OSTEOINMUNOLOGIA: BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL REMODELAMIENTO ÓSEO ROSAHYRA MILENA SANDOVAL COTE

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1 OSTEOINMUNOLOGIA: BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL REMODELAMIENTO ÓSEO ROSAHYRA MILENA SANDOVAL COTE PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA SANTA FÉ DE BOGOTA 2005

2 OSTEOINMUNOLOGIA: BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL REMODELAMIENTO ÓSEO ROSAHYRA MILENA SANDOVAL COTE Monografía Director, Dr. EDGAR GARAVITO Profesor Especialización en Laboratorio de Inmunología Clínica PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA SANTA FÉ DE BOGOTA 2005

3 Nota de Aceptación: Director, Dr. EDGAR GARAVITO Santa Fe de Bogota Noviembre 15 de 2005

4 CONTENIDO Pág. INTRODUCCIÓN CELULAS ÓSEAS OSTEOBLASTOS OSTEOCLASTOS REMODELAMIENTO ÓSEO REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ÓSEA VIAS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR INVOLUCRADAS EN OSTEOCLASTOGÉNESIS TRANCE TRANCE R OPG PTH/VITAMINA D 3 /CALCITONINA SISTEMA INMUNE EN OSTEOCLASTOGÉNESIS 31

5 6. UTILIDAD CLINICA DE LOS MARCADORES DE REMODELAMIENTO ÓSEO TIPOS DE MARCADORES Marcadores de Formación Ósea Fosfatasa Alcalina Total y Fosfatasa Alcalina Ósea Osteocalcina Propenopéptidos Amino y Carboxiterminal del Procolágeno I Marcadores de Resorción Ósea Hidroxiprolina Puentes de Piridinolina y Deoxipiridinolina Péptidos Terminales o Telopéptidos del Colágeno Fosfatasa Ácida Resistente a Tartrato CONCLUSIONES 41 BIBLIOGRAFIA 42

6 LISTA DE TABLAS pág. Tabla 1 Moléculas que regulan los niveles de TRANCE y OPG 24 Tabla 2 Marcadores de Remodelamiento Óseo 37

7 LISTA DE FIGURAS pág. Figura 1 Diferenciación de células óseas 16 Figura 2 Interacción RANK RANKL 29 Figura 3 Papel de la célula T activada en la formación y diferenciación de osteoclastos 32

8 RESUMEN El hueso es un tejido dinámico que brinda un soporte mecánico, protección física y la capacidad de movimiento. Además el hueso es el sitio de almacenamiento para diferentes minerales, y es allí donde se producen las células sanguíneas. La masa ósea depende del balance entre síntesis y destrucción del hueso mediada por osteoblastos y osteoclastos. Los osteoblastos se derivan de células primitivas mesenquimales por acción del factor de crecimiento trasformante β (TGF-β), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Los osteoclastos se originan de precursores hematopoyéticos y en su diferenciación participan el GM-CSF (Factor estimulador de colonias granulocito-monocito) y el M-CSF (factor estimulador de colonias manocitomacrófago). Diferentes estudios han establecido la relación entre osteoblastos y sus células precursoras estromales con los precursores hematopoyeticos de los osteoclastos y los mediadores solubles que modulan estas interacciones incluyendo el factor de diferenciación de los osteoclastos ODF o TRANCE y la Osteoprotegerina (OPG). Factores solubles como la hormona paratiroidea (PTH), la vitamina D 3 y la calcitonina también son críticos en el mantenimiento de este balance. El hueso es un tejido metabolicamente muy activo; mediante la cuantificación en el suero y en la orina de moléculas derivadas del hueso, se ha logrado detectar trastornos en el recambio óseo, estas moléculas son productos que resultan de la actividad enzimática de las células durante la formación o la resorción, o son también componentes de la matriz ósea liberados durante la síntesis o la degradación del hueso.

9 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA La morfogénesis de los huesos y su modelación dependen de la producción de matriz ósea mediada por los osteoblastos y su resorción por los osteoclastos. Los osteoblastos se derivan de una célula precursora mesenquimal pluripotencial que se diferencia en unidades formadoras de colonias fibroblastos (CFU-F). La diferenciación ocurre en un microambiente donde participan hormonas, factores de crecimiento y citocinas (Baylink, 1993). Entre las citocinas las más importantes son el factor de crecimiento trasformante beta (TGF-β), el cual estimula la quimiotaxis de precursores de osteoblastos (Alliston, 2001), y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el cual activa al osteoblasto para favorecer la formación de hueso (Yu, 2003). Otras moléculas de importancia que modulan este proceso son las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) (Canalis, 2003), las cuales participan en el crecimiento esquelético durante la embriogénesis y la reparación de las fracturas (Canalis, 2003). A medida que el hueso se mineraliza el osteoblasto deja de tener actividad de síntesis de material osteoide y se convierte en osteocito, el cual va quedando incluido en el hueso rígido y empieza a tener funciones de receptor de fuerzas externas principalmente determinadas por la actividad muscular (Mackie, 2003). Los osteoclastos son las células más importantes en el proceso de resorción ósea y se caracterizan por su gran tamaño y por sus múltiples núcleos resultantes de la fusión de células precursoras (Boyle, 2003 y Miyamoto, 2003). Se originan a partir de precursores hamatopoyéticos de la línea que da lugar a los monocitos/macrófagos. Al igual que los osteoblastos, el reclutamiento y diferenciación de los osteoclastos está mediado por hormonas, factores de crecimiento y citocinas. Dentro de los factores que están involucrados en el reclutamiento de las células precursoras de los

