PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS ANTIBIOGRAMA De Bauer & Kirby

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1 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIDAD DE INMUNOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA MÉDICA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS ANTIBIOGRAMA De Bauer & Kirby Dra. Carmen De Tercero Dra. Sindy Suchini Dra. Paola Lee Dra. Miuril López Lic. Sué Quan INTRODUCCION: La selección de un antimicrobiano para el tratamiento del paciente depende de numerosos factores, entre estos se puede mencionar: 1. Localización de la infección 2. Factores de respuesta del hospedero: a. Estado inmunológico b. Estado de la función renal y/o hepática c. Historia de reacciones alérgicas d. Enfermedades concomitantes 3. Características de absorción del antimicrobiano y su vía de excreción 4. Propiedades farmacocinéticas y la posología del antimicrobiano 5. La sensibilidad local y los patrones de resistencia 6. Los costos de adquisición y la administración del antimicrobiano 7. La susceptibilidad del microorganismo frente al antimicrobiano Debe tomarse en cuenta que en algunas especies de microorganismos, antimicrobiana es una propiedad innata y en otras la pueden adquirir. la resistencia GENERALIDADES: Existen diversas categorías de pruebas utilizadas para determinar la actividad antimicrobiana: 1) Prueba de dilución y prueba de difusión en disco: valora la actividad inhibidora frente a un microorganismo determinado.

2 2) Pruebas que determinan la actividad letal de un antimicrobiano frente a un microorganismo. 3) Pruebas que determinan la actividad β-lactamasa en un determinado microorganismo, como elemento pronóstico de su susceptibilidad frente a algunos antibióticos β- lactámicos. 4) Pruebas para determinar directa o indirectamente la cantidad de antimicrobiano en un líquido biológico, habitualmente suero. La conducta del médico ante las bacterias en las pruebas antimicrobianas, suelen interpretarse como: SUSCEPTIBLES: La infección producida por un microorganismo puede tratarse adecuadamente con la dosis del antimicrobiano recomendado para este tipo de infección y de microorganismo infectante, excepto en aquellos casos en los que este contraindicado por otras razones. DE SUSCEPTIBILIDAD INTERMEDIA: La infección debida a un microorganismo puede ser tratada mediante concentraciones alcanzables de determinados antimicrobianos cuando se administran estos en dosis más altas o cuando las infecciones se encuentran en regiones del organismo donde se concentran los antimicrobianos (ej. La orina). RESISTENTES: Supone que la infección producida por un microorganismos no responderá adecuadamente al antimicrobiano. No utilizando el mismo. Muchos han sido los factores que han contribuido al incremento de cepas multiresistentes a antimicrobianos y antibióticos, como su uso inadecuado, migración nacional e internacional que facilita la diseminación, aglomeraciones de personas, entre otros. Las bacterias pueden ser resistentes intrínsecamente a uno o más agentes antimicrobianos y pueden adquirir la resistencia por mutaciones, intercambio genético horizontal (conjugación, transducción) por genes de resistencia de otros organismos, así como por adaptaciones metabólicas al fármaco. SELECCIÓN DE ANTIMICROBIANOS: La selección final de los antimicrobianos a utilizar para cada tipo de microorganismo, dependerá del Laboratorio de Microbiología conjuntamente con el Comité de Infecciosas de cada hospital. Cuando hay un brote hospitalario de algún microorganismo que usualmente es susceptible al antimicrobiano ideal y se muestra actualmente resistente. Se envía una notificación al Centro de referencia en Guatemala es el Laboratorio Nacional de Microbiología (Barcenas, Guatemala) quienes son los responsables de investigar la nueva cepa e indicar, según características del mismo, que antimicrobianos utilizar, los cuales deben cumplir los estándares que establece la El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorios (Clinical and Laboratory Standard Institute/CLSI/, radicado en Pennsylvania, EUA).

3 Los antimicrobianos recomendados por la CLSI, se agrupan en cuatro grupos: GRUPO A: Se encuentran aquellos antimicrobianos que se han de ensayar y que deben ser informados de forma rutinaria. GRUPO B: Está constituido por antimicrobianos que pueden ser valorados de forma rutinaria, solamente se informarán si los del grupo A no son activos, no son apropiados para un lugar determinado de la infección, o si se constata un fallo terapéutico con el grupo A. GRUPO C: Están incluidos los antimicrobianos que serán estudiados cuando aparezcan problemas específicos de resistencia, por ejemplo, brotes epidémicos, en pacientes con alergia a otros antibióticos o en infecciones inusuales. GRUPO D: Antimicrobianos utilizados en infecciones del tracto urinario. Dentro de estos grupos y para un determinado microorganismo existe una batería de antibióticos a probar. Por ejemplo, las enterobacterias

4 Dependiendo del mecanismo de acción se resume en dos grandes grupos de antimicrobianos (ver fig. No. 1): Bactericidas: Ejercen una acción letal e irreversible sobre el microorganismo. Fosfomicina, Vancomicina, B-Lactámicos, Aminoglucósidos, Rifampicina, Acido Nalidíxico, Quinolonas, Nitrofurantoinas. Bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del hospedero pueden eliminar a las bacterias. Tetraciclina, Cloranfenicol, Sulfonamidas, Trimetoprim, Lincomicina, Clindamicina, Macrólidos. Fig. No. 1: Sitios de acción de los antimicrobianos en los microorganismos

