PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR CONCENTRACION DE VIRUS ENTERICOS EN MUESTRAS DE AGUA. PRT Página 1 de 5

Transcripción

1 PRT Página 1 de 5 1. OBJETIVO Realizar concentración viral desde muestras de agua para su posterior análisis de presencia de virus entéricos. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento se aplica a aguas tratadas o naturales que permitan la toma y concentración por el sistema de ultrafiltración tangencial. 3. FUNDAMENTO La carga viral en muestras de agua puede ser muy baja, por lo tanto se requiere realizar la concentración de varios litros de agua para lograr la detección virus. Otro obstáculo en la detección de virus es la imposibilidad de enriquecer en la matriz. Una vez que la muestra es concentrada por ultrafiltración tangencial, las muestras son sometidas a ultracentrifugación para obtener un pellet con las partículas virales, el cual es sometido a una extracción con cloroformo y concentrado nuevamente por ultracentrifugación. Finalmente antes de su detección molecular por PCR en tiempo real (qpcr) se somete a una etapa de extracción. 4. REFERENCIAS 4.1 Entrenamiento en Vibrios and Viruses in Seafood, a cargo de U. S. Food and Drug Administration en Gulf Coast Seafood Laboratory, Dauphin Island, Alabama Noviembre Proyecto Corfo 09CN Entrenamiento Norovirus. Dictado por la FDA en el ISP. 23 abril a 01 mayo Enumeration and isolation of viral particles from oligotrophic marine environments by tangential flow filtration. Internalt Microbiol (1999) 2: Detection and Characterization of hepatitis A virus and Norovirus in estuarine water samples using ultafiltration-rt-pcr integrated methods. Journal of Applied Microbiology IS SN TERMINOLOGÍA No Aplica.

2 PRT Página 2 de 5 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Materiales Tubos de 70 ml para ultracentrífuga Pipetas de 10 o 20 ml Hielo picado Micropipetas de 1000 µl Microtubos de 1,5 ml. 6.2 Reactivos Buffer glicina 0,05 M ph=9, PBS estéril para cultivo celular simple y doble concentración. 6.3 Equipos Freezer -20ºC Balanza Centrífuga refrigerada Ultracentrífuga refrigerada 7. DESARROLLO 7.1 Las muestras de agua pueden ser procesadas inmediatamente luego de la ultrafiltración tangencial o ser almacenadas a -20ºC por meses. 7.2 Si las muestras están congeladas, proceder a su descongelación por toda la noche. 7.3 Tomar 60 ml y colocar en un tubo de ultracentrífuga. 7.4 Centrifugar a 4 ºC por una hora a rpm. La diferencia de peso entre uno y otro tubo no debe superar los ± 0,05 g. 7.5 Descartar el sobrenadante, teniendo máxima precaución de no eliminar el pellet, dejar lo más seco posible. 7.6 Resuspender el pellet en 4 ml de buffer glicina 0,05 M ph=9,5.

3 PRT Página 3 de Incubar en hielo por 30 minutos agitando constantemente para facilitar la separación del virus de las partículas. 7.8 Agregar 4 ml de PBS 2X, calidad cultivo celular y agitar. 7.9 Centrifugar a 4800 rpm durante 20 minutos a 4ºC, para eliminar el debris y material particulado dejando el sobrenadante lo más limpio posible Utilizando pipeta, trasladar el sobrenadante a un tubo limpio de ultracentrífuga de 70 ml Agregar PBS 1X, calidad cultivo celular, de modo que el volumen no sea inferior a 60 ml para evitar el colapso de los tubos y pérdida de la muestra. La diferencia de peso entre uno y otro tubo no debe superar los ± 0,05 g Luego de balancear los tubos, colocarlos en la ultracentrífuga y marcar la posición en la cual quedará el pellet, ya que es posible que este no sea visible luego de centrifugar. Centrifugar por 1 hora a rpm a 4 ºC Descartar el sobrenadante por aspiración dejándolo bien seco Resuspender el pellet en 800 µl de PBS Repartir la suspensión en alícuotas de 200 µl en 4 tubos Si no se realiza la extracción de RNA inmediatamente, almacenar a -70 ºC Rotular los tubos y registrar en Registro concentración de virus entéricos. 8. REGISTROS 8.1 Registro concentración de virus entéricos 9. ANEXOS Anexo Nº 1 Preparación de reactivos. Anexo Nº 2 Registro concentración de virus entéricos

4 PRT Página 4 de 5 ANEXO Nº 1 Preparación de reactivos PBS (Grado cultivo celular) NaCl 8,0 g. KCl 0,2 g. KH2PO4 0,12 g. Na2HPO4 0,91 g. Agua desionizada 1000 ml. Disolver y ajustar el ph a 7,5, completar volumen. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. Almacenar a 4ºC. Glicina 0,5 M ph=9,5 Glicina 3,75 g. Agua desionizada 1000 ml. Disolver y ajustar el ph a 9,5, completar volumen. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. Almacenar a 4ºC.

5 PRT Página 5 de 5 Identificación de la muestra: Anexo Nº 2 Registro concentración de virus entéricos Nº:...Tipo de muestra :...Analista... Fecha y hora de recolección...fecha y hora de análisis:... Rotulo extracto: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4