10 osteoclastos figuran el GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos) (Sarma, 1996) y el M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos). El GM-CSF induce resorción ósea y la formación de osteoclastos, mientras que el M-CSF actúa sobre la célula madre del sistema hematopoyético para mantener la sobrevida de los monocitos precursores de osteoclastos (Sarma, 1996). En años recientes se ha avanzado significativamente en el entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares que regulan el remodelamiento óseo. Estos estudios han permitido establecer la relación entre los osteoblastos y sus células precursoras estromales, con los precursores hematopoyéticos de los osteoclastos y los mediadores solubles que modulan estas interacciones. Está relación fue establecida claramente en estudios realizados in vitro e in vivo, los cuales demostraron que era necesaria la presencia de osteoblstos/células estromales y su interacción con los precursores de los osteoclastos, para que se produjera la diferenciación y activación de estos últimos. El remodelamiento óseo es un proceso dinámico que ocurre en diferentes proporciones a lo largo de la vida. Este proceso se coloca de manifiesto en el momento de reparar microfracturas u otros daños que afecten el esqueleto. Además, como los huesos son el lugar de almacenamiento de calcio, este proceso por consiguiente regula las concentraciones de este mineral en el rango necesario para mantener su equilibrio. Este proceso se refleja en la liberación de una serie de moléculas, las cuales pueden ser medidas en suero o sangre, que sirven como marcadores bioquímicos de la formación y resorción ósea. Entre estos están los telopéptidos del procolágeno tipo I; el precursor del constituyente más abundante de la matriz ósea, el colágeno I (Delmas, 2000).

11 JUSTIFICACIÓN En los últimos años se ha demostrado la estrecha relación que existe entre el Sistema Inmune y el Tejido Óseo, en particular como las células de ambos tejidos se originan a partir de precursores comunes y a su vez como las citocinas producidas por diferentes células tienen efectos regulatorios importantes sobre células tanto del sistema inmunitario como óseas. Por lo anterior es importante revisar y analizar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en el remodelamiento óseo. Con está información se espera tener un mejor entendimiento de la patogénesis de las alteraciones óseas, su relación con la Inmunología y valorar la utilidad potencial que puedan tener los diferentes marcadores biológicos de la remodelación ósea en el diagnostico y seguimiento de dichas alteraciones.

12 OBJETIVO Analizar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en el remodelamiento óseo, haciendo énfasis en los marcadores con potencial utilidad clínica.

13 INTRODUCCIÓN El termino Osteoinmunología ha sido propuesto para describir la interdisciplinariedad que existe entre el sistema Inmune y el Sistema Esquelético (Arron, 2000). Recientemente se ha observado que tanto el sistema inmune y esquelético se regulan el uno al otro en mucho mas grado que lo que previamente se pensaba (Rho, 2004). En particular varias condiciones patológicas las cuales se acompañan de una excesiva perdida ósea, tales como artritis reumatoidea, enfermedad periodontal y algunas anormalidades óseas asociadas a tumores muestras estar influenciadas por componentes celulares (por ejemplo linfocitos T) y por factores solubles (interferón) (Rho, 2004). El papel de las células T en la biología ósea ha sido ampliamente aceptado desde el descubrimiento de miembros de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), como la citocina de activación relacionada con el TNF (TRANCE), también conocida como ligando para el receptor de activación de NF-κB (RANKL), ligando para osteoprotegerina (OPGL) y factor de diferenciación de osteoclastos (ODF) (Rho, 2004). TRANCE fue inicialmente identificado como una molécula de expresión en células T activadas (Wong 1997). Posteriormente se demostró que TRANCE es expresado sobre osteoblastos activos y que es esencial para la osteoclastogenesis (Wong, 1999). Los receptores y ligandos en esta superfamilia tienen una estructura única que les permite acoplarse directamente a vías de señalización para proliferación celular, sobrevida y diferenciación (Theill, 2002). Los miembros de la familia del TNF son dos proteínas trasmembrana que se ensamblan en trímeros funcionales. El receptor de TNF (TNFR) es una 13

14 glicoproteína trasmembrana tipo 1 que presenta dominios extracelulares ricos en cisteína. Existen dos subgrupos de TNFR homólogos, el primero contiene dominios extracelulares de muerte que se une a TRADD o FADD los cuales permiten la activación de la caspasa 8 e inducen apoptosis. El otro grupo se une a factores asociados al receptor de TNF (TRAFs) los cuales son moléculas adaptadoras que permiten la señalización corriente abajo, permitiendo la activación de JNK y NF-κB promoviendo el crecimiento y sobrevida celular (Theill, 2002). De otra parte las células del sistema inmune son derivadas a partir de células progenitoras de la medula ósea. Las citocinas producidas por estas células regulan el metabolismo óseo. Por consiguiente el papel del sistema inmune en la homeostasis ósea ha generado gran interés. 14

15 1. CELULAS ÓSEAS La formación de los huesos y su modelación dependen de la producción de matriz ósea mediada por osteoblastos y su resorción por los osteoclastos. 1.1 OSTEOBLASTOS Los osteoblastos son células de origen mesodérmico cuya función primaria es la formación de hueso (Figura 1). Los osteoblastos se derivan de una célula precursora mesenquimal pluripotencial que se diferencia en unidades formadoras de colonias de fibroblastos (CFU-F). La diferenciación ocurre en un microambiente donde participan hormonas, factores de crecimiento y citocinas (BaylinK, 1993). Entre las citocinas las más importantes son el factor de crecimiento trasformante beta (TGF-β), el cual estimula la quimiotaxis de precursores de los osteoblastos (Alliston, 2001) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) el cual activa el osteoblasto para favorecer la formación de hueso (Yu, 2003). Otras moléculas de importancia que modulan este proceso son las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) (Canalis, 2003), las cuales participan en el crecimiento esquelético durante la embriogénesis y la reparación de fracturas (Canalis, 2003). A medida que el hueso se mineraliza el osteoblasto deja de tener actividad de síntesis de material osteoide, se rodea de matriz ósea y se convierte en osteocito que adquiere la capacidad para responder a fuerzas externas principalmente determinadas por la actividad muscular (Mackie, 2003). Una vez los osteocitos son atrapados pierden su habilidad para producir matriz ósea. Sin embargo los osteocitos pueden sintetizar ciertas moléculas de la matriz ósea como la osteocalcina, y depositar minerales en la matriz ósea, además forman una red con los osteocitos adyacentes y los osteoblastos de la superficie ósea a través de prolongamientos celulares que viajan en el 15

16 interior de canalículos fraguados en el espesor de la matriz (Rho, 2004). Figura 1. Diferenciación de Células Óseas Rho, J., Takami, M. and Choi Y. (2004). Osteoimmunology: Interactions of the Immune and Skeletal System. Molecules and Cells. 17,

