuación de trabajo aplicable al espectrómetro de masas de sector magnético: El sector magnético se mantiene constante usualmente a un valor en el cual pasen solo los iones que tengan una energía cinética específica, por lo que el parámetro que es variable es B, la fuerza del campo magnético. El campo magnético es generalmente analizado exponencialmente o linealmente para obtener el espectro de masas. El análisis de campo magnético puede ser usado para cubrir un amplio rango de m/z con una sensibilidad que es independiente de la relación masa/carga. Una alternativa es mantener B constante y analizar V. El potencial del sector eléctrico rastrea el voltaje, esto tiene la ventaja de que la relación m/z y el voltaje tienen una relación linear, pero una desventaja al analizar el voltaje es que la sensibilidad es proporcional a la relación m/z. El analizador de masas de sector magnético es un modelo clásico que posee varias ventajas: alta reproducibilidad, alto desempeño en análisis cuantitativos, alta resolución, sensibilidad y rango dinámico. Algunas limitaciones son que no pueden adaptarse a algunos métodos de ionización (por ejemplo: MALDI), costos mayores que otros analizadores. Son ampliamente usados en análisis de compuestos orgánicos, realizan mediciones exactas de masas, en cuantificación y en mediciones de isótopos. Espectrómetros de masas de cuadrupolo (quadrupole) El analizador de masas de cuadrupolo (quadrupole) es probablemente el analizador de masas mas utilizado, ya que además de su alto desempeño analítico combina facilidad de uso. Este tipo de analizador esta compuesto de cuatro barras organizadas paralelamente como dos grupos de dos barras conectadas eléctricamente (Figura 25). Una combinación de voltajes de radiofrecuencia (rf) y corriente directa (dc) son aplicados a cada par de barras, este arreglo simétrico permite producir campos hiperbólicos. Superficies diagonalmente opuestas están conectadas juntas a fuentes de voltajes rf y dc. Los iones se extraen de la fuente de iones y son acelerados (5-15 V) dentro del espacio central formado por el cuadrupolo a lo largo del eje longitudinal hacia el detector. Miller y Denton describieron el concepto de filtro de masas cuadrupolo como la combinación o superposición de filtros de pase bajo y pase alto. Al menos para iones relativamente ligeros (<300 Da), el análisis m/z no es afectado por la estructura del ion. Figura 25. Analizador cuadrupolo (quadrupole) El filtro cuadrupolo m/z es examinado al modificar la magnitud de la amplitud de voltaje de rf y manteniendo dc a una proporción fija. El poder de resolución es establecido por la relación de los voltajes rf y dc. Las trayectorias de los iones a través del espacio central de las barras es complicado, y para cada par de voltajes dc y rf solo iones de un valor m/z específico evitaran colisionar con las barras y pasaran el filtro cuadrupolo a través del eje Z hasta alcanzar el detector, todos los demás iones chocarán con las superficies del cuadrupolo a 21