ENUMERACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS SIN RESUSCITACIÓN. TÉCNICA RECUENTO EN PLACA

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1 PRT Página 1 de 6 1. OBJETIVO Determinar el número de Enterobactereaceae presentes en un alimento. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos donde se espere encontrar más de 100 microorganismos por gramo o ml de muestra 3. FUNDAMENTO Esta metodología tiene una etapa presuntiva de siembra en agar selectivo en profundidad y una etapa confirmativa con pruebas bioquímicas 4. REFERENCIAS 4.1 General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation. MPN technique and colony -count technique-iso 7402 punto TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Baño de agua 45 ºC Incubadora 35 a 37 ºC ± 1 C Vortex mixer 6.2 MATERIAL DE LABORATORIO Placas Petri de 15x100mm Pipetas estériles de 1 y 10 ml graduadas en 0,1 y o,5 ml Asa de nicrón (aprox de 3mm de diámetro) Tubos estériles de 16x160 mm Mondadientes de madera o asa de vidrio Mecheros Bunsen Frascos de capacidad ± 160 ml.

2 PRT Página 2 de MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS Agar Bilis Glucosa Rojo neutro Cristal Violeta (VRBG). Este debe ser preparado justo antes de usar Agar nutritivo o agar BAB (en placa Petri con 15 a 18 ml) Agar glucosa, previo a su uso calentar en baño de agua hirviendo para eliminar el aire y luego enfriarlo rápidamente Solución acuosa de dihidrocloruro de tetrametilparafenilendiamina al 1% Etanol 70 % 7. DESARROLLO 7.1 Etapa presuntiva Preparar diluciones decimales de la muestra de alimento ( 10-1 a 10-6 ). Sembrar 1 ml en duplicado en placas Petri estériles de las diluciones 10-1 a Verter en cada placa Petri 15 ml de agar VRBG previamente fundido y enfriado a 45 ºC en baño de agua. El tiempo entre la dilución inicial y el vertido del medio no debe ser superior a 15 minutos Mezclar el inóculo con el agar siguiendo las siguientes instrucciones a) mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, b) hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj c) mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y d) hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj Esperar que se haya solidificado el agar con el inóculo y agregar una segunda capa con 4 a 5 ml del mismo agar Esperar que solidifique la segunda capa e incubar las placas invertidas a 35 a 37ºC por 24 ± 2 hrs Inocular una placa con una cepa de E. coli, otra con S. aureus Anotar en el RG En paralelo incubar una placa sin inocular como control de esterilidad del medio, anotar en el RG Leer las placas que presenten entre 15 a 150 colonias. Contar aquellas que contienen colonias de color púrpura Registrar el resultado de cada placa por dilución en registro RG Etapa confirmativa Subcultivo Repicar 5 colonias características para realizar pruebas bioquímicas confirmativas en agar nutritivo en placa Incubar las placas a 35 a 37 º C por 24 ± 2 hrs.

3 PRT Página 3 de Agregar control positivo E. coli y Control negativo S aureus Seleccionar una colonia aislada desde cada una de las placas incubadas, para la confirmación bioquímica Prueba de oxidasa Usar asa de inoculación de platino/iridio o de vidrio, tomar una porción de cada colonia aislada y colocar en contacto con papel filtro recientemente humedecido con el reactivo de oxidasa. No se debe usar asa de inoculación de níquel /cromo Considerar que la prueba es negativa cuando el color del papel filtro no se ha tornado azul en 10 segundos. Las Enterobacterias son oxidasa negativas, se puede utilizar como control positivo de reacción, una cepa Pseudomona aeruginosa y como control negativo una cepa de E. coli Anotar en el Registro RG Prueba de fermentación Repicar en profundidad, usando un asa de inoculación, las mismas colonias seleccionadas para la prueba de oxidasa ( ) en tubos de agar glucosa. Incluir como control positivo una cepa de E. coli y como control negativo una cepa de Pseudomona aeruginosa Incubar a 35 a 37 ºC por 24 ± 2 hrs Si se desarrolla un color amarillo a lo largo del contenido del tubo, la reacción se considera positiva. La mayoría de las cepas producen gas Anotar en el Registro RG EXPRESIÓN DE RESULTADOS Criterio general Si por lo menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas como oxidasa negativa y glucosa positiva y así confirmadas como Enterobacteriaceae, el número de microorganismos presentes será el mismo que resultó en el recuento hecho en En todos los otros casos, el número se calculará desde el porcentaje de colonias oxidasa negativa y glucosa positiva en relación al número total de colonias seleccionadas Aproximar el resultado a un número entero de colonias Caso general-placas que contienen hasta 150 colonias típicas Calcular para cada placa, el número de microorganismos confirmados, usando la expresión siguiente: N = Σ a /(n 1 + 0,1 n 2 ) x d en que :