5 ANTIBIOGRAMA: El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorios, define el antibiograma como: un perfil general de los resultados de la susceptibilidad antimicrobiana de una especie microbiana frente a una batería de agentes antimicrobianos. En general, se entiende por antibiograma el resultado de las pruebas de susceptibilidad in vitro llevadas a cabo para conocer el comportamiento de un microorganismo frente a determinados antimicrobianos, cuyos resultados se expresan en términos de "sensibilidad" y "resistencia". Las formas básicas de medir cuantitativamente la actividad in vitro de los antimicrobianos son: Concentración mínima inhibitoria (MIC): Es la base de la medida de la susceptibilidad de una bacteria a un determinado antimicrobiano. Se define como la menor concentración de una gama de diluciones del antimicrobiano que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antimicrobiano frente a diferentes especies bacterianas. Concentración mínima bactericida (MBC): Es la concentración más baja del antimicrobiano que es capaz de matar el 99.9% del inóculo original en un periodo de tiempo determinado. MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Podemos distinguir diferentes tipos de métodos en función de la técnica utilizada y de la información que dan (Tabla No. 2). METODO TECNICA INFORMACIÓN CUALITATIVO ANTIBIOGRAMA DIFUSION DE MICRODISCOS (KIRBY-BAUER) RESISTENCIA VALOR INTERMEDIO SENSIBILIDAD SEMICUANTITATIVO GRADIENTE ANTIBIOTICO (E-TEST) APROXIMACION A LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI) CUANTITATIVO 1. DILUCION DE CALDO: DETERMINACION DE LA CMI MACRODILUCION EN TUBO MICRODILUCION EN PLACA 2. DILUCION EN AGAR 3. SISTEMA DE AUTOMATIZADOS (Vitek:::) Tabla No. 2: MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA.

6 Tabla tomada del Instructivo de Laboratorio de Resistencia Bacteriana, de la Dra. Débora Esmaralda Aldana MD, PhD METODO DE DIFUSION EN AGAR: Consiste en el método de difusión con discos descrito por Bauer y Kirby, al que se le han realizado sustanciales modificaciones posteriores según criterios del CLSI, estos resultados obedecen a un proceso de simple interpretación por medio de puntos de corte de los halos de inhibición aparecidos en el medio de cultivo. En décadas pasadas la interpretación de estos resultados resultaba muy fácil, ya que solo bastaba utilizar el antimicrobiano al cual el antibiograma señalaba como sensible. En la actualidad este proceso se ha complejizado sobremanera debido al incremento de la resistencia bacteriana, a punto de partida de un sinnúmero de mecanismos creados por los microorganismos para eludir el efecto de los antimicrobianos y su diseminación entre la población microbiana, que hacen que no siempre se puedan tomar en cuenta los resultados del antibiograma sin un previo análisis. Fundamentos teóricos de la prueba de difusión en discos de Kirby-Bauer La prueba de difusión en disco se basa en la capacidad de muchos agentes antimicrobianos de difundir en el agar creando un gradiente continuo de concentración. Si el disco que contiene el antibiótico se deposita sobre una placa recién inoculada, se producirá la inhibición del crecimiento. Esta área, al ser proporcional a la CMI (concentración inhibitoria minima) permitirá la distinción de cepas susceptibles, resistentes o intermedias. Puntos de control: a) Concentración del inóculo. La concentración ideal del inoculo se espera que se encuentre idealmente a una concentración de 108 de microorganismos. Esto se realiza según los estándares de Mc Farfland; donde la concentración ideal del inóculo corresponde a una dilución de turbidez que puede ir de 0.5 a 10, (estos estándares son creados al mezclar soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos), para asegurar la densidad correcta (ver fig. No. 2). Fig. No. 2: Estándares de Mc Farfland

7 b) Medio. El medio adecuado para realizar la prueba es el Agar de Mueller-Hinton (MH) (ver fig. No. 3). Para determinadas bacterias con requerimientos nutricionales específicos se puede utilizar el MH-sangre o el MH-chocolate. Se incuban las placas durante horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Fig. No. 3: Agar de Mueller-Hinton c) Concentración de los discos de antibiótico. Para cada antimicrobiano hay fijadas unas concentraciones estándar, según los estándares de CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio). La variación de estas concentraciones implica variar los criterios de interpretación. (Ver fig. No. 4) Figura No. 4: Concentración de los Discos de Antibióticos

8 Figura No. 5: Tabla de susceptibilidad y resistencia antimicrobianos en Agar de Muller-Hinton Realización de la Prueba: Cuando se han aislado las colonias de un organismo que ha sido identificado como patógeno potencial, debe de realizarse lo siguiente: 1. Seleccionar las colonias 2. Preparar una suspensión del inóculo 3. Estandarizar las suspensión del inóculo 4. Inocular la placa 5. Colocar discos de antimicrobianos 6. Incubar la placa 7. Medir las zonas halo- de inhibición 8. Interpretar los resultados NOTA: VER VIDEO PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS

9 BIBLIOGRAFIA 1. Instructivo de Laboratorio de Resistencia Bacteriana (Método de Bauer y Kirby). Aldana Débora Esmeralda. Unidad Didáctica de Inmunología y Microbiología. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2. Mecanismo de resistencia a antimicrobianos en bacterias. Gerardo Becerra, Arturo Plascencia, Antonio Luévanos, Miguel Domínguez, Iván Hernández. Enfermedades Infecciosas y Microbiología, vol. 29, núm. 2, abril-junio Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Perilla Mindy J., Ajello Gloria et al. Organización Mundial de la Salud Actualización En Resistencia Bacteriana Y Normas CLSI. Ovalle María Victoria. CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio) Pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos. Henry Bernand John. El Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Editorial Marban. 2007