SOLICITUD DEL SERVICIO DE SECUENCIACION CENTRO DE DETECCION BIOMOLECULAR EN ENFERMEDADES EMERGENTES/BUAP
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- María Cristina Martínez González
- hace 6 años
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1 SOLICITUD DEL SERVICIO DE SECUENCIACION CENTRO DE DETECCION BIOMOLECULAR EN ENFERMEDADES EMERGENTES/BUAP Usuario: Institución: Fecha: Departamento: Teléfono: Ext.: Investigador Principal: Firma: Nombre (4 a 6 caracteres) Concentración (ng/µl) (Volumen mínimo necesario 20 µl) DATOS DE LA(S) MUESTRA(S) A SECUENCIAR Muestra(s) a Secuenciar Método de Purificación Oligo cdna PCR dsdna Tamaño Vector (Kpb) Tamaño Inserto (pb) Marca Comercial Componente de elución Nombre Tm ( C) Concentración (pmol/µl) (Volumen mínimo necesario 5 µl) Observaciones:
2 SERVICIO DE SECUENCIACIÓN CEDEB/BUAP El Área de Secuenciación del Laboratorio de Biología Molecular del CEDEB de la BUAP cuenta con un equipo de secuenciación automatizada de DNA de 8 capilares modelo GenomeLab GeXP de Beckman Coulter. Este equipo está basado en secuenciación tipo Sanger mediante electroforesis capilar y emplea la química Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) de Beckman Coulter. La calidad de los resultados de Secuencia de ADN está directamente relacionada con la calidad del templado, por lo que es de vital importancia seguir los requerimientos específicos para entregar sus muestras. 1. RECEPCIÓN DE MUESTRAS: a) El horario de recepción de muestras es únicamente de 9 a 13 horas en días hábiles. b) Las muestras deberán entregarse acompañadas del formato de solicitud de secuenciación (por duplicado), mismo que deberá contener toda la información necesaria para la reacción de secuenciación. 2. REQUISITOS DE LA MUESTRA: a) La muestra a secuenciar debe entregarse en un volumen de 20 µl en microtubos de 0.6 ml debidamente rotulados en el costado sin anotaciones en la tapa, utilizar el mismo nombre asignado en la solicitud. b) La concentración mínima requerida de la muestra según tipo y tamaño de templado es: Templado Concentración (ng/µl) PCR pb 5 PCR pb 10 PCR pb 20 PCR >2500 pb 40 Plásmidos de 3-10 Kb 60 Plásmidos de kb 120 Cósmido, BAC 500 NOTA: Las muestras que contengan una concentración menor a la indicada no serán procesadas. 1
3 c) La cuantificación de la muestra deberá ser verificada mediante la relación de Densidad Óptica a 260/280 nm ( ) y en gel de agarosa, ambos parámetros son importantes ya que el DNA puede tener contaminación de DNA genómico o RNA que afectan la A260 por lo que la concentración de la muestra será sobreestimada. NOTA: El éxito de la reacción de secuenciación depende en mayor medida de una cuantificación y purificación correcta de la muestra. El laboratorio no se hace responsable si falla la reacción por este motivo. d) Es indispensable que el usuario entregue ADN de buena calidad, lo que generará una mayor cantidad de bases secuenciadas. Para esto es necesario, en primer lugar, que el producto de amplificación sea único o, en caso de tener subproductos, purificar la banda a partir de un gel de agarosa. Asimismo, es muy importante que los productos de PCR sean purificados para poder eliminar nucleótidos y oligos no incorporados (se recomienda utilizar kits de QIAGEN, ROCHE, PROMEGA O FERMENTAS). De la misma manera es necesario que los plásmidos sean purificados por minicolumna utilizando los kits de las mismas marcas. e) Si se requiere secuenciar fragmentos de PCR, se recomienda que los productos sean mayores de 150 pb. f) Es muy importante que el usuario siempre prepare la muestra a secuenciar diluída en agua grado biología molecular. Evitar el tampón TE y los buffers de elución de ADN de los kits comerciales porque la presencia de EDTA en la muestra inhibe la reacción de secuenciación. g) En el laboratorio contamos con kits de purificación para productos de PCR y plásmidos, si el usuario requiere este servicio es necesario que lo especifique en la solicitud de secuenciación (en Observaciones ). Dicho servicio tendrá un costo adicional. Para el caso de plásmidos: entregar el pellet obtenido de 3 a 5 ml del cultivo de 12 hrs. Se recomienda utilizar cepas de E.coli DH5-α, HB101 y XL1- blue y C600 para transformar. Las cepas MV1190, HB101 y JM101 no son recomendables porque contienen una gran cantidad de carbohidratos y poseen el locus enda con el que producen una gran cantidad de nucleasa. h) Si el fragmento a secuenciar posee un alto contenido de GC (>60%), secuencias ricas en AT, repeticiones, palíndromes o regiones de homopolímeros, es necesario que el usuario lo especifique en la solicitud de secuenciación (en Observaciones ). 2
4 3. REQUISITOS DEL OLIGO. a) El oligo deberá entregarse en un volumen de 5 µl por reacción en un microtubo de 0.6 ml, diferente de la muestra. Rotular en el costado del tubo el nombre del primer. b) El oligo deberá estar a una concentración de 1 a 10 pmol/µl y disuelto en agua grado biología molecular y no en TE. c) Si el oligo se usa para más de una reacción de secuenciación deberá entregarse un volumen suficiente para cada una de las reacciones (Ej.: 2 reacciones= 10 µl en el mismo microtubo). d) El oligo debe tener una longitud de 18 a 26 bases para asegurar que hibride con el ADN a secuenciar y evitar hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto. Los mejores resultados de secuenciación se obtienen con oligos que tienen una longitud de 23 a 26 bases. e) La presencia de una G o C en el extremo 3 contribuye a la estabilidad de hibridación del primer. f) El oligo deberá tener una Tm entre 55 a 65 C y un porcentaje de GC entre 40-60%. Evitar la utilización de un oligo con secuencias que formen estructuras secundarias, especialmente en el extremo 3, o que puedan hibridar formando dímeros intercatenarios, para ello evitar en lo posible la utilización de cebadores que tengan en su secuencia repeticiones de más de 3 G ó C seguidas. g) El diseño del oligo debe realizarse al menos 50 bases upstream de la secuencia de interés. La secuencia inmediatamente posterior al primer puede no obtenerse o ser bastante imprecisa. 4. ENTREGA DE RESULTADOS Y COSTO DEL SERVICIO. a) El pago del servicio de secuenciación se hará depositando al número de cuenta de HSBC a nombre de BUAP VIEP Centro de Detección Biomolecular. PRECIO DEL SERVICIO DE SECUENCIACIÓN POR REACCIÓN USUARIOS BUAP USUARIOS EXTERNOS $ M.N. $ M.N Más de 10 muestras por usuario se hará un 10% de descuento. 3
5 b) El plazo de entrega de resultados es de 3 a 7 días hábiles vía , una vez que se presente la ficha de pago correspondiente. c) Procesada la muestra y el envío de los informes correspondientes, la muestra de ADN y la secuencia obtenida se conservarán durante un plazo de 30 días. Transcurrido este período, el ADN y los ficheros de datos serán eliminados. d) El formato CEQ de envío de resultados es compatible con los visores habituales disponibles en las siguientes direcciones: EditView en Mac: Chromas en PC: MAYORES INFORMES: Área de Secuenciación del Centro de Detección Biomolecular de Enfermedades Emergentes/BUAP. Teléfono Extensión:
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