ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

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1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: Website: M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 Kit ELISA para la determinación cuantitativa de las subclases de IgG humano en suero (es) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL es Anticuerpos contra Preto Tampón Calibrador Conjugado Control DIL GREEN HRP HUM HO MOU es Dilución Verde HRP Humano Peróxido de hidrógeno Murino RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS es Rojo Cierres de placa Stock Parar Subclases Substrato WASH WELL YELLOW es Lavado Pocillos Amarillo Rango ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 es I. INTRODUCCIÓN Las IgG humanas comprenden cuatro subclases: IgG, IgG, IgG e IgG. Las características bioquímicas de las subclases de IgG han sido descritas exhaustivamente (5). Las diferencias entre las subclases de IgG se reflejan en diferentes funciones biológicamente importantes tales como el reconocimiento de antígeno, la activación de complemento y la unión a receptores de superficie celular. Numerosos estudios han revelado que las anomalías en los niveles en suero de las subclases de IgG posiblemente están asociadas con diferentes estados patológicos. En especial ha sido ampliamente documentada la asociación de la deficiencia selectiva de la subclase IgG con una mayor susceptibilidad a infecciones virales o bacterianas (, 5). En pacientes con infecciones recurrentes de las vías respiratorias superiores e inferiores se han observado niveles bajos en suero de IgG o IgG. En otros casos se ha establecido una asociación entre las concentraciones muy bajas en suero de IgG y las infecciones sinopulmonarias recurrentes (). Asimismo se han observado anomalías en los niveles en suero de las subclases de IgG en enfermedades autoinmunes, trastornos neurológicos e infecciones por VIH (). II. PRINCIPIO TÉCNICO El kit ELISA PeliClass para subclases humanas es un inmunoensayo enzimático tipo sandwich. El kit contiene tiras de micropocillo recubiertas con anticuerpos monoclonales muy ávidos, cada uno específico para una de las subclases de IgG humano. Las muestras de análisis y los sueros de calibración y control son incubados en los pocillos correspondientes. La subclase de IgG a determinar se unirá a la fase sólida y el IgG no unido se elimina mediante lavado. A continuación se añade antisuero IgG antihumano conjugado con peroxidasa a cada pocillo y el conjugado no unido se elimina mediante lavado. Después de la incubación con solución de substrato (ABTS) y HO, la reacción se detiene con tampón ácido. El producto de reacción de color verde es medido mediante absorbencia y la concentración de subclase de IgG en la muestra de análisis es calculada comparándose con los valores de la curva de calibración. El suero de control de las subclases de IgG es ensayado para controlar la validez de las curvas de calibración y la exactitud de las determinaciones de las subclases de IgG. Los niveles de las subclases de IgG en el calibrador fueron determinados empleando un calibrador derivado de la preparación de referencia de la OMS 7/97. Se usaron los valores meta recomendados de 5,0 g/l para IgG,, g/l para IgG, 0, g/l para IgG y 0,5 g/l para IgG (7). III. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Guardar el kit ELISA PeliClass para subclases humanas en posición vertical a 8 C. Puede usarse hasta la fecha de vencimiento indicada en la etiqueta. La estabilidad de todos los componentes después de su apertura es de semana, siempre y cuando se almacene a 8 C. Las condiciones de transporte pueden diferir de las condiciones de almacenamiento. IV. CONTENIDO DEL KIT Ver la Tabla al principio de este anexo en el embalaje. El kit ELISA PeliClass para subclases humanas contiene reactivos suficientes para 8 análisis para cada subclase, incluidos calibradores, controles y blancos. Los anticuerpos monoclonales fueron purificados de medio de cultivo de tejido, usando cromatografía de columna (intercambio iónico y cromatografía de afinidad). El calibrador y control son sueros líquidos humanos. V. MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS Agua destilada para dilución de los tampones de lavado, dilución y substrato. Equipo de pipetaje para dosificar volúmenes de forma precisa. Una incubadora (7 ± C). Una lavadora estándar ELISA o una botella rociadora de plástico de 500 ml para el lavado automático o manual de las tiras. Un lector estándar ELISA para la medición de la absorbencia a nm o 05 nm. Papel linear logarítmico. VI. MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ANÁLISIS Sólo deben analizarse muestras de suero. Las muestras han de ser lo más frescas posibles, o conservadas congeladas. Las muestras deben diluirse manualmente antes de su uso (ver VII PROTOCOLO DE ENSAYO). VII. PROTOCOLO DE ENSAYO Llevar todos los reactivos a temperatura ambiente (85 C) y mezclar bien. Evitar la formación de burbujas o espuma. Se recomienda analizar todas las muestras, controles y diluciones del calibrador por duplicado.. PLACA MICROTITER El kit ELISA PeliClass para subclases de IgG humano ofrece la posibilidad de usar placas parciales en diferentes ocasiones. Antes de abrir la bolsa de plástico, determinar el número de tiras requeridas para analizar el número deseado de muestras, más pocillos que se necesitan para realizar las calibraciones, controles y blancos por duplicado. Quitar las tiras que no se usarán del marco para placa y colocarlas de nuevo en la bolsa de plástico con desecante, y almacenar a 8 C.. SOLUCIONES DE TAMPÓN Tampón de lavado: Preparar el tampón de lavado añadiendo el contenido completo de la botella del concentrado de tampón de lavado a 950 ml de agua destilada. El tampón de lavado diluido debe guardarse a 8 C y permanece estable durante semana. Observación: El tampón concentrado puede contener cristales de sal. Antes de preparar el tampón de carga de trabajo, calentar el tampón concentrado POR POCO TIEMPO a 7 C para disolver los cristales. Tampón de dilución: Calcular la cantidad de tampón de dilución requerida (aproximadamente ml de tampón sin diluir por tira de micropocillo) y preparar una solución de carga de trabajo diluyendo el tampón en una proporción diez veces mayor en agua destilada.. PREPARACIÓN DEL CALIBRADOR Y DE LOS SUEROS DE CONTROL Para concentraciones ver la Tabla y del folleto de información adjunto. Calibrador: (Ver tabla del folleto de información adjunto) Etiquetar un tubo de 0 ml con ':500' y ocho tubos de ml con 'Cal a Cal8' respectivamente. Pipetar,99 ml del tampón de dilución en el tubo de 0 ml y añadir 0 µl del suero del calibrador (dilución inicial :500). Pipetar,9 ml del tampón de dilución en el tubo etiquetado con 'Cal' y,0 ml en los tubos etiquetados con 'CalCal8'.

3 Pipetar 00 µl del calibrador diluido :500 al tubo Cal, y hacer con este tubo siete diluciones seriales dobles añadiendo,0 ml de la dilución anterior al siguiente tubo 'Cal'. Seleccionar para cada subclase de IgG las series de diluciones del calibrador: IgG : : IgG, IgG e IgG :0.000 : Control: Etiquetar un tubo con ':500', y dos tubos de ml con ':0.000' (para IgG,, ) y ':0.000' (para IgG) respectivamente. Pipetar en el tubo etiquetado con :500,99 ml de tampón de dilución y 0 µl de suero de control. Pipetar en el tubo etiquetado con : µl de tampón de dilución y 5 µl de dilución :500. Pipetar en el tubo etiquetado con : µl de tampón de dilución y 5 µl de dilución : Preparar un tubo de ml con ml de tampón de dilución como blanco.. PREPARACIÓN DE MUESTRAS Diluir las muestras de análisis con el tampón de dilución según el mismo protocolo que para el suero de control. Si los resultados no se encuentran dentro de los rangos indicados (ver la Tabla del folleto de información adjunto), debe repetirse el análisis con una dilución diferente. 5. PRIMER PASO DE LAVADO Lavar los micropocillos requeridos en el marco para placa cuatro veces con tampón de lavado. Para lavado manual, llenar completamente los pocillos con tampón de lavado (> 00 µl) y desechar, repetir tres veces este procedimiento. Al final los pocillos deben quedar completamente vacíos. Añadir inmediatamente el reactivo subsiguiente, no dejar que los pocillos permanezcan secos durante un tiempo prolongado.. PRIMER PASO DE INCUBACIÓN Añadir 00 µl de los calibradores, controles, muestras y blancos diluidos en los pocillos correspondientes. Cubrir la placa con un cierre adhesivo, agitar suavemente dando golpecitos en el borde de la placa microtiter durante unos segundos para mezclar los contenidos de cada pocillo. Incubar durante hora a 7 C. Justo antes del lavado, preparar el siguiente reactivo para incubación tal como se describe en el punto SEGUNDO PASO DE LAVADO Aspirar el sobrenadante de los pocillos y lavar la placa tal como se describe en el punto INCUBACIÓN CON ANTICUERPO CONJUGADO HRP CON IgG HUMANO Diluir el conjugado :500 pipetando 0 µl del conjugado en,97 ml de tampón de dilución. Diluir el conjugado además: :000 pipetando, ml de la dilución :500 en,0 ml de tampón de dilución. :000 pipetando,0 ml de la dilución :500 en,0 ml de tampón de dilución. :000 pipetando,5 ml de la dilución :500 en,5 ml de tampón de dilución. Añadir: 00 µl de la dilución :500 a las tiras de micropocillo antiigg; 00 µl de la dilución :000 a las tiras de micropocillo antiigg; 00 µl de la dilución :000 a las tiras de micropocillo antiigg; 00 µl de la dilución :000 a las tiras de micropocillo antiigg. Cubrir la placa con un cierre adhesivo, agitar suavemente dando golpecitos en el borde de la placa microtiter durante unos segundos para mezclar los contenidos de cada pocillo. Incubar durante hora a 7 C. Justo antes del lavado, preparar el siguiente reactivo para incubación tal como se describe en el punto TERCER PASO DE LAVADO Aspirar el sobrenadante de los pocillos y lavar la placa tal como se describe en el punto INCUBACIÓN CON SUBSTRATO ABTS Calcular la cantidad de solución de substrato (se requiere aproximadamente 0,9 ml por cada tira de micropocillo). Añadir los equivalentes de 00 µl de solución patrón de peróxido de hidrógeno y 00 µl de solución patrón de ABTS a 0 ml de tampón de substrato de carga de trabajo ( ml de solución patrón de substrato + 8 ml de agua destilada). Añadir 00 µl de solución de substrato a todos los pocillos. Agitar suavemente dando golpecitos en el borde de la placa microtiter durante unos segundos para mezclar los contenidos de cada pocillo. Incubar durante 0 minutos a temperatura ambiente (85ºC).. DETENER LA REACCIÓN ENZIMÁTICA Añadir 50 µl de solución de paro a todos los pocillos.. LECTURA DE PLACA Leer dentro de hora a (preferentemente) o 05 nm en un lector ELISA. VIII. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS Registrar la absorbencia a (preferentemente) o 05 nm para cada pocillo y calcular la media de los valores duplicados. En cada muestra, los duplicados no deben diferir más del 5% del valor medio. Si la variación de los duplicados es superior, repetir el ensayo. Determinar los valores medios de absorbencia de los calibradores (eje y) frente a la concentración de subclase en ng/ml (eje x) en papel linear logarítmico y trazar la curva correspondiente. Los niveles de las subclases de IgG en el suero de control deben encontrarse dentro de los rangos indicados en la Tabla del folleto de información adjunto. Interpolar el valor medio de absorbencia para cada muestra en la curva de calibración. Las muestras de análisis que muestran un valor medio de absorbencia fuera de los rangos de dilución de la curva de calibración, deben diluirse de manera apropiada. Para una evaluación de la concentración de subclases de IgG en una muestra de análisis, comparar los niveles hallados con valores normales de subclases de IgG (ver X VALORES DE REFERENCIA). IX. VALORES DE ENSAYO Consultar la Tabla del folleto de información adjunto para los valores de ensayo específicos del kit.

4 X. VALORES DE REFERENCIA Valores de referencia (g/l) para las subclases de IgG en muestras de suero de sujetos caucásicos sanos (8). Para otras poblaciones deben obtenerse valores de referencia por separado. Edad IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE FUNCIONAMIENTO Reproducibilidad concentración de subclases de IgG IgG IgG IgG IgG variación intraensayo (%) variación intraensayo (%) 7 7 b Comparación del kit PeliClass para subclases de IgG humano con Mancini. Las concentraciones de IgG, IgG, IgG e IgG en sueros fueron determinadas mediante un ensayo ELISA y comparadas con los valores correspondientes hallados en Mancini. Se establecieron las siguientes correlaciones: subclase de IgG línea de regresión linear correlación IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Observación: Los valores mencionados para las características específicas de funcionamiento representan resultados típicos y no deben considerarse como especificaciones para este kit. XII. RESTRICCIONES. El usuario debe estar capacitado y familiarizado con los ensayos ELISA y el procedimiento de análisis.. No deben usarse muestras extremadamente hemolizadas o lipémicas. Pueden surgir resultados inesperados con muestras que contienen el factor reumatoide, elevados niveles de bilirrubina u otros complejos inmunes circulantes. Estas muestras deben analizarse mediante otro método.. Las muestras que se encuentran fuera de los rangos de valores, por ejemplo en el caso de paraproteínas, deben analizarse de nuevo con diferentes diluciones.. La obtención de un nivel reducido de una de las subclases de IgG nunca puede proporcionar un diagnóstico seguro, sino que debe considerarse más bien como un indicio de una alteración en el sistema inmune, que requiere un análisis diagnóstico adicional. 5. Usar siempre los sueros de control para controlar la validez de las curvas de calibración. Cuando el resultado se encuentra fuera de los rangos de valores indicados, los resultados de las muestras de análisis no son fiables. Debe repetirse el análisis.. Los reactivos de diferentes lotes no son intercambiables. 7. Los restos de reactivos (p.ej. volumen muerto) no deben mezclarse con el contenido de viales que se acaban de abrir. 8. Los tapones y viales no son intercambiables. Los tapones deben colocarse en los viales correspondientes. 9. A pesar de que los sueros humanos de calibración y control han sido analizados para descartar la existencia de marcadores de agentes específicos transmisores de enfermedades de acuerdo con las directrices vigentes de la UE sobre GMP y resultaron ser no reactivos, todos los componentes de origen humano deben considerarse como potencialmente infecciosos. 0. Conservante: Thiomersal 0,00%.. Usar nuevos cierres de placa para cada paso de incubación/fijación en el experimento ELISA para evitar contaminación cruzada. No usar papel de aluminio.. Usar puntas de pipeta desechables para cada transferencia para evitar contaminación cruzada.. Cada vez que se usa el kit, hacer diluciones frescas de los calibradores, conjugado y tampones.. No usar otros reactivos y tiras de micropocillo que los suministrados con el kit. 5. Ázida de sodio inactiva la HRP, no usar soluciones que contienen ázida de sodio, ni añadir ázida de sodio a los tampones suministrados.. La eliminación de residuos debe realizarse conforme a las regulaciones de su laboratorio.

5 XIII. REFERENCIAS. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5

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