17 1.1 OSTEOCLASTOS Los osteoclastos difieren dramáticamente de los osteoblastos, se caracterizan por su gran tamaño y por sus múltiples núcleos resultantes de la fusión de las células precursoras (Boyle, 2003). Se originan a partir de precursores hematopoyeticos de la línea monocito/macrófago (Figura 1). Al igual que los osteoblastos, el reclutamiento y diferenciación de los osteoclastos esta mediado por hormonas, factores de crecimiento y citocinas. Dentro de los factores que regulan el proceso de diferenciación de los osteoclastos figuran el factor estimulante de colonias granulocito/monocito (GM-CSF) (Sarma, 1996) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El GM-CSF induce resorción ósea y la formación de osteoclastos, mientras que el M-CSF actúa sobre la célula madre del sistema hematopoyético para mantener la sobrevida de los monocitos precursores de osteoclastos (Sarma, 1996). Los osteoclastos resorben matriz ósea mineralizada modulando la formación ósea y el crecimiento. La cantidad de osteoclastos en la matriz ósea es relativamente pobre, de alrededor de 2 a 3 por µm 3, con una vida media de 8 a 7 semanas (Suda, 1997). Se localizan sobre la superficie ósea, alojados en lagunas de resorción del hueso trabecular o en túneles cilíndricos del hueso cortical. Las lagunas de resorción y los túneles de estas áreas son creadas por la propia actividad del osteoclasto (Suda, 1997). Los osteoclastos poseen diferentes características que lo hacen células particulares como son su forma discoide con borde irregular y zonas claras. El borde rugoso contiene elementos que resorben componentes orgánicos e inorgánicos del hueso. Los osteoclastos secretan enzimas, tales como la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) por consiguiente decalcifican el hueso, y otras enzimas tales como catepsina K, que degradan proteínas de 17

18 la matriz ósea (Roodman, 1996). Los osteoclastos pueden liberar protones directamente vía H + ATPasa localizada en el borde irregular. El resultado de la acidificación favorece la disolución del mineral óseo en las áreas de resorción (Zaide, 2003). Varias enzimas proteolíticas tales como enzimas lisosomales y proteasas de cisteína, son también liberadas a través del borde irregular en las zonas de resorción (Rho, 2004). Los osteoclastos expresan además altos niveles de αvβ3 integrina, receptor para la vitronectina (Helfrich, 1999), que le permite a los osteoclastos adherirse a una variedad de constituyentes de la matriz ósea in vitro, pero su papel en la función de los osteoclastos in vivo aun no es claro. Se ha observado altos niveles de expresión de αvβ3 integrina en el borde rugoso. Este receptor es necesario para la adhesión firme y progresiva a la matriz en la medida en que el osteoclasto excava la matriz ósea durante la resorción (Helfrich, 1999). 18

19 2. REMODELAMIENTO ÓSEO La morfogénesis y remodelamiento óseo implican la síntesis de matriz ósea por parte del osteoblasto y la coordinada resorción ósea por el osteoclasto. Se estima que alrededor del 10% del total de masa ósea en humanos es recambiada anualmente. Un imbalance entre la actividad de los osteoclastos y osteoblastos puede resultar de cambios hormonales o perturbaciones inflamatorias, resultando en anormalidades esqueléticas caracterizadas por disminución (osteoporosis) o incremento (osteopetrosis) de la masa ósea (Theill, 2002). El incremento de la actividad osteoclastica es observado en muchos desordenes osteopenicos, incluyendo osteoporosis posmenopáusica, enfermedad de Paget, metástasis ósea lítica o artritis reumatoidea; en los cuales hay un incremento en la resorción ósea. Además existen varios factores como M-CSF, IL-1, TGF-β, TGF-α, TNF-β, IL-6 Vitamina D 3, calcitonina, prostaglandina E 2 (PGE 2 ), hormona paratiroidea (PTH), los cuales pueden afectar la osteoclastogenesis a diferente nivel. Sin embargo observaciones experimentales han mostrado que estos factores no son esenciales para el desarrollo de osteoclastos in vivo (Theill, 2002). 19

20 3. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ÓSEA La homeostasis ósea es regulada por el balance de la función de osteoblastos y osteoclastos. La formación ósea por osteoblastos y la resorción ósea por osteoclastos están firmemente acopladas para el manteniemiento de la salud ósea. La actividad de formación ósea por osteoblastos incrementa la masa ósea, mientras la actividad de resorción ósea de los osteoclastos reduce la masa ósea (Suda, 2001). La acción de estas células esta regulada por factores de crecimiento y citocinas. La alteración de este balance generalmente lleva a enfermedades óseas, tales como osteoporosis y osteopetrosis (Helfrich, 2003). La osteoporosis es una enfermedad metabólica en la cual la masa ósea y la densidad mineral ósea continuamente disminuye debido a una incrementada actividad de los osteoclastos. La osteoporosis guía a un alto riesgo de fracturas óseas. De forma diferente, la osteopetrosis hace referencia a una condición heterogénea generalmente caracterizada por incremento de la densidad ósea a causa de un daño en la resorción ósea. En condiciones normales, la resorción ósea por los osteoclastos, en sitios específicos, activa los osteoblastos para remplazar el hueso perdido; cuando este balance se altera se presenta alguna de las enfermedades mencionadas anteriormente. Este disbalance puede resultar de cambios relacionados con las hormonas, citocinas, nutrición, metabolismo, factores mecánicos, o una combinación de cualquiera o de todos estos factores (Rho, 2004). 20