4 PRT Página 4 de 6 Σ a = suma de colonias contadas después de la identificación en todas las placas seleccionadas. n 1 = número de placas seleccionadas en la primera dilución n 2 = número de placas seleccionadas en la segunda dilución d = factor de dilución que corresponde a la primera dilución. Aproximar el resultado calculado a dos cifras significativas Estimación de pequeños números Si las dos placas que corresponden a la suspensión inicial, contienen menos de 15 colonias, calcular el promedio aritmético (m) de las colonias contadas en ambas placas Informar el resultado como se indica a continuación: Número estimado, N E Enterobacteriaceae por gramo N E = m x d -1 En que m = promedio aritmético d = factor de dilución de la suspensión inicial Placas sin colonias características o sin desarrollo de colonias Si las dos placas, que corresponden a la suspensión inicial, no contienen colonias características o no presentan desarrollo de colonias, informar el resultado como se indica a continuación: - Menos de 1 x d -1 microorganismo por gramo, donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial Precisión Sólo por razones estadísticas, en el 95 % de casos los límites de confianza de la técnica recuento en placas varía desde ± 16 a ± 52 %, para los recuentos de colonias de menos de 15 por placa, los límites de confianza se dan en tabla N 1. En la práctica, se puede encontrar una variación aún mayor, especialmente entre resultados obtenidos por diferentes analistas.

5 PRT Página 5 de 6 Tabla N 1 Límites de confianza para la estimación de números pequeños de colonias Número de microorganismos Límites de confianza al nivel 95 % Mas bajo Mas alto 1 < < < REGISTROS Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición RG Archivador rojo Acceso libre al Papel Almacenar por 5 años rotulado Registro de personal del Controles laboratorio laboratorio 348. cortado en trozos. 348 RG Archivador rojo Acceso libre al Papel Almacenar por 5 años rotulado Registro de personal del Controles laboratorio laboratorio 348. cortado en trozos. 348 RG Archivador azul Bajo custodia Papel Almacenar por 5 años rotulado Registro de laboratorio 348 lecturas de informes acceso restringido picada en trozos de resultados. a personal sección Laboratorio microbiología

6 PRT Página 6 de 6 Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Enterobacterias (Nº 348) RG Archivador azul Bajo custodia Papel Almacenar por 5 años rotulado Registro de laboratorio 348 lecturas de informes acceso restringido picada en trozos de resultados. a personal sección Laboratorio Enterobacterias microbiología (Nº 348) 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio 4 1 Se elimina formato página 1 por cambio en formato de documento institucional 4 todas Cambio de formato de todas las páginas por cambio de formato a nivel institucional. 4 2 Se incluyen recomendaciones en el uso de los medios VRBG y agar glucosa En Etapa presuntiva se inclyen los controles a realizar 4 Página 4, Se agrega los controles de calidad puntos y necesarios para las pruebas bioquímicas Fecha Aprobación 10. ANEXOS 10.1 Anexo Nº 1 RG Registro de análisis de muestras de alimentos laboratorio Enterobacteria Anexo Nº 2 RG Registro Control de Ambiente Laboratorio de Enterobacterias General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation. MPN technique and colony -count technique-iso 7402 punto Anexo Nº 4 RG Registro cepas control de Incubadoras Anexo Nº5 RG Registro de Control de Esterilidad de Medios Cultivo utilizados en el Análisis de coliformes, coliformes fecales, E. coli y Eterobacterias.