Plasma Renin Activity Kit Elisa

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1 Plasma Renin Activity Kit Elisa KAPDB4600 DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

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3 Plasma Renin Activity Elisa Kit Para la detección cuantitativa de la Actividad de la Renina Plasmática (PRA) en plasma humano por inmunoensayo enzimático. KAPDB4600 DIAGNOSTICO IN VITRO ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium - Tel: Fax : es INTENCION DE USO Para la detección cuantitativa de la Actividad de la Renina Plasmática (PRA) en plasma humano por inmunoensayo enzimático. Únicamente para uso in vitro. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Este kit mide la PRA y los resultados son expresados en términos de masa de Angiotensina-I (Ang-I) generada por volumen e plasma humano en unidad de tiempo (ng/ml.h). La muestra de sangre es recolectada en un tubo que contiene EDTA. El plasma es separado, bien almacenado congelado o puede mantenerse a temperatura ambiente para su uso inmediato. Las muestras no deben ser enfriadas en hielo o almacenadas a temperaturas de entre 0 y 10 C durante la recolección o su procesamiento antes de ajustar el ph, esto podría llevar a una sobreestimación de la actividad de la renina. Antes de iniciar el inmunoensayo un inhibidor de la proteasa y un tampón de generación son adicionados a la muestra de plasma, la cual va a prevenir la Angiotensina-I (Ang-I) en el plasma de la degradación. El ph de la muestra de plasma es dividido en dos y las fracciones son incubadas de 0-4 C (en baño de hielo) y a 37 o C respectivamente por 90 minutos o más, para permitir la generación de Ang-I por la renina en plasma a 37 C. Opcionalmente, el ph puede ser ajustado a 6.5 o 7.4. El ajuste del ph es un paso crítico durante el ensayo, la acidificación del plasma a ph 3.3 o menos por un tiempo prolongado con regreso a ph neutral causa activación irreversible de la renina (Derkx et al., 1987), por otro lado, la incubación a un ph superior a 8.0 puede destruir la renina. Durante la incubación del inmunoensayo, otro conjunto de inhibidores de proteasas están involucrados, que funcionan para detener la nueva generación, así como la degradación de la Ang-I a péptidos más pequeños. El inmunoensayo de Ang-I es un ensayo competitivo que utiliza dos incubaciones, con un tiempo de incubación total de ensayo de menos de dos horas. Durante la primera incubación la Ang-I sin marcar (presente en los estándares, controles y muestras de plasma) compiten con la Ang-I biotinilada para unirse al anticuerpo anti-ang-i. En la segunda incubación el conjugado de Estreptavidina-HRP marcado, se une a la Ang-I-Biotina inmovilizada. Los procedimientos de lavado y decantación remueven los materiales que no se han unido. El sustrato colorimétrico HRP es adicionado y, después se detiene la reacción de desarrollo de color, la absorbancia (DO) es medida en un lector de microplacas. Los valores de absorbancia son inversamente proporcionales a la concentración de Ang-I en la muestra. Un juego de calibradores son utilizados para trazar la curva estándar de las concentraciones de Ang-I en donde las muestras y controles pueden ser leídos directamente. APLICACIONES CLÍNICAS La medición de PRA es importante para la evaluación clínica de pacientes hipertensos. En particular, la determinación de la actividad de Renina Plasmática puede ayudar al diagnóstico de hiperaldosteronismo (5-13% de los casos de hipertensión) y asiste en la terapia y manejo de otras formas de hipertensión. La renina libera la angiotensina-i a partir de angiotensinógeno. La Angiotensina-I es transformada a angiotensina-ii en gran medida en la circulación pulmonar por la enzima convertidora de angiotensina (ACE). La angiotensina II aumenta la presión arterial por vasoconstricción arteriolar directa, retención de sodio, y la estimulación de la secreción de aldosterona por la corteza suprarrenal. La aldosterona también ejerce un efecto de restablecer el equilibrio de sodio y elevar la presión arterial. La medición exacta de la concentración de circulación de angiotensina II es un reto debido a su inestabilidad en muestras de sangre. La concentración de aldosterona se puede determinar fácilmente utilizando el kit de inmunoensayo DIAsource (KAPDB450). PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DEL PROCEDIMIENTO 1. Los usuarios deben tener una comprensión profunda de este protocolo para el correcto aprovechamiento de este kit. Un rendimiento fiable sólo se logrará mediante la adhesión estricta y cuidadosa a las instrucciones proporcionadas. 