21 4. VIAS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR INVOLUCRADAS EN OSTEOCLASTOGENESIS Los osteoblastos que regulan el metabolismo óseo están relacionados con las hormonas osteotrópicas, con las citocinas que regulan la formación ósea y además, con el desarrollo de osteoclastos y la activación de la resorción ósea (Rho, 2004). Los osteoclastos son derivados del linaje monocitomacrófago en respuesta a las acciones coordinadas de diferentes hormonas osteotropicas incluyendo la vitamina D 3 (1,25(OH) 2 D 3 ) y hormona paratiroidea (PTH). Estas hormonas han sido identificadas en estudios genéticos de enfermedades que causan anormalidades esqueléticas en ratones, ratas y humanos (Zelzer, 2003). Ratones con una disrupción en el gen del M-CSF (ratones op/op) exhiben un fenotipo osteopetropico (Yoshida, 1990). Estudios en estos ratones han claramente mostrado que el M-CSF juega un importante papel en osteoclastogenesis. M-CSF es requerido para diferenciación de los osteoclastos. Los osteoblastos derivados de ratones op/op no favorecen la formación de osteoclastos in vitro (Suda, 1997). Adicionalmente se ha observado que el M-CSF participa en el mantenimiento de osteoclastos maduros. Esto sugiere que el M-CSF participa en los estados tempranos de diferenciación de los osteoclastos así como en la movilidad y sobrevida de osteoclastos maduros. Ahora bien, el factor de crecimiento endotelial vascular recombinante humano (VEGF) puede inducir formación de osteoclasto en ratones op/op (Kaku, 2001). El ligando para FLT3 también sustituye al M-CSF para inducir el desarrollo de osteoclastos bajo condiciones especificas (Lean, 2001). 21

22 4.1 TRANCE En 1997, varios grupos de investigadores estudiando moléculas de unión en una línea de células estromales identificaron una molécula que favorecía la osteoclastogenesis, por lo cual recibió el nombre de ODF (del ingles factor de diferenciación de osteoclastos) (Tsuda, 1997). Posteriormente en una librería de cadn de una línea celular mielomonocitica de ratón 32D se aisló una molécula que se unía a la osteoprotegerina (OPG) y se le denomino ligando de la OPG (OPGL), la cual resulto ser idéntica al ODF (Suda, 1999). Mas aun, otro factor de la familia del ligando del TNF fue clonado en forma casi simultanea durante la búsqueda de genes que regulan la apoptosis en hibridomas de células T de ratón (Tsuda, 1997); este factor se denomina citocina inducida por activación relacionada con el TRANCE (Tsuda, 1997). Otros investigadores identificaron un factor implicado en la diferenciación de los monocitos y células dendríticas por clonación de una librería de cadn de células dendríticas humanas, y lo denominaron RANKL (Tsuda, 1997). Por consiguiente las moléculas ODF, OPGL, TRANCE resultaron ser la misma que el RANKL. TRANCE es expresado en la superficie de osteoblastos y células epiteliales de glándulas mamarias y en células T activadas (Rho, 2004). La expresión de TRANCE es inducida en respuesta a citocinas osteotrópicas secretadas por células inmunes, incluyendo interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-11 (Walsh, 2003). Ratones deficientes en TRANCE exhiben un fenotipo similar a osteopetrosis y no desarrollan nódulos linfoides y glándulas mamarias (Theill, 2002). Una combinación de TRANCE y M-CSF induce formación de osteoclastos a partir de monocitos derivados de bazo y medula ósea en ausencia de osteoblastos (Kim, 2002). Aunque el M-CSF ha sido identificado como un 22

23 factor crucial para el desarrollo de osteoclastos no lo es de forma única. Esto sugiere que TRANCE debe estar participando en la diferenciación y formación de los osteoclastos además de su intervención en la formación de lagunas de resorción ósea (Rho, 2004). TRANCE regula la comunicación entre célula T y célula dendrítica, la sobrevida de la célula dendrítica y organogénesis de nodos linfoides (Theill, 2002). La producción de TRANCE por células T activadas puede directamente regular, como ya se menciono, la osteoclastogénesis y el remodelamiento óseo. Esto explica porque las enfermedades autoinmunes, el cáncer, leucemias, asma, infecciones virales crónicas y enfermedades periodontales resultan en una perdida ósea local y sistémica (Theill, 2002). La expresión de TRANCE puede ser aumentada por factores de resorción ósea tales como glucorticoides, vitamina D 3, IL-1, IL-6, IL11, IL17, TNF-α, PGE 2 y PTH (Tabla 1). Usando sistemas de cultivos in vitro se ha observado que TRANCE puede activar osteoclastos maduros y mediar osteoclastogénesis en presencia de M-CSF. Ratones trance -/- presentan osteopetrosis severa, crecimiento atrofiado y defectos en la erupción de los dientes, además sus osteoblastos no participan en la osteoclastogénesis. Sin embargo estos ratones contienen precursores hematopoyéticos que pueden diferenciarse en osteoclastos maduros in vitro en presencia de TRANCE recombinante y M-CSF (Theill, 2002). 23

24 Tabla 1. Moléculas que regulan los niveles de TRANCE y OPG TRANCE OPG Hormonas Vitamina D3 Aumenta Aumenta PTH Aumenta Disminuye Estradiol No cambia Aumenta Citocinas TNF-α Aumenta Aumenta IL-1 Aumenta Aumenta IL-6 Aumenta - IL-11 Aumenta - IL-17 Aumenta - Factores de Crecimiento TGF-β Disminuye Aumenta BMP-2 - Aumenta Otros Prostaglandina E 2 Aumenta Disminuye Glucorticoides Aumenta Disminuye CD40L Aumenta - Theill, L. E., Boyle, J. W. and Penniger, M. J. (2002). RANK-L and RANK: T cells, bone loss and mammalian evolution. Annu. Rev. Immunol. 20,

