Bernd Kuebler Center of Regenerative Medicine in Barcelona (CMR[B]) Luis Fernando Quintana Fundación Privada Clínic per a la Recerca Biomèdica (FCRB)

Transcripción

1 GENERACIÓN DE CÉLULAS MADRE DE PLURIPOTENCIA INDUCIDA A PARTIR DE PACIENTES CON ENFERMEDADES GENÉTICAS CON AFECTACIÓN RENAL: CORRECCIÓN Y MODELADO DE ENFERMEDADES RENALES IN VITRO Bernd Kuebler Center of Regenerative Medicine in Barcelona (CMR[B]) Luis Fernando Quintana Fundación Privada Clínic per a la Recerca Biomèdica (FCRB)

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3 1. Resumen del proyecto Existen intereses sociales y científicos importantes en el campo de las enfermedades genéticas degenerativas renales: en primer lugar, la generación de un modelo de la enfermedad in vitro para entender los mecanismos moleculares relacionados con la misma, y en segundo lugar, la identificación de dianas terapéuticas para el tratamiento de los pacientes. Son diferentes enfermedades sistémicas heredadas las que se asocian a una lesión glomerular de origen inmunológico o metabólico. Entre ellas encontramos las amiloidosis hereditarias (AH) y el síndrome de Alport (SA). En el caso de las amiloidosis se trata de enfermedades de transmisión genética que dan lugar a la producción de proteínas mal plegadas que se organizan como fibrillas de amiloide y se acumulan en diversos órganos. Dicho acúmulo conlleva el desarrollo de polineuropatía, disfunción autonómica, insuficiencia renal y cardíaca o desórdenes gastrointestinales. Su presentación clínica es muy variada, lo que puede dar lugar a problemas diagnósticos. En el caso del SA, se trata de una enfermedad hereditaria que afecta a las membranas basales, causada por alteraciones en una de sus proteínas estructurales: el colágeno tipo IV. La SA se transmite mediante dos patrones de herencia distintos: la herencia ligada al cromosoma X y la herencia autosómica recesiva. Los pacientes con SA desarrollan hematuria, proteinuria e insuficiencia renal progresiva. En los últimos años se han propuesto diferentes estrategias terapéuticas para evitar la progresión a enfermedad renal terminal en dichas enfermedades. En este proyecto proponíamos que la generación de ipsc de pacientes con AH y SA nos permitiría caracterizar mejor la fisiopatología de estas enfermedades in vitro y establecer medidas para corregir estos trastornos moleculares. Por ello los objetivos principales de este proyecto consistieron en: a) el desarrollo de ipsc de pacientes con AH y SA a partir de células madre mesenquimales procedentes de su propio tejido adiposo (AD- MSC); b) el desarrollo de un protocolo in vitro de células epiteliales-like a partir de ipsc que en un futuro pudieran inducir regeneración celular al ser trasplantadas y, por último, c) establecer modelos in vitro de enfermedades renales que sirvieran para 3

4 generan nuevas dianas terapéuticas y evaluar la respuesta al tratamiento de fármacos y otros productos con potencial terapéutico. Desde hace más de 15 años, el Servicio de Nefrología y Trasplante Renal del Hospital Clínic de Barcelona cuenta con una línea específica de estudio en amiloidosis, en especial de riñón, pero también en otras formas hereditarias de amiloidosis. Así, el Servicio es miembro activo de la unidad funcional y multidisciplinar de amiloidosis del HCB y está participando en varios ensayos clínicos fase II y III, convirtiéndose en un centro de referencia tanto para los pacientes con estas enfermedades renales raras como para el sistema sanitario catalán y español. En este contexto, el grupo de investigación liderado por el Dr. Luis F. Quintana participó en el reclutamiento de una cohorte de pacientes seleccionados de la base de datos del Hospital Clínic que habían desarrollado polineuropatía amiloidótica familiar (FAP, una de las amiloidosis hereditarias) y SA. El Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona fue fundado en Es un centro de referencia de reprogramación y regeneración de tejidos y órganos. Estamos reprogramando gran cantidad de células somáticas como por ejemplo fibroblastos derivados de piel, células aisladas de la sangre o de orina, queratinocitos extraídos de piel humana y pelo utilizando las técnicas de reprogramación de última generación con infecciones víricas, con Lenti-, Retro- y Sendai virus, transfección de mrna o nucleoinfección de plásmidos episomales. 2. Resultados Para el desarrollo de ipsc de pacientes, el grupo liderado por el Dr. Luis F. Quintana conjuntamente con el Dr. Josep M. Campistol generó una lista de pacientes portadores de las mutaciones Val30Met, Lys89 TTR y ApoIII que desarrollaron FAP y de portadores de la mutación COL4A5 que desarrollaron SA. Estos pacientes se obtuvieron de la base de datos del Hospital Clínic. El proyecto se completó con una lista de pacientes controles. 4

