REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LACZ

Transcripción

1 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LACZ

2 Para conocer la organización del ADN se desarrollaron métodos que permitieron conocer la secuencia exacta de nucleótidos, primeramente de regiones seleccionadas de un gen, luego de un gen completo, y más recientemente de un genoma completo. Tecnología del ADN recombinante Hibridación de ácidos nucleicos, hace posible la localización de secuencias determinadas de ADN o ARN. Rotura especifica del ADN mediante nucleasas de restricción Las moléculas de ADN de diferentes tamaños pueden separarse por Electroforesis en gel. Secuenciación de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN. Amplificación de un fragmento de ADN mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

3 Cuando una solución de ADN se calienta se rompen las uniones de puentes de Hidrogeno que mantienen unidas a las dos hebras. Cuando esta solución se enfría las cadenas complementarias forman nuevamente la doble hélice Renaturalización o Hibridación.

4 Es un método sensible que permite la detección de secuencias especificas de nucleótidos. Una sonda es un fragmento de ADN de cadena simple, generalmente de tamaño pequeño, usado como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria igual o similar. Entre las Técnicas que utilizan este principio podemos encontrar: Northern blot (ARN) Southern blot (ADN) Western blot (proteínas) Dot blot

5 En la década del 70 se descubrieron enzimas bacterianas con actividad ADNasa que reconocían una secuencia palindrómica particular y la cortaban. Estas nucleasas reconocen una secuencia específica de 4 a 8 nucleótidos de longitud, y producen un clivaje del ADN en el sitio reconocido. Las bacterias las utilizan como mecanismo de defensa contra virus bacteriófagos, ya que reconocen sitios presentes en esos virus, que están ausentes en el genoma de la bacteria, o que se encuentran modificados por Metilación.

6 Se nombran con una sigla a partir del nombre de la especie bacteriana que la presenta. Un ejemplo de enzima de restricción lo ofrece la EcoRI, que proviene de Eschericha coli, y reconoce la secuencia palindrómica:

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8 Establece el número, el orden y la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restricción a lo largo de una secuencia de ADN.

9 En un genoma, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Pequeños cambios en la secuencia de ADN entre distintos individuos pueden modificar los patrones de corte de las endonucleasas de restricción, dando lugar a la aparición de los Polimorfismos de longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP). Enzima MspI No corta a Corta A

10 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Esta técnica permite amplificar más de mil millones de veces un fragmento de ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma (Taq Polimerasa (Thermus aquaticus), diseño de cebadores específicos, dntps).

11 PLÁSMIDOS BACTERIANOS Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. En general, no contienen información esencial, sino que confieren diferentes ventajas al hospedador. Ej: plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico. Esta región Polylinker nos permite incorporar un fragmento de interés en el plásmido, el cual sirve como vector Resistencia a Ampicilina

12 PLÁSMIDOS RECOMBINANTES Si se corta el plásmido y el fragmento de interés con la misma enzima de restricción, luego los extremos generados por las Enzimas de Restricción pueden ser sellados por una ADN ligasa. Esto permite la incorporación de fragmentos de ADN de cualquier origen (animal, vegetal, etc.) dentro de un plásmido bacteriano. El plásmido resultante es un híbrido que contiene ADN de dos especies diferentes, y se denomina plásmido recombinante.

13 TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO EN BACTERIAS Existen tres procesos por los que el material genético exógeno se puede introducir en una célula bacteriana: Conjugación Transformación Transducción

14 Conjugación La Conjugación es el proceso de transferencia de material genético entre una célula procariota donadora y una receptora mediante el contacto directo o una conexión que las una (pili sexuales en los Gram negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos). Es un mecanismo de transferencia horizontal de genes como la transformación y la transducción, con la diferencia de que estos últimos no involucran contacto intercelular.

15 Transducción La transducción es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde una bacteria a otra mediante la acción de un virus. También se utiliza para designar al proceso mediante el cual ADN exógeno es introducido en una célula mediante un vector viral.

16 Transformación Bacteriana La transformación bacteriana es un proceso por el cual el material genético exógeno se puede introducir en una célula bacteriana. La transformación ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios artificiales. La tecnología del ADN recombinante reproduce esta transformación in vitro.

17 Bacterias Competentes Para introducir plásmidos en bacterias hay que lograr que las mismas se vuelvan receptoras a elementos genéticos. Esto se hace mediante un procedimiento de permeabilización que afloja la pared bacteriana. Estas bacterias sensibilizadas se denominan bacterias competentes.

18 Bacterias Competentes La competencia se produce a través de distintas técnicas, que aumentan la permeabilidad de la pared bacteriana para permitir el ingreso de ADN exógeno. Incluyen tratamiento con Cl2Ca cambios bruscos de temperatura electroporación

19 Transformación Bacteriana y Selección de transformantes

20 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LACZ

21 Trabajo Práctico Análisis de la expresión de LacZ PARTE 1: Preparación de una cepa bacteriana que exprese el operón lac. PARTE 2: Crecimiento e inducción de bacterias para el análisis de expresión de lacz. Toma de muestras para medición de actividad de β- galactosidasa.

22 PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL OPERÓN LAC TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Se utilizará una cepa bacteriana desprovista del gen lacz. 1- CEPA BACTERIANA (tiene una deleción que inactiva el gen lacz) laci P O lacz lacy laca

23 PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL OPERÓN LAC TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Mediante el proceso de transformación bacteriana se introducirá un plásmido portador del gen faltante, restableciéndose la expresión del operón Lac en las células transformadas. 1- CEPA BACTERIANA (tiene una deleción que inactiva el gen lacz) laci P O lacz lacy laca 2- PLÁSMIDO (produce β-galactosidasa activa, aun sin ser una proteína completa) P O lacz

24 PREPARACIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DEL OPERÓN LAC Gen LacZ Resistencia a Ampicilina Selección de Transformantes

25 1 SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES 1 Selección de Transformantes