25 4.2 TRANCE R El receptor de TRANCE, también llamado TRANCE-R, RANK, OPGLR, ODFR, es expresado como un heterotrímero trasmembrana en progenitores de osteoclastos, células B, células dendríticas y células epiteliales de glándula mamaria. TRANCE-R es un miembro de la superfamilia de receptores del TNF y presenta alta homología con CD40. TRANCE-R es una proteína trasmembrana con una cola citoplasmática de alrededor de 383 aminoácidos que contienen tres dominios de unión (I, II, III) (Walsh, 2003). In vitro la unión de TRANCE TRANCE-R resulta en osteoclastogénesis de células progenitoras y la activación de osteoclastos maduros. La activación de TRANCE-R depende de la señal dada por TRANCE la cual es mediada por una molécula adaptadora denominada factor asociado al receptor para TNF (TRAFs) de las cuales se conocen alrededor de seis (TRAF 1-6). TRAF 1, 2, 3, 5 y 6 interactúan con la cola citoplasmática de TRANCE en regiones específicas (Darnay 1999). Aunque cinco diferentes TRAFs interactúan con la cola citoplasmática de TRANCE-R, la señalización mediada por TRAF6 en particular parece ser crucial para la formación de osteoclastos. Ratones deficientes en TRAF6 presentan defectos en la formación de osteoclastos y muestran osteopetrosis (Lomaga, 1999). NFκ-B es una molécula de señalización y un factor de activación que actúa corriente abajo de TRAF6. La señal de activación de NFκ-B está completamente bloqueada en ratones deficientes de TRAF6. Sin embargo se ha observado que la activación de c-jun kinasa solo esta parcialmente disminuida en ratones deficientes de TRAF6 ya que TRAF2 puede mediar esta señalización (Lomaga, 1999). Estas observaciones son muy similares a las vistas en ratones deficientes de TRANCE-R (Dougall, 1999). Ratones 25

26 deficientes de NFκ-B muestran un fenotipo de osteopetrosis y presentan defectos en la formación de osteoclastos (Iotsova, 1997). Otros estudios han mostrado que TRANCE activa la serin-treonin-kinasa antiapoptotica Akt/PKB a través del complejo de señalización c-src y TRAF6 e induce la cascada de señalización a través de TAB2/Tak1 (Lee, 2002). c- Src y TRAF6 interactúan el uno con el otro y con TRANCE-R, deficiencias en c-src o la adición de inhibidores de kinasas de la familia Src bloquean la activación de Akt/PKB en osteoclastos. TRAF6 aumenta la actividad de c-src guiando a una fosforilación corriente abajo de moléculas de señalización tales como c-cb1 (Theill, 2002). Con base en los datos presentados se puede afirmar que TRAF6 juega un papel importante en la señalización dada por la interacción de TRANCE- TRANCE-R ya que activa corriente abajo otras moléculas como Src/Cb1/Akt y TAB2/TAK1. De esta forma TRAF6 es un factor crítico en la activación de osteoclastos maduros, pero otros TRAFs pueden compensar parcialmente la perdida de TRAF6 durante el desarrollo de osteoclastos. Ratones con una mutación genética a nivel de TRANCE-R presentan un bloqueo en el desarrollo de los osteoclastos que se ve reestablecido una vez se introduce TRANCE-R recombinante en células progenitoras de medula ósea, similar a lo que se observa en ratones trance -/-. Así la interacción entre TRANCE expresado por células estromales/osteoblastos y su receptor TRANCE-R expresado sobre precursores de osteoclastos es esencial para la osteoclastogénesis Ratones con defectos en TRAF6 tienen un fenotipo óseo similar al de ratones trance -/- y trance-r -/- por un bloqueo parcial de la osteoclastogénesis y defectos en la activación de osteoclastos maduros (Theill, 2002). 26

27 4.3 OPG En 1997, varios grupos de investigadores identificaron de forma simultánea una proteína que interfería con la diferenciación de osteoclastos. El grupo de Simonet y colaboradores identificaron una proteína que en cultivos de células hematopoyéticas y estromales inhibió la formación de los osteoclastos de forma dependiente de la dosis, y su administración subcutánea en ratones indujo un aumento de masa ósea y previno la perdida ósea tras ooforectomia (Simonet, 1997). Debido a esa habilidad de proteger el hueso, los investigadores denominaron a esta molécula osteoprotegerina (OPG) y en ratones trasgénicos para OPG, la sobreexpresión de la OPG indujo osteopetrosis asociada a reducción significativa del numero de osteoclastos, sin reducción concomitante del numero de macrófagos (Simonet, 1997). Coincidencialmente otros grupos aislaron un factor similar en medio de cultivo de fibroblastos humanos, el cual era capaz de inhibir la formación de los osteoclastos; un grupo la denomino factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF), mientras otro grupo la denomino molécula-1 similar al TNF (TR1) (Tan, 1997). Posteriormente se demostró que la secuencia del ácido dexosirribonucleico (ADN) de la OPG era idéntica a la OCIF y se estableció que OCIF, TR1 Y OPG eran la misma molécula (Tsuda, 1998). Él termino que hoy en día se emplea para designar al ligando soluble que inhibe la diferenciación de los osteoclastos es la OPG. La OPG es un miembro de la superfamilia del TNFR que regula negativamente la formación y activación de osteoclastos. La OPG es producida primariamente por osteoblastos y/o células estromales y sus precursores, pero también puede ser expresada por células B y células dendríticas. La OPG es un receptor señuelo, el cual interrumpe la interacción entre TRANCE y TRANCE - R ya que se une a este ultimo. Por lo tanto la 27

28 OPG es un inhibidor efectivo de la maduración de osteoclastos y su activación in vitro (Theill, 2002). OPG se produce en respuesta a proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2), IL-1, IL-6, IL-11, TGFβ y estrógenos (Ahlen, 2002). La inducción de OPG es inhibida por PTH, glucocorticoides y prostaglandina E2 (PGE2). La sobreexpresión de OPG en ratones trasgénicos resulta en osteopetrosis, ratones deficientes en OPG muestran una marcada osteoporosis como resultado de un incremento en él numero de osteoclastos funcionales, indicando que los niveles de masa ósea correlacionan con los niveles de OPG en ratones (Ahlen, 2002) Estos hallazgos sugieren que la OPG regula negativamente la formación y función de los osteoclastos. Así la señalización de TRANCE/TRANCE- R/OPG junto con el M-CSF juega un papel importante en la homeostasis ósea. La relación entre osteoblastos y osteoclastos en la regulación del remodelamiento óseo podría entonces resumirse así: TRANCE, que se expresa en la superficie del osteoblasto/célula estromal, se une al TRANCE- R expresado en la superficie de la célula precursora del osteoclasto e induce la diferenciación y activación del osteoclasto. La OPG que se encuentra en forma soluble o que es secretada por los osteoblastos, puede unirse al TRANCE bloqueando la interacción entre el osteoblasto y los precursores de osteoclasto e inhibiendo la formación de osteoclastos. TRANCE tiene la capacidad de activar los osteoclastos y estimular osteoclastos inactivos para iniciar la resorción ósea e inhibir su apoptosis (Figura 2). 28

