Cromatografía de Líquidos
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- Blanca Revuelta Cano
- hace 6 años
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1 Cromatografía de Líquidos Elba Rojas Escudero ERE
2 Ab o Ad???
3 Fundamentos Temario Definiciones básicas Aspectos teóricos Instrumentación Elementos básicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados Análisis cualitativo y cuantitativo
4 Cromatografía de líquidos Método físico de separación La muestra se distribuye entre dos fases Fase estacionaria: sólido o líquido Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos
5 Elución La muestra se aplica al principio de la columna como una banda fina El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna
6 Cromatografía Gas Líquido Columna Plano CLS CLL CFE CII CE CCF CP CPG CFG
7 Tipos de CL PM < 2000 Cromatografía de intercambio iónico Adsorción: líquido-sólido Partición: líquido-líquido Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa PM > 2000 Cromatografia de exclusión por tamaño
8 Requisitos de la muestra Soluble en la fase móvil Limpia No debe reaccionar con ningún componente del sistema cromatográfico
9 HPLC ideal para muestras con: Presión de vapor baja Compuestos iónicos Compuestos de peso molecular elevado Compuestos Termolábiles
10 Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Gradiente de elución Muestra Inyector Control de temperatura Columna Detector Registrador
11 Fase móvil Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 mω Baja viscosidad No vólatil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada)
12 Fase móvil Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo. Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (ml/min)
13 H = f (v)
14 Cromatografía FM FE Inyector Detector
15 Proceso Cromatográfico La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos Los solutos se reparten entre ambas fases Fase estacionaria Muestra Fase móvil
16 Cromatografía de líquidos Se realiza en columna Separación por adsorción y partición Diversidad de técnicas en función de la muestra Análisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analíticas y preparativas Análisis de mezclas relativamente complejas
17 Fase estacionaria (columna) Tubo de acero inoxidable Dimensiones Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm Tamaño de partícula: 3, 5, 10 µm Forma de la partícula: irregular o esférica
18 Dimensiones de la columna L di dp
19 Fase estacionaria (columna) Empaque Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polímeros Carga de Carbón 5-20 % w/w Intervalo de ph = f (FE) Límite de presión de trabajo Compatible con la fase móvil
20 Fase estacionaria
21 Soportes de la FE
22 Permeación o exclusión
23 Cuidados de la columna Instalación Introducción de muestras limpias Contaminación por fase móvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma adecuada Lavarla después de utilizarla con disoluciones reguladoras de ph
24 Precauciones No exceder la presión de trabajo Cambios bruscos de presión Intervalo de ph adecuado No utilizar H + y OH - concentrados Filtrar la muestra y la fase móvil w de la muestra=f (dimensiones de la columna)
25 Cromatografía Fase Normal FE polar FM No-polar Fase Inversa FE No-polar FM polar
26 Cromatografía de fase inversa FE Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C 18 octadecil, C 8 octil, C 4 tetrametil, C 2 dimetl FM Mezclas: agua/disolventes orgánicos H 2 O +(CH 3 OH, THF, CH 3 CN)
27 Cromatografía de fase inversa Efecto solvofóbico fuerte: Parte apolar de la molécula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H 2 O)
28 Fases estacionarias Fases impregnadas Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado NO son Estables
29 Fases estacionarias Fases químicamente unidas ( Bonded phases ) Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables
30 Ventajas Cromatografía de fase inversa Reproducibilidad en las separaciones Estabilidad de la FE (ph 7) Mezclas: acuosos/orgánicos H 2 O +(CH 3 OH, CH 3 CH 2 OH, CH 3 CN)
31 Fuerza del eluyente
32 Viscosidad del eluyente
33 Polaridad
34 Polaridad
35 Detectores Indice de refracción Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroquímico Radioactividad Infrarrojo Espectrómetro de masas
36 Instrumentación Fase móvil Bomba de alta presión Gradiente de elución Muestra Inyector Control de temperatura Columna Detector Registrador
37 Elución
38 Problema general de la elución
39 Gradiente de elución
40 Gradiente de elución
41 Elución con alta presión
42 Elución
43 Equipo con gradiente de elución
44 Proceso Cromatográfico El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna) La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria
45 Proceso Cromatográfico Las móleculas de soluto en fase estacionaria se estancan Las móleculas en fase móvil avanzan con ella Mm m m M m m M
46 Proceso Cromatográfico La velocidad del soluto varía inversamente con la afinidad por la fase estacionaria
47 Separación de los solutos Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarán Mm m m m M M M M M M
48 Separación de los solutos
49 H = f (v)
50 Ensanchamiento de banda
51 Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FE
52 Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FM movimiento
53 Ensanchamiento de la banda Transferencia de masa en la FM estancada
54 H= f (ensanchamiento de la banda) H L = 2γ D M / v H S = 2 k 1+k 2 vta H F = 2λdp H D = Ωvdp 2 / D M H M = H F + H D H SM = (1- θ + k ) 2 dp 2 v 30(1-θ)(1+k ) 2 γd M
55 H = f (ensanchamiento de la banda) H = L / N H = H L + H S + H M + H SM H = H S + H M + H SM
56 Ventajas Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular Diversidad de columnas y detectores Formación de derivados pre-columna y post-columna Separaciones con control de ph Separaciones preparativas
57 Limitantes Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase móvil Viscosidad de la fase móvil Dimensiones de la columna Presión de trabajo Intervalo de ph Utilizar un filtro (pre-columna)
58 Cromatografía de Líquidos Formación de derivados ERE
59 Derivados Fuera de línea En línea Pre-columna Post-columna
60 Equipo para la formación de derivados FM FE Inyector Reactor Detector FM FE Inyector Reactor Detector
61 Derivados
62 Derivados
63 Cromatografía de Líquidos Aplicaciones ERE
64 CCF - CLAE
65 FE = f (diámetro interno)
66 Diferente λ
67 Cambio de λ
68 Aplicación
69 Aminas
70 Aplicación
71 Fluorescencia
72 Polar - No polar
73 Qué sucedió???
74 Sensibilidad
75 Sensibilidad
76 Peso molecular
77 Propiedades = f (PM)
78 Oligosacáridos
79 Oligoglucosa
80 Ejemplos Campo Mezclas típicas Fármacos Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos Bioquímica Aminácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos Alimentos Edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB, fenoles Química Drogas, venenos, alcohol en forense sangre, narcóticos
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