2. La Ang-II actualmente no se incluye en todos los esquemas de control de calidad externos. Por lo tanto, se sugiere que cada laboratorio establezca sus propios materiales de control de calidad internos y el procedimiento para la evaluación de la fiabilidad de los resultados. 3. Cuando requiera agua para realizar diluciones específicas o reconstituir, utilice agua destilada o desionizada. 4. Todos los reactivos del kit y muestras deben estar a temperatura ambiente y mezcladas antes de su uso. Evitar la congelación y descongelación repetidas de los reactivos y las muestras de plasma. 5. Se debe establecer Una curva de calibración para cada corrida. Los controles del kit deben ser incluidos en cada corrida y deben estar dentro de los límites de confianza establecidos. 6. No mezcle componentes de kits de diferentes lotes y no utilice algún componente después de vencida la fecha impresa en la etiqueta. 7. El sustrato (TMB) es sensible a la luz por lo que debe almacenarse en botellas oscuras y alejas de la luz directa del sol. 8. Para prevenir la contaminación de los reactivos, utilice puntas desechables de pipeta para dispensar cada reactive, muestra, estándares y controles. 9. Técnicas de procedimiento incorrectas, pipeteos imprecisos, lavados incompletos, así como almacenamiento inadecuado de reactivos puede generar que los valores para los controles no reflejen los rangos establecidos. El rendimiento de este ensayo se ve marcadamente influenciada por la correcta ejecución del procedimiento de lavado! LIMITACIONES 1. Este kit está específicamente diseñado y validado para la determinación de la actividad de la renina plasmática/ generación de Ang-I en plasma con EDTA. Otros usos del material deben ser validados antes de ser aplicado. 2. En nivel de Ang-I depende de multiples factores, incluyendo la actividad de la renina, la concentración de sustrato de renina, el ph del plasma, la temperatura y selección de inhibidores. Por lo tanto, las muestras de plasma deben ser preparadas cuidadosamente para que la prueba sea adecuada. 3. La contaminación bacteriana, los ciclos de congelación y descongelación repetidos y dilución de muestras de plasma pueden afectar el resultado del ensayo. 4. Para la interpretación de los resultados deben tenerse en cuenta las condiciones que pueden afectar la secreción de renina, como la ingesta de sodio y de potasio, la postura, los medicamentos como los diuréticos, clonidinea, beta-bloqueadores, estroprogestogenos y vasodilatadores periféricos. 5. No procese muestras hemolisadas, lipémicas, ictéricas, y muestras que no se manipulen adecuadamente de acuerdo con la instrucción. 6. Los resultados obtenidos con este kit no deben ser utilizados como única base para hacer un diagnóstico. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos heterófilos en pacientes regularmente expuestos a animales o productos de animales tienen un riesgo potencial de causar interferencias en las pruebas inmunológicas. Consecuentemente, el diagnóstico clínico debe incluir todos los aspectos y antecedentes del paciente, incluyendo la frecuencia de exposición a los productos de origen animal si se sospecha resultados falsos. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS DE SEGURIDAD MATERIAL POTENCIALMENTE BIOPELIGROSO Todos los reactivos de este kit deben ser considerados un peligro biológico potencial y manipulados con las mismas precauciones que se aplican a cualquier muestra de sangre. Las muestras de plasma humano deben ser manipulados como si fueran susceptibles de transmitir infecciones y de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. RIESGOS QUIMICOS Evitar el contacto con reactivos que contienen PMSF, TMB, peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico. Si entra en contacto con cualquiera de estos u otros reactivos de este kit, lavar con abundante agua. TMB es un carcinógeno.

4 REACTIVOS Y EQUIPO NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO 1. Tubos de recolección de sangre con EDTA Disodico (2 mg/ml sangre) 2. Pipetas automáticas y puntas desechables 3. Agua destilada o desionizada 4. Tubos de prueba desechables - 12 x 75mm. 5. Rotador 6. Lector de micropozos con filtro 450 nm filter. 7. Incubadora 37 C. 8. Baño de hielo. 9. Etanol al 95% REACTIVOS SUMINISTRADOS Preparación: Preparación: Tampón de generación Tampón y antibiótico no tóxico. 5 ml/botella Solución PMSF Requiere preparación Una botella contiene Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Reconstituir por adición de 0.5 ml de etanol 95% a la botella y mezclar en vortex por 2 minutos hasta que esté completamente disuelto el PMSF. Refrigerar después del primer uso, mezcle en el vortex nuevamente para redisolver el contenido. No mantenga el frasco abierto innecesariamente. Placa de micropozos recubierta de anticuerpo de conejo Anti-Ang-I Dos placas de 96 micropozos pre-recubiertos en un empaque resellable con desecante. Conjugado Angiotensina-I-Biotina Una botella que contiene buffer, inhibidores de proteasa, conjugado Angiotensina-I-Biotina y un preservante libre de mercurio. 30 ml/botella Conjugado concentrado de Estreptavidina- Peróxido de rábano Requiere preparación Conjugado de Estreptavidina-HRP en un tampón con un preservante libre de mercurio 0.5 ml/vial Diluir el conjugado concentrado 1:100 en tampón de ensayo antes de usar. La solución de trabajo del conjugado es estable por 8 horas, descarte la solución no usada durante este periodo. Calibradores Angiotensina-I Ocho viales que contienen péptido sintético Angiotensina-I en un tampón basado en proteína con un preservante libre de mercurio. Los calibradores son calibrados contra un reactivo de referencia de la Organización Mundial de la Salud NIBSC código 86/536. Concentraciones de calibrador*: 0, 0.2, 0.5, 1.5, 4, 10, 25, 60 ng/ml. *Valor aproximado por favor verifique en la etiqueta del vial la concentración exacta de cada calibrador. Preparación: Calibrador A: 2 ml/vial Calibradores B-H: 0.7 ml/vial Controles Dos viales que contienen Angiotensina-I en un tampón basado en proteína con un preservante libre de mercurio. Verifique en la etiqueta el rango aceptable. 0.7 ml/vial Tampón de ensayo Una botella que contiene un tampón basado en proteína con un preservante libre de mercurio. Verifique en la etiqueta el rango aceptable. 40 ml/botella Tampón de lavado concentrado Requiere preparación Dos botellas que contienen tampón con un detergente no iónico y un preservante libre de mercurio. 50 ml/botella Diluir 1:10 en agua destilada o desionizada antes de usar. Si una placa completa va a ser usada debe diluir 50 ml de Tampón de lavado concentrado en 450 ml de agua. Sustrato TMB Una botella contiene Tetrametilbenzidina y Peróxido de Hidrógeno en un buffer no-dmf o DMSO. 32 ml/botella Solución de parada Una botella contiene Ácido Sulfúrico 1M. 12 ml/botella RECOLECCION DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO Un mínimo de 0.5 ml de plasma se requiere para la determinación por duplicado. Es esencial realizar una adecuada recolección de la muestra para una determinación precisa de Angiotensina-I. La generación in-vitro y degradación de la Angiotensina-I puede ser minimizada siguiendo este procedimiento: 1. Recolecte 2 ml de sangre en un tubo con EDTA por venopunción. 2. Centrifugue la sangre durante 15 minutos a 5000 rpm a temperatura ambiente. 3. Transfiera el plasma de la muestra a un tubo de vidrio de prueba a temperatura ambiente. 4. Si las muestras van a ser procesadas inmediatamente inicie el procedimiento de generación de Angiotensina-I, de lo contrario congele las muestras inmediatamente a -20 C o menos. Evite los ciclos de congelamiento y descongelamiento de muestras.

5 OD (450 nm) PROCEDIMIENTO DE GENERACION DE ANGIOTENSINA-I 1. Si una muestra de plasma recién extraída está siendo utilizada continúe con el paso 2. Si se utilizan muestras de plasma congeladas descongelar de la siguiente manera. Llevar rápidamente muestras de plasma congeladas a temperatura ambiente mediante la colocación de los tubos en un recipiente con agua a temperatura ambiente. 2. Transfiera 0.5 ml de la muestra de plasma dentro del tubo de ensayo de vidrio. 3. Adicione 5 µl de la solución PMSF a los 0.5 ml de la muestra de plasma (relación 1:100). Mezcle bien el tubo en el vortex. 4. Adicione 50 µl del tampón de generación a la muestra tratada del paso 3 (proporción 1:10). Mezcle bien el tubo en el vortex. 5. Divida la muestra tratada del paso 4 en dos alícuotas iguales transfiriendo 0.25 ml dentro de dos tubos de ensayo de vidrio. Incubar una alícuota durante 90 minutos o más a 37 C, ubique la segunda alícuota en un baño de hielo (0 C). Asegúrese de registrar el tiempo de incubación utilizado para las alícuotas ya que será necesario para los cálculos. 6. Al finalizar el tiempo de incubación ubique la alícuota de 37 C en el baño de hielo por 5 minutos para que se enfríe rápidamente. 7. Lleve dos alícuotas a temperatura ambiente mediante la colocación en un baño con agua a temperatura ambiente durante 5-10 minutos (no superior a 10 minutos). PROCEDIMIENTO DE PRUEBA 1. Deje que todos los componentes del kit estén a temperatura ambiente. Retirar el número necesario de tiras y montar en el marco de la placa. 2. Pipetear 50 µl de cada calibrador, control y muestra de plasma tratada (ambos alícuotas 37 C y 0 C) en los pocillos correspondientemente marcados por duplicado. 3. Pipetee 100 µl de conjugado Angiotensina-I-Biotina dentro de cada pozo (se recomienda el uso de una pipeta multicanal). 4. Incubar en un rotador de placas ( 200 rpm) durante 60 minutos a temperatura ambiente. 5. Lave los pozos 5 veces cada tiempo con 300 µl/pozo de tampón de lavado diluida. Después del lavado de la placa golpee firmemente contra un papel absorbente para remover cualquier residuo líquido (el uso de un lavador automático es altamente recomendado). El rendimiento de este ensayo está marcadamente influenciado por la correcta ejecución del procedimiento de lavado. 6. Pipetee 150 µl de la solución de trabajo del conjugado Estreptavidina- HRP dentro de cada pozo (se recomienda el uso de una pipeta multicanal). 7. Incubar en un rotador de placas ( 200 rpm) durante 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Lave los pozos 5 veces con el mismo procedimiento del paso Pipetee 150 µl del sustrato TMB dentro de cada pozo (se recomienda el uso de una pipeta multicanal). Incubar en un rotador de placas ( 200 rpm) durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. 10. Adicione 50 µl de solución de parada a cada pozo y mezclar bien golpeando suavemente la placa. 11. Mida la absorbancia a 450 nm en todos los pozos con un lector de microplaca entre los 0-20 minutos después de la adición de la solución de parada. CALCULOS 1. Utilizando un software de inmunoensayos, elegir una curva ya sea un parámetro 4 o 5 para el cálculo de resultados. 2. Si la muestra registra una lectura de más de 60 ng/ml, dilúyala con el calibrador 0 a una dilución no mayor de 1:10 y reanalice la muestra. El resultado obtenido debe ser multiplicado por el factor de dilución. 3. Calcule la actividad de la renina plasmática (PRA) en cada muestra utilizando la siguinete ecuación: PRA = [Ang-I (37 C)] [Ang-I (0 C)] Tiempo (hrs) x 1.11 TABULACION DE DATOS Datos de ejemplo solamente. No utilizar para calcular los resultados Calibrador DO media (450 nm) Ang-I (ng/ml) CURVA DE CALIBRACION TIPICA Curva de ejemplo solamente. No utilizar para calcular los resultados Angiotensin I (ng/ml) CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO SENSIBILIDAD El límite de detección bajo es calculado de la curva de calibración por determinación de la concentración resultante de la DO media del calibrador 0 (basado en el análisis de 14 replicados) menos 2 DS. Por lo tanto la sensibilidad del kit DIAsource PRA ELISA es ng/ml de Angiotensina-I. ESPECIFICIDAD (REACCION CRUZADA) Los siguientes componentes fueron probados para reactividad cruzada usando el método Abraham con reactividad a la Angiotensina-I al 100%: Antígeno Secuencia Angiotensina-I DRVYIHPFHL 100 Angiotensina 1-9 DRVYIHPFH Angiotensina-II DRVYIHPF <0.001 Angiotensina-III RVYIHPF <0.001 Angiotensina 1-5 DRVYI <0.001 Sustrato renina humana DRVYIHPFHLVIHN % Reactividad cruzada Donde tiempo (hrs) es el tiempo de incubación utilizado durante el paso de generación.

6 RECUPERACION Muestras enriquecidas se prepararon mediante la adición de cantidades definidas de la angiotensina-i a tres muestras de plasma de pacientes. Los resultados (en ng / ml) se tabulan a continuación: Muestra Resultado observado Resultado esperado %Recuperación 1.No enriquecida No enriquecida No enriquecida LINEARIDAD Tres muestras de plasma de pacientes fueron diluidas con el calibrador 0. Los resultados (en ng/ml) se tabulan a continuación: Resultado Resultado Muestra % Recuperación observado esperado : : : : : : : : : : : : INTERFERENCIA La prueba de interferencia fue realizada de acuerdo a la guía CLSI EP7-A2. Las muestras de plasma con diferentes niveles de Angiotensina-I fueron enriquecidas con sustancias potencialmente interferentes y se analizaron. Los resultados fueron comparados con las mismas muestras de plasma sin adicionar las sustancias para calcular el % de interferencia. Interferencia (%)= [Ang I(muestra enriquecida)] [Ang I (muestras nativas)] X 100 [Ang I (muestra nativa)] Interferente Hemoglobina Bilirrubina no conjugada Bilirrubina Conjugada* Hemoglobina + Bilirrubina Concentración de interferente adicionado 1 g/ L g/l µm (12 mg/l) µm (300 mg/l) 0 20 µm (16 mg/l) µm (400 mg/l) g/l + 20 µm g/l µm g/l + 20 µm g/l µm % Interferencia Triglicéridos 3.7 mm +4.8 (2C-10 C) 37 mm Triglicéridos 3.7 mm -0.6 (8C-16 C) 37 mm +2.2 HSA *Taurobilirubina 40 g/l g/l -9.6 PRECISION INTRA-ENSAYO Cuatro muestras fueron analizadas 14 veces cada una con la misma curva de calibrador. Los resultado (en ng/ml) se tabulan a continuación: Sample Mean SD CV% INTER-ASSAY PRECISION Four samples were assayed in ten different tests. The results (in ng/ml) are tabulated below: Muestra Media SD %CV ESTUDIOS COMPARATIVOS El kit DIAsource PRA ELISA kit (x) fue comparado con un kit PRA LIA (y). La comparación de 12 muestras de plasma ensayadas dieron como resultado la siguiente regresión lineal: y = 1.09x , r = VALORES NORMALES ESPERADOS Como para todos los ensayos clínicos cada laboratorio debe recolectar los datos y establecer su rango de valores normales esperados. Los datos presentados aquí fueron con muestras incubadas a ph 6.0 durante el paso de generación (Brossaud and Corcuff, 2009). Media PRA N (ng/ml.h) Rango PRA (10 th -90 th percentil) (ng/ml.h) REFERENCES 1. Brossaud, J., Corcuff JB. Clin. Chim. Act. 410:90, Bystrom CE et al., Clin Chem, 56:XXX, Campbell, DJ, et al., Clin. Chem. 55:867, Cartledge, S., Lawson, N., Ann. Clin. Biochem. 37:262, Derkx FH et al., J Biol Chem, 262:2472, Hartman D, et al., Clin Chem, 50:2159, Pimenta E, Calhoum D, Hypertension, 55:e17, Reudelhuber, TL, Hypertension, 55:1071, Sealey, JE, J. Hypertension, 13:27, Sealey, JE, Clin. Chem. 37/10(B): 1811, Sealey et al., Trends Endocrin Metab, 16:86, Ulmer PS, Weikle AW, Clin Chem. 46:1442, 2000.

7 P.I. Number : WASH SOLN CONC CAL 0 CAL N CONTROL N Ag 125I Ab 125I Ag 125I CONC Ab 125I CONC INC BUF ACETONITRILE SERUM DIL SPE DIL BUF ANTISERUM IMMUNOADSORBENT DIL CAL REC SOLN PEG EXTR SOLN ELU SOLN GEL PRE SOLN NEUTR SOLN TRACEUR BUF Ab HRP Ag HRP Ab HRP CONC Ag HRP CONC CONJ BUF CHROM TMB CONC CHROM TMB SUB BUF STOP SOLN INC SER BUF Ab AP SUB PNPP BIOT CONJ CONC AVID HRP CONC ASS BUF Ab BIOT Ab SAV HRP CONC NSB 2nd Ab ACID BUF DIST TRAY PMSF STRIP SUB EXTR SOLN CONC CART WASH SOLN Símbolos usados Consulte las instrucciones de uso Temperatura de almacenamiento Use por Número de lote Número de catálogo Control Dispositivo médico de diagnóstico In vitro Fabricante Contenido suficiente para <n> pruebas Solución de lavado concentrada Calibrador cero Calibrador # Control # Trazador Trazador Trazador concentrado Trazador concentrado Tubos Tampón de incubación Acetonitrilo Suero Diluyente de muestra Tampón de dilución Antisuero Immunoadsorbente Diluyente de calibrador Solución de reconstitución Polietilen glicol Solución de extracción Solución de elución Cartuchos de sílica Bond Elut solución Pre-tratamiento Solución de Neutralización Tampón trazador Micropozos Conjugado HRP Conjugado HRP HRP Conjugado concentrado HRP Conjugado concentrado Tampón de conjugado TMB Cromogenico concentrado Solución TMB Cromogenica Sustrato Solución de parada Incubación del suero Tampón AP Conjugado Sustrato PNPP Conjugado Biotin concentrado Avidina HRP concentrado Tampón de ensayo Biotina conjugado Anticuerpo específico Estreptavidina HRP concentrada Unión no específica 2do anticuerpo Tampón de Acidificación Distribuidor Bandejas de incubación Solución PMSF Proteger de la luz Tira Suastrato Tampón de extracción concentrado Cartucho Tampón de lavado Revisión nr