29 Figura 2. osteoclastos maduros. Interacción RANK RANKL, permite la diferenciación a Teitelbaum, S. L. And Ross, F. P. (2003). Genetic Regulation of Osteoclast Development and Function. Nature. Vol PTH/ Vitamina D 3 / Calcitonina Además de estas citocinas implicadas en el mantenimiento del equilibrio óseo, existen otros factores solubles cuya actividad modula significativamente la masa ósea; los más importantes de estos son la hormona PTH, la vitamina D 3 y la calcitonina (Bakker, 2003; Suda, 2003 y Zaidi, 2002). Sin embargo, la acción de las mismas en el remodelamiento 29

30 óseo parece ser secundaria al mantenimiento del equilibrio del calcio y el fósforo plasmático. De todas formas, el papel de la PTH y de la vitamina D 3 en la patogénesis de la osteoporosis es interesante ya que ambas hormonas son potentes moduladores de la actividad osteoclastica, a la vez que regulan la absorción intestinal de calcio y su excreción renal (Ahmad, 2003). El aumento en la concentración de PTH en la circulación, promueve la resorción ósea al incrementar el número de osteoblastos y la tasa de actividades entre las células osteoclasticas individuales, aunque el efecto de la PTH parece ser multifactorial, ya que estimula los osteoblastos, aumenta la producción de proteasas y disminuye la actividad de los inhibidores de osteoclastos. Tiene acción directa sobre los osteoclastos mediada por el AMP cíclico y promueve la fusión de células mononucleares favoreciendo la formación de células gigantes multinucleadas (Bakker, 2003). La principal función de la vitamina D 3 es la de aumentar la actividad resortiva de los osteoclastos presentes sin aumentar su numero (Suda, 2003). El papel fisiológico de la calcitonina es menos conocido aunque se sabe que participa en la embriogénesis del esqueleto (etapa de formación y crecimiento acelerado del hueso) ya que es un agente con gran potencia anti-resortiva (antiosteoclastica). La calcitonina produce inhibición de la actividad osteoclastica e induce la apoptosis de los osteoclastos (Zaidi, 2002). 30

31 5. SISTEMA INMUNE EN OSTEOCLASTOGÉNESIS Muchos estudios han investigado la relación entre el sistema inmune y el sistema óseo en varios modelos animales de enfermedades humanas. Sin embargo las bases moleculares y celulares de la unión entre estos dos sistemas es aún desconocida. Aunque actualmente se tiene conocimiento de que los osteoclastos, los cuales son mediadores importantes del balance óseo, se originan a partir de precursores hematopoyéticos que también dan origen a células inmunes (Rho, 2004). La osteoclastogénesis es positivamente regulada por la interacción de TRANCE TRANCE-R y negativamente regulada por OPG (Walsh, 2003). Muchos estudios muestran que células T activadas pueden inducir osteoclastogénesis a través de la expresión de TRANCE. De otra parte células T activadas que producen interferón - γ (INF-γ) pueden inhibir la osteoclastogénesis por interferir con la vía de señalización TRANCE- TRANCE-R (Figura 3). Esto sugiere que células T activadas regulan, tanto positiva como negativamente, la osteoclastogénesis (Rho, 2004). El papel de las células T activadas en la osteoclastogénesis puede depender de la acción de TRANCE y la acción negativa del INF-γ. Este balance además puede verse afectado por factores sistémicos y locales, incluyendo infecciones de origen microbiano, nutrición, metabolismo, factores mecánicos, hormonas y citocinas tales como TNFs e Interleucinas (Rho, 2004). 31

32 Figura 3. Papel de la célula T activada en la formación y diferenciación de osteoclastos Rho, J., Takami, M. and Choi Y. (2004). Osteoimmunology: Interactions of the Immune and Skeletal System. Molecules and Cells. 17,

33 Varias citocinas inflamatorias han mostrado jugar un papel importante en la osteoclastogénesis, incluyendo INF-α, INF-β e INF-γ. El efecto negativo de esta ultima citocina en la osteoclastogénesis ha sido mostrado y bien caracterizado. Ratones inyectados con INF-γ muestran defectos en la formación de osteoclastos multinucleados. Estos hallazgos fueron observados por Takayanagi quien mostró que INF-γ producido por células T bloquea la osteoclastogénesis al interferir con la señalización TRANCE/TRANCE-R (Figura 3). INF-γ además induce degradación de TRAF6, una molécula como ya se menciono critica en la vía de señalización TRANCE/TRANCE-R, bloqueando corriente abajo NF-κB y JNK. Se ha observado que ratones que carecen de INFGR1, un componente del receptor del INF-γ, muestran perdida de masa ósea debido a un aumento en la formación de osteoclastos y de la resorción ósea (Takanayanagi, 2002). INFα pueden también funcionar como un modulador negativo de la señalización de TRANCE/TRANCE-R al bloquear la activación de NF-κB y JNK (Takayanagi, 2000). Otros estudios han mostrado que INF-β también inhibe la osteoclastogénesis por interferir con la expresión de c-fos inducida por TRANCE, un factor de trascripción que es esencial para la formación de osteoclastos (Takayanagi, 2002). Ratones que carecen de IFNAR, un componente del receptor de INFα/β, presentan osteoclastos con una mayor capacidad funcional resultando en un fenotipo como el de osteoporosis (Takayanagi, 2002). La inflamación incrementa la osteoclastogénesis. Citocinas inflamatorias secretadas por células inmunes tales como TNF-α o IL-1, pueden inducir la expresión de TRANCE en osteoblastos jugando un papel central en perdida ósea por inflamación (Walsh, 2003). La IL-7 pueden actuar como un potente factor osteoclastogénico en condiciones de perdida ósea asociada a inflamación (Toraldo, 2003). Se ha observado que la concentración de 33

34 TRANCE soluble secretado por células T se encuentra elevado en respuesta a IL-7 (Toraldo, 2003). Se ha demostrado que numerosas citocinas y hormonas osteotrópicas regulan la formación y función de osteoclastos in vitro, pero su relevancia funcional in vivo no ha sido establecida. Por ejemplo citocinas derivadas de células T o macrófagos, tales como, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, CD40L factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF) y proteína inflamatoria del macrófago (MIP-1), han mostrado regular la formación y función de osteoclastos in vitro (Toraldo, 2003). El papel de estas citocinas in vivo no ha sido claramente diferenciado. Ahora bien, IL-6 potencialmente estimula la formación de osteoclastos a través de la inducción de TNF-α e IL-1 las cuales son secretadas en mieloma múltiple y llevan a un incremento de la expresión de TRANCE (Toraldo, 2003) La hipercalcemia es una de las manifestaciones clínicas más frecuentes y serias asociadas con la acumulación de osteoclastos y marcadores de resorción ósea (Stewart, 2002). IL-4 suprime el desarrollo de los osteoclastos y la función de osteoclastos maduros por un mecanismo dependiente de STAT6, que inhibe de manera irreversible la diferenciación programada de osteoclatos activados vía TRANCE (Wei, 2002). IL-18 e IL-12 pueden también sinergicamente inhibir la actividad de resorción ósea pero el mecanismo no ha sido identificado in vivo. En conclusión existe evidencia que sugiere que las células T juegan un papel crítico en el desarrollo y función de los osteoclastos, a través de la señalización cruzada entre INF y TRANCE en remodelamiento óseo (Horwood, 1998) 34

35 6. UTILIDAD CLINICA DE LOS MARCADORES DE REMODELAMIENTO ÓSEO Los marcadores de recambio óseo son sustancias presentes en la sangre y la orina, que son producidas o liberadas durante la renovación ósea. Básicamente son de dos tipos enzimas o proteínas secretadas por los osteoblastos o los osteoclastos y sustancias producidas durante la formación o destrucción del colágeno tipo I, la principal proteína de la matriz ósea (Srivastava, 2005). El remodelamiento óseo depende de los procesos de resorción y formación ósea, acoplados en una secuencia orquestada, iniciada por los osteoclastos y seguida por los osteoblastos. Grupos de osteoblastos y osteoclastos, trabajando sincrónicamente se organizan formando las llamadas unidades remodeladoras del hueso (BMU), las cuales se encargan de recambiar una cantidad determinada de hueso en un sitio especifico del esqueleto. Una BMU mantiene su integridad funcional por 4 a 8 meses, con un rango de 3 meses a 2 años. Aproximadamente un millón de BMU están activas en el esqueleto de un adulto sano, en un momento dado, con una tasa de recambio óseo anual de alrededor del 8-10%. En el calcáneo, las BMU crean lagunas y ellas se mueven a través de la superficie; en hueso cortical, BMU se mueven a través de la matriz ósea incrementando la porosidad (Srivastava, 2005). Durante la resorción ósea, los osteoclastos crean lagunas de resorción ósea con microambientes de ph bajos, donde se disuelve la matriz inorgánica exponiendo la matriz orgánica (mas del 90% de la matriz orgánica esta compuesta de colágeno tipo I). A medida que la resorción ósea avanza las enzimas de los osteoclastos digieren la matriz ósea orgánica liberando 35

36 productos de colágeno tipo I, los cuales incluyen fragmentos de péptidos de ambos extremos, es decir telopéptidos N-terminales del colágeno tipo I llamados NTx y telopéptidos C-terminales del colágeno tipo I llamados CTx y anillos estructurales llamados crosslink de piridinolina (Bonde, 1994). Normalmente la laguna de resorción creada por los osteoclastos es completamente llena por material osteoide secretado por los osteoblastos. Las células mesenquimales son atraídas por las BMU a los sitios de resorción y estas finalmente se diferencian a osteoblastos. Los osteoblastos activos secretan osteocalcina (OC), péptidos del pro-colágeno tipo I (Nterminal PINP y C terminal PICP) y fosfatasa alcalina especifica de hueso (ALP); la concentración de OC, PINP, PICP y ALP en suero se correlaciona con la tasa de formación ósea (Miller, 1999). La formación ósea se completa con la mineralización, la cual ocurre en dos fases. La primera fase ocurre inmediatamente después de la formación del osteoide, cuando los cristales de hidroxiapatita son depositados entre la matriz orgánica. La segunda fase incluye un proceso de mineralización más lento que se extiende por meses a medida que más mineral es adicionado. Secundario a la mineralización incrementa la densidad mineral ósea, pero no el volumen de hueso nuevo (Agerback, 1991). La formación y resorción ósea se encuentra en equilibrio en un individuo sano. El pico máximo de masa ósea se alcanza a los 30 años tanto en mujeres como en hombres y aproximadamente 0.4% de hueso es perdido por año después de esta edad. Adicionalmente del 1% al 2% de hueso es perdido por año en los primeros 5 años de la menopausia (Manolagas, 2000). 36

37 Desde el punto de vista clínico es útil distinguir los marcadores de formación (expresión de la actividad osteoblastica) y los marcadores de la resorción (índice de la actividad osteoclastica) (Tabla 2), aun cuando debe tenerse en cuenta que algunos marcadores reflejan, al menos en parte, ambas fases del ciclo de renovación ósea. Tabla 2. Marcadores de Remodelamiento Óseo FORMACIÓN RESORCIÓN Marcador Origen Marcador Origen Fosfatasa Alcalina Total Hueso, hígado, TRAP Hueso, plaquetas intestino, riñón, placenta Fosfatasa Alcalina Ósea Hueso Piridinolina Hueso, cartílago, tendón, vasos sanguíneos Osteocalcina Hueso Plaquetas Deoxipiridinolina Hueso, Dentina Péptidos del procolágeno 1 Hueso, tejidos blandos, piel N-telopéptidos Hueso (colágeno 1) C-telopéptidos Hueso (colágeno 1) Hidroxiprolina Hueso, cartílago, tejidos blando, piel Sialoproteína Hueso, dentina Delmas, P. D., Eastell, R. and Garmero, P. (2000). The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. Osteoporosis. Suppl

38 Por otra parte, la mayoría de los marcadores se encuentran no solo en el hueso, si no en otros tejidos lo que les resta especificidad. Además, los marcadores bioquímicos no son específicos de enfermedad pero reflejan alteraciones en el metabolismo esquelético (Srivastava, 2005). 6.1 TIPOS DE MARCADORES Marcadores de Formación Ósea Fosfatasa Alcalina Total y Fosfatasa Alcalina Ósea. La fosfatasa alcalina (FA) es una enzima que interviene en la formación ósea y en la mineralización del osteoide. Aunque puede originarse en muchos tejidos, en condiciones normales 50% de la FA sérica proviene del hígado y el otro 50% es de procedencia ósea (Delmas, 2000) Osteocalcina. La osteocalcina es una proteína con tres residuos de ácido gamma-carboxiglutámico, que le proporcionan una característica de apetencia por el calcio. Cuando se forma, parte de ella no se deposita en el hueso, sino que pasa a la sangre, donde su determinación proporciona un índice de la actividad osteoblástica (Woitge, 2001) Propéptidos amino y carboxiterminal del procolágeno I. El colágeno del hueso procede de una molécula de procolágeno sintetizada por los osteoblastos. Al ser liberada sufre una escisión de sus extremos amino y carboxiterminal, que resulta en la formación de la molécula de colágeno por un lado y de los péptidos de los extremos amino y carboxilo por el otro. Estos se conocen como protelopéptidos amino y carboxiterminal del colágeno I (PINP PICP respectivamente), y constituyen también un índice de actividad osteoblástica (Delmas, 2000). 38

39 6.1.2 Marcadores de Resorción La mayor parte de los mismos son productos de la degradación de la molécula de colágeno Hidroxiprolina. La hidroxiprolina (HYP) es un aminoácido procedente de la destrucción del colágeno presente en los diferentes tejidos, e incluso del colágeno de la dieta. Lo primero le confiere una enorme inespecificidad, y lo segundo obliga a hacer una dieta especial cuando se le quiere determinar. La HYP se mide en orina; una alternativa a la realización de la dieta exenta de colágeno, es su determinación en la orina de la segunda micción de la mañana, con el sujeto en ayunas. En la actualidad, la medición de HYP es de poca utilidad (Delmas, 2000) Puentes de Piridinolina y Deoxipiridinolina (o puentes piridínicos). La piridinolina (Pid) y la deoxipiridinolina (Dpid) son puentes formados entre las regiones terminales de las fibras de colágeno, durante su maduración. La degradación del colágeno origina la liberación de los puentes y de los distintos péptidos, constituye en consecuencia un índice de la resorción ósea. Son marcadores mucho más específicos que la HYP, porque son independientes de la dieta y también porque se encuentran en pocos tejidos diferentes al hueso (la Pid se encuentra también en el cartílago, los ligamentos y los vasos. La Dpid en la dentina). Los puentes piridínicos (Pid Dpid) se determinan en la orina (Woitge, 2001) Péptidos Terminales o Telopéptidos del Colágeno. Los péptidos terminales o telopéptidos se pueden medir en sangre o en orina. El telopéptido carboxiterminal se puede determinar en dos formas, la primera el octapéptido CTX (Carboxi Terminal), también conocido como crosslaps; la segunda, el ICTP (Colagen TeloPeptide I) o CTX-MMP (péptido 39

40 Carboxiterminal generado por metaloproteasas de la Matriz). El telopéptido aminoterminal constituye el NXT u osteomark. Actualmente los N o C telopéptidos se consideran los mejores índices de recambio óseo (Woitge, 2001) Fosfatasa Ácida Resistente a Tartrato. Es una enzima implicada en la actividad osteoclastica; se determina en la sangre. La complejidad de la técnica y su relativa inespecificidad la hacen de poca utilidad (Delmas, 2000). 40

41 5. CONCLUSIONES Los osteoclastos son componentes críticos en el mantenimiento de la homeostasis ósea, y se originan a partir de precursores hematopoyéticos que dan origen a células del Sistema Inmune. Existe una clara relación entre el Sistema Inmune y el Sistema Óseo dependiente en ocasiones de diferentes citocinas. De estas citocinas las cuales inicialmente se creía tenían un papel único en la regulación del sistema inmune ahora se conoce que participan en la diferenciación y función de los osteoclastos, de manera positiva o negativa en la homeostasis ósea. 41

42 BIBLIOGRAFIA 1. Agerback, M. O., Eriksen, E. F., Kragstrup, J., Mosekilde, L. and Melsen, F. (1991). A reconstruction of the remodeling cycle in normal human cortical iliac bone. Bone Miner. 12, Ahlen, J., Andersson, S., Mukohyama, H. Roth, C., Backman, A. Conoway, H. H. and Lerner, U. H. (2002). Characterization of the bone-resorptive effect of interleukin-11 in cultured mouse calvarias bones. Bone 31, Ahmad, A. M., Hopkins, M. T., Fraser, W. D., Ooi, C. G., Durham, B. H. and Vora, J. P. (2003). Parathyroid hormone secretory pattern, circulating activity, and effect on bone turnover in adult growth hormone deficiency. Bone. 32, Alliston, T., Choy, L., Ducy, P., Karsenty, G. and DeryncK, R. (2001) TGF-β induced repression of CBFA1 by Smad3 decreases cbfa1 and osteocalcin expression and inhibits osteoblast differentiation. Embo Journal. 20, Arron, J. R. and Choi, Y. (2000). Bone versus immune system. Nature 408, Bakker, A. D., Joldersma, M., Klein-Nulend, J. and Burger, E. H. (2003). Interactive effects of parathyroid hormone and mechanical stress on nitric oxide and prostaglandin production by primary mouse osteoblastic cells. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 42

43 7. Baylink, D. J., Finkelman R. D. and Mohan, S. (1993). Growth factors to stimulate bone formation. J. Bone Miner Res. 8 suppl 2, s565 s Berenson, J. R. (2002). Treatment of hypