EXPLICACIÓN DE TRABAJOS PRÁCTICOS COLORACIONES

Transcripción

1 EXPLICACIÓN DE TRABAJOS PRÁCTICOS COLORACIONES Microbiología General Carrera: Tecnicatura Universitaria en Esterilización Analista Biológico 2015

2 DIFERENCIA ENTRE CÉLULA PROCARIOTA Y CÉLULA EUCARIOTA

3 Morfología bacteriana

4 Agrupaciones de cocos según el plano de división diplococos estreptococos sarcinas estafilococos

5 Diferentes morfologías en bacterias bacilares

6 Espirilo: espiral rígida Espiroqueta: flexible, enrollada como sacacorcho

7 Observación de microorganismos MICROSCOPIO OPTICO

8 OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS La observación de los microorganismos se puede realizar: Examen en fresco (vivos sin teñir) Técnicas de coloración (teñidos con colorantes) Ventajas que presentan los microorganismos coloreados: Proporciona el contraste suficiente entre la célula y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos. Permite el estudio de estructuras propias de la célula. Se pueden obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del microscopio.

9 COLORANTES - Son compuestos orgánicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por determinadas estructuras celulares. - Muchos de los colorantes usados en microbiología están cargados positivamente (catiónicos) y se combinan con compuestos celulares cargados negativamente, como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos. - Colorantes catiónicos: azul de metileno, cristal violeta, zafranina. - Son sales que en medio acuoso: CLAM CL - + AM+

10 Coloraciones Las coloraciones se pueden clasificar en: Examen en fresco Coloración simple Coloraciones diferenciales: Coloración de Gram Coloración de Ziehl-Neelsen Coloraciones especiales: Técnica de Moeller Técnica de Wirtz-Conklin Impregnación argénticade flagelos Técnica de Burri Impregnación argénticade Fontana Tribondeau

11 1. Preparación del frotis 2. Secado Cultivos bacterianos: h 3. Fijación Métodos físicos: calor Métodos químicos: alcohol metílico o etílico 4. Enfriado 5. Coloración (simple o compuesta) 6. Lavado 7. Secado 8. Observación al microscopio con objetivo de inmersión 100 x

12 MORDIENTE Sustancia química que unida a los colorantes forma una laca que se adhiere fuertemente a la estructura Se utiliza para estructuras muy difíciles de teñir. Se puede agregar antes o después de la adición del colorante con el que formará la laca Ejemplos: lugol coloración de Gram ácido tánico impregnación argéntica

13 COLORACIÓN SIMPLE Permite visualizar forma, tamaño y disposición de los microorganismos 1.- Hacer el frotis 2.- Secar la preparación en la parte alta del mechero 3.- Fijar tomando el preparado desde un extremo, pasándolo 3 veces por la llama del mechero. 4.- Una vez frío, colorear con un solo colorante. 5.- Lavar, secar y observar.

14 Estructura del peptidoglicano Esquema de la pared Unidad repetitiva

15 Gram negativas Gram positivas

16 PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS Ácidos teicoico: polímeros de fosfato de ribitol o fosfatos de glicerol

17 ETAPAS EN LA TINCIÓN DE GRAM PASOS METODO GRAM (+) GRAM (-) Colorante Cristal violeta violeta violeta Mordiente Lugol violeta violeta Decoloración Alcohol 95% violeta se decolora o alcohol-acet. Contraste Fuscina o violeta rojo zafranina

18 Coloración de Gram Alcohol disuelve los lípidos de la pared bacteriana deshidratación del peptidoglicano

19 Cómo se observan las bacterias y esporas según la coloración de Gram? Gram (+) Gram (-) Levaduras Esporas: Bacillus subtilis

20 Pared de bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR)

21 COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Hacer el frotis-secarlo-fijarlo Cubrir con Fucsina Ziehl concentrada, calentar con hisopo encendido hasta emisión de vapores durante 10 min. El fenol y el calor facilitan la penetración del colorante Decolorar con alcohol-ácido Lavar-cubrir con Azul de metileno Lavar-Secar Observar

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23 Cápsula bacteriana Composición química -Polisacáridos -Proteínas Cápsula: estructura rígida Capa mucosa: se deforma con facilidad y no excluye partículas

24 ETAPAS EN LA COLORACIÓN DE CAPSULA (TECNICA DE BURRI) 1.- Preparar extendido (colocar en el extremo de un portaobjeto una gota de tinta china comercial) 2.- Emulsionar sobre esa gota una suspensión de gérmenes cápsulados 3.- Con otro portaobjeto, efectuar un extendido fino. Secar y fijar a la llama. 4.-Cubrir con solución de cristal violeta 2 min. 5.- Lavar cuidadosamente con agua corriente. Secar y observar.

25 CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE FONDO OSCURO Y EL CUERPO BACTERIANO TEÑIDO DE VIOLETA.

26 DIFERENTES ASPECTOS DE LA CAPSULA BACTERIANA Klebsiella pneuminiae Bacillus antrhacis Streptococcus pneumoniae

27 ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANAS ENDOSPORAS: No es un método de multiplicación bacteriana sino una forma de reposo latente dentro del ciclo vital. Permanecen latentes por largos periodos de tiempo. La formación de la endospora se da por la falta de los nutrientes esenciales No se presenta en la etapa exponencial del crecimiento bacteriano

28 Órganos refringentes, esféricos u ovales, constituyen la forma de resistencia bacteriana ante deficiencia nutricional, radiación, calor, ácidos, altas temperaturas, etc. Son muy impermeables a los colorantes

29 TIPOS DE ENDOSPORAS: A. Central C. Subterminal D. Terminal TIEMPO DE VIDA DE UNA ESPORA: Indefinido, hasta que las condiciones del medio sean favorables (Clostridium aceticum años) COLORACION PARA ENDOSPORA: Moeller Wirtz Conklin

30 ETAPAS EN LA COLORACIÓN DE ESPORAS (TECNICA DE MOELLER) 1.- Frotis. Secar 2.- Fijar con alcohol absoluto, escurrir el alcohol y arder el resto. 3.- Lavar. Tratar con ác. Crómico 5 min. Lavar. 4.- Cubrir con fuscina fenicada de Ziehl. Calentar 10 min. 5.- Decolorar con ác. Sulfúrico 5%. Descartar reactivo. Completar con alcohol. 6.- Lavar. Colorear con azul de metileno dil. 1 min. 7.- Lavar. Secar y observar. ESPORAS: ROJAS OTRAS ESTRUCTURAS: AZULES.

31 COLORACIÓN DE ESPORAS Tinción de Moeller Tinción de Wirtz Conklin

32 Estructura de un flagelo bacteriano

33 Diferentes disposiciones de flagelos bacterianos Monotrica Lofotrica Anfitrica Peritrica

34 IMPREGNACIÓN ARGENTICA PARA FLAGELOS MORDIENTE: ácido tánico REACTIVO PRECIPITANTE: Ag 2 O LAVAR: agua destilada FLAGELOS SE VEN DE COLOR MARRÓN CLARO

35 Impregnación argéntica de Fontana Tribondeau: espiroquetas y espirilos MORDIENTE: ácido tánico REACTIVO PRECIPITANTE: Ag 2 O LAVAR: agua destilada ESPIROQUETAS Y ESPIRILOS SE VEN DE COLOR MARRÓN OSCURO SOBRE FONDO PARDO CLARO.