5 Pacientes con FAP: - Mutación Val30Met: 3 familias, en total 7 pacientes. - Mutación Lys89: 1 familia, en total 3 pacientes. - Mutación Apo AIII: 1 familia, en total 3 pacientes. Pacientes con SA: - COL4A5: 1 familia, en total 8 pacientes. Controles: - 21 controles sanos. A partir de la extracción del tejido adiposo subcutáneo de dichos pacientes, se llevó a cabo el aislamiento de AD-MSC y su caracterización tanto por citometría de flujo como por su diferenciación multilinaje. Las AD-MSC derivadas de pacientes con FAP fueron enviadas al CMRB para su reprogramación con la metodología feeder-free no integrativa. Células derivadas de pacientes con SA fueron reclutadas por la Dra. Roser Torra de la Fundació Puigvert y reprogramadas de la misma forma. Células madre pluripotentes inducidas (ipsc) procedentes de pacientes con FAP y SA, fueron generadas con nucleoinfección con plásmidos no-integrativos episomales. Se han generado líneas de ipsc de 9 pacientes con FAP y 3 con SA, se han expandido, caracterizado parcialmente y congelado distintos clones de cada paciente. Se han caracterizado totalmente, expandido, congelado viales y banqueado un clon de cada uno de los 3 pacientes con FAP y de los 3 pacientes de SA. Las líneas procedentes de los pacientes con SA se han registrado en el Banco Nacional de Líneas Celulares (ESi054_A, ESi054_A, ESi056_A) y están en preparación para la publicación en la revista Stem Cell Research. Los clones de líneas de ipsc obtenidos a partir de muestras de distintos pacientes con FAP se han diferenciado a hepatocitos mediante un protocolo que incluye, entre otros, Activin A, BMP4, HGF e incubaciones en diferentes concentraciones de oxigeno: (4%O 2 o 20%O 2 ). La expresión de marcadores hepáticos se evidenció mediante inmunocitoquímica y qpcr con primeros específicos contra marcadores hepáticos, 5

6 indicando regulación de diferenciación hepática tardía de los marcadores AFP, AFP7B, SOX17, TDO, CXCR4, HNF4 y FOXA2. En paralelo, se estableció un protocolo de diferenciación de ipsc en células renales epiteliales. Se ha realizado inmunocitoquímica con anticuerpos contra colágeno IV (col IV) para analizar si se pueden detectar las diferencias morfológicas entre colágeno mutado e intacto en fibroblastos de paciente con SA y de donantes sanos. Mediante la inmunocitoquímica no se han detectado diferencias importantes entre el colágeno IV de donantes y de pacientes, indicando que no se pueden mostrar estos cambios morfológicos por inmunocitoquímica. Otro punto a desarrollar a lo largo del proyecto era la caracterización de nuevos marcadores de células progenitoras renales. Para ello nuestro grupo llevó a cabo el aislamiento tanto de un conjunto de todas las células del riñón como de las diferentes fracciones con sus diferentes tipos celulares. Mediante separación celular por citometría de flujo se aislaron células positivas para marcadores de célula progenitora como CD24 y CD133. Posteriormente se enviaron al CRMB para la determinación de nuevos marcadores mediante microarrays. Durante el desarrollo del proyecto, la Dra. María José Ramírez, integrante del grupo del Dr. Quintana, propuso determinar el efecto renoprotector de las microvesículas (MV) derivadas de las células progenitoras renales (CD24+/CD133+) para su aplicación en un modelo in vivo de daño renal agudo (daño mediante glicerol) y un daño renal crónico (nefrectomía 5/6). Se llevó a cabo la puesta a punto tanto del aislamiento de las MV como la caracterización de los modelos murinos de daño agudo y crónico. Durante el desarrollo de dichos modelos observamos que era necesario partir de gran cantidad de células progenitoras para aplicar dicha terapia con MV y se nos planteó el inconveniente que durante la expansión del cultivo celular los marcadores progenitores se perdían progresivamente, con lo cual al final fue imposible aplicar esta terapia en los modelos in vivo. 6

