Seminario Genética. Técnicas de Biología Molecular

Transcripción

1 Seminario Genética Técnicas de Biología Molecular

2 Contenidos Extracción de ADN Enzimas de restricción PCR Southern Blot Secuenciación método de Sanger y automática

3 1º Extracción de ADN Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano: Sangre, Saliva, Semen, hisopado vaginal, restos de fluidos en ropa, orina, piel, bulbo piloso, muestras biospsias de órganos/tejidos, material cadavérico (ej huesos), etc Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares:

4 2º Almacenamiento y conservación del ADN: El ADN purificado refrigerado a 4 C puede conservarse por lo menos un máximo de 3 años. Aquellas muestras que necesitan mantenerse más de 3 años deberán congelarse a -70 C.

5 Las técnicas desarrolladas utilizan: Fundamentos: Complementariedad de bases Replicación del ADN Herramientas: Elementos de virus y bacterias (Ejemplo: Transcriptasa Reversa, Enzimas de Restricción, Polimerasas, etc.)

6 Sólo veremos Técnicas Directas: Fundamentos: Southern Blot PCR Complementariedad de bases Replicación del ADN Secuenciación Directa

7 SOUTHERN BLOT Edwin Southern desarrolló esta técnica en 1975

8 Southern Blot Sirve para detectar por Hibridación la presencia de una porción de ADN en una muestra Fundamento: COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado. El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo u otras zonas del genoma. Se puede utilizar para el diagnóstico molecular de patologías genéticas

9 Southern Blot HIBRIDACIÓN: La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena) Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32 (radiactivos): Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda

10 Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los siguientes pasos

11 Fragmentación del ADN y Separación Inmovilización- Desnaturalización Transferencia Hibridación Revelado

12 Enzimas de restricción

13 ENZIMAS DE RESTRICCION

14 Los fragmentos de restricción se pueden separar por tamaño mediante electroforesis en gel.

15 Diferentes condiciones de hibridación permite mayor o menor estabilidad y especificidad

16 Pasos: Previos a la Hibridación: separación de fragmentos Extracción de ADN Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción) Separo los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de migración un gel (separación por tamaño)

17 Pasos: Previos a la Hibridación: Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido Desnaturalización (SIMPLE CADENA) Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por capilaridad o por electroforesis: pasan del gel a la membrana

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19 Sacado de los bocetos de Edwin Southern antes de la publicación de la técnica

20 Pasos: Hibridación Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecíficas Se revela por autoradiografía

21 Sólo veremos Técnicas Directas: Southern Blot PCR Secuenciación

22 PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Kerry Mullis en 1983 desarrolló esta técnica

23 PCR Amplificación de un gran número de copias a partir de un fragmento molde de ADN, utilizando una reacción enzimatica simple de polimerizacion in vitro ADN molde PCR ADN resultante

24 PCR Fundamento: REPLICACION DEL ADN COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Herramientas: POLIMERASA BACTERIANA Estrategia: Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario

25 PCR: la reacción se divide en 3 pasos 1. Desnaturalización: 94 C - 96 C 2. Alineación: temperatura variable 3. Extensión: C LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE REPETIRSE VARIAS VECES

26 Necesitamos en este proceso controlar la temperatura: termociclador Desnaturalización 95 C Hibridización 50-60ºC Primer Ciclo Extensión de la cadena 75ºC 2 do Ciclo 95ºC 50-60ºC 75ºC Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

27 Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? Extracción del ADN molde Preparado de la MIX: 1. Agua libre de nucleasas 2. Catión divalente (MgCl2) 3. Desoxinucleótidos (dntp s) 4. Sol. amortiguadora y sales (Buffer 10X) 5. Oligonucleótidos (Primers) 6. Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa)

28 Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? Para la polimerización de ADN es necesario: Una polimerasa, primers y nucleótidos. Como se utiliza cambios de temperatura para lograr la desnaturalización y renaturalización de las hebras: la enzima tiene que ser resistente a cambios de temperatura

29 PCR Thermus aquaticus se descubrió en el Parque Yellowstone, inició el campo de la biología de los hipertermófilos. Thermus aquaticus, crece a 70º grados (fuente de la enzima taq polimerasa usada en la PCR)

30 PCR La taq polimerasa no es la única enzima usada en la PCR. Hay muchas más Ej: PFU (enzima extraída de Pynococus Furioso) TAQ No tiene actividad 3 exonucleasa. Puede copiar con errores Velocidad 2000 nucleótidos/ min. PFU Tiene actividad 3 exonucleasa Velocidad 500 nucleótidos/ min.

31 PCR: Primers Complementariedad durante la hibridación en la fase de alineamiento Se unen zona donde la secuencia es complementaria Son diseñados los primers: esto permite seleccionar que porción amplificar

32 PCR: Ejemplos de utilización PCR en diagnóstico: 1. Colocando primers Fw diferentes (una para secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw en el mismo tubo 2. Combinando la PCR con cortes con enzimas de restricción (si se generase o perdiera algun sitio de restricción por la misma mutación) concepto: Primers alelo específicos

33 El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (1) se sembró el marcador de peso molecular En la calle (2) se sembró una muestra conocida para una mutación homocigota En la calle (3) se sembró la muestra del paciente

34 El siguiente es el resultado en un gel de agarosa Qué resultados dieron las muestras 1, 2, 3, 4? En la calle (C1) muestra conocida homocigota gen mutado En la calle (C2) muestra conocida homocigota gen normal

35 Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? Extracción del ADN molde Preparado de la MIX: 1. Agua libre de nucleasas 2. Catión divalente (MgCl2) 3. Desoxinucleótidos (dntp s) 4. Sol. amortiguadora y sales (Buffer 10X) 5. Oligonucleótidos (Primers) 6. Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa)

36 Algunas aclaraciones Sol. amortiguadora PCR: Mantiene el ph óptimo para que la enzima actúe Sales Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq Polimerasa para que incorpore los dntp s. Taq Mg

37 PCR: cómo ve el observador el proceso Herramientas: POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tº Estrategia: Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario MIX + ADN

38 Sólo veremos Técnicas Directas: Southern Blot PCR Secuenciación

39 Secuenciación: Método enzimático 1977: Frederick Sanger desarrolló esta técnica Método de los terminadores de cadena o dideoxi

40 Secuenciación Fundamento: REPLICACION DEL ADN COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Herramientas: Dideoxinucleotidos Estrategia: Cuando se agrega un dideoxinucleotido a la cadena en formación se interrumpe la polimerización

41 En la polimerización del ADN OH Fosfato HO P O O 5 CH O Azúcar 2 N Base N N N 1 OH H Jerárquico OH del carbono 3

42 Secuenciación: utiliza deoxinucleotidos y dideoxinucleotidos Fosfato HO 5 OH P O O CH O Azúcar 2 N N Base 1 NH 2 N N Fosfato HO 5 OH P O O CH O Azúcar 2 N N Base 1 NH 2 N N OH H HOH H deoxinucleotido monofosfato 2 3 -dideoxinucleótido monofosfato

43 Cuando se incorpora un dideoxinucleótido se interrumpe la polimerización Fosfato HO 5 OH P O O CH O Azúcar 2 N N Base 1 NH 2 N N HOH H 2 3 -dideoxinucleótido monofosfato

44 Se realizan 4 reacciones de síntesis (4 tubos separados) Se incluyen pequeñas cantidades de dideoxinucleotidos ddntp que compiten con los dntp. En cada tubo se colocan: 1. dntp (4 tipos), 2. un solo tipo de ddntp por tubo, 3. primer o cebador marcado, 4. ADN molde a secuenciar, 5. Polimerasa A ddntp G ddntp C ddntp T ddntp

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46 Lectura 5 a 3 desde la basa al tope Secuenciación: Separación de fragmentos Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis ddatp ddctp ddgtp ddttp Como la polimerización es solo en dirección 5 a 3, los fragmentos más cortos estarán en 5 y los más largos que se encontrarán en la dirección 3

47 SECUENCIACION AUTOMATICA empleando método enzimático Alternativa del método Sanger Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reacción Los productos se detectan durante electroforelectroforésis al pasar por un láser que excita los fluorocromos y se detecta fluorescencia emitida Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas Se coloca el cebador marcado, polimerasa, dntp y ddntp Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en único tubo

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49 ATTGC A.. Capilar Pol. líquido Laser Prisma Detectores Ventana + Placa caliente Reacción Secuencia -

50 Cómo se ve el resultado?

51 En el electroferograma se observa dos picos en la posición 152 (C / T) A A T G G - T - C - C A N - T - T - G - G - C A A T G G - T - C - T A N - T - T - G - G - C

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53 Repeticiones en tandem La variación en el número de repeticiones de los distintos mini y microsatélites es un polimorfismo muy frecuente. Estos polimorfismos se generan por errores durante la replicación Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide: Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repetición determinada.

54 VNTR (Número variable de repeticiones en tandem) micro satélites hiper variables

55 Obtención de DNA a partir de RNA. Rt-PCR. Transcriptasa reversa