7 A fin de superar estas dificultades, el Dr. Quintana y la Dra. Ramírez pensaron que sería útil, a nivel clínico, determinar mediante inmunohistoquímica la presencia de marcadores progenitores en las biopsias renales de los pacientes con amiloidosis. El objetivo de dicho estudio sería establecer nuevos marcadores predictivos de la evolución del desarrollo de la insuficiencia renal crónica. Así, el Dr. Quintana y la Dra. Adriana García (nefropatóloga) llevaron a cabo la selección de 37 casos clínicos de pacientes con amiloidosis renal que presentaban biopsias renales incluidas en parafina y posteriormente se puso a punto la inmunohistoquímica de los diferentes marcadores en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Clínic. En estos momentos, la evaluación de las biopsias está siendo llevada a cabo por el Dr. Manel Solé Arqués que cuenta con una gran experiencia en la evaluación de biopsias de pacientes con amiloidosis. No se pudo realizar este análisis en biopsias de pacientes con SA, debido a que la mayoría de los pacientes son diagnosticados cuando ya están en un estadio muy avanzado de la enfermedad renal. 3. Relevancia y posibles aplicaciones Las amiloidosis son un grupo de enfermedades raras que tienen su origen en el depósito extracelular de amiloide, un material fibrilar que deriva de varios precursores proteicos y que se agrega debido a una anormal conformación de la hoja β. El acúmulo de amiloide ocurre como consecuencia de una proteína mutada en el caso de amiloidosis hereditarias. En la actualidad varias terapias con potencial están desarrollándose para algunas formas de amiloidosis, como la generación de ipsc a partir de la reprogramación de células somáticas de pacientes. La combinación de análisis clínicos y modelado in vivo con la tecnología de ipsc podría ser muy útil, evitando test innecesarios y definiendo el mejor momento para el trasplante de hígado o riñón en pacientes presintomáticos. La tecnología ipsc ofrece un escenario único para la identificación de vías moleculares y/o genes responsables de la 7

8 enfermedad y para definir nuevos agentes terapéuticos causantes del bloqueo del proceso de amiloidogénesis en casos de polineuropatía amiloide familiar y para descubrir vías moleculares del síndrome de Alport. Así, la contribución del conocimiento molecular y biológico que ofrece la tecnología ipsc será importante no solo para confirmar el diagnóstico en estadios tempranos de la enfermedad, sino también para mejorar la calidad de vida de los pacientes evitando el trasplante. Las líneas de ipsc de pacientes que sufren amiloidosis polineuropatía familiar y síndrome de Alport se han generado y caracterizado completamente. Además las ipsc con Síndrome de Alport están registradas y líneas de ipsc de ambas enfermedades están listas para ser usadas como modelo. Disponer de marcadores predictivos de la respuesta al tratamiento es un primer paso hacia terapia individualizada en los pacientes con amiloidosis renal. Siguiendo esta línea, la determinación de la presencia de marcadores de células progenitoras en la biopsia renal de dichos pacientes podría establecer una correlación clínica con la función renal y la proteinuria. Además de establecer la importancia de dichos marcadores en la estratificación del riesgo de desarrollo de insuficiencia renal crónica. 4. Bibliografía científica generada Xia Y, Nivet E, Sancho-Martinez I, Gallegos T, Suzuki K, Okamura D, Wu MZ, Dubova I, Esteban CR, Montserrat N, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC. Directed differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud kidney progenitor-like cells. Nat Cell Biol Dec;15(12): Kuebler B., Aran B., Miquel-Serra L., Muñoz Y., Ars Criach E., Bullich G., Furlano M., Torra Balcel R., Marti M., Veiga A., Raya A. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from a patient with autosomal recessive Alport Syndrome (ARAS) Stem Cell Research (en preparación). 8

9 Kuebler B., Aran B., Miquel-Serra L., Muñoz Y., Ars Criach E., Bullich G., Furlano M., Torra Balcel R., Marti M., Veiga A., Raya A. Generation of integration-free induced pluripotent stem cell lines derived from two patients with X-linked Alport Syndrome. Stem Cell Research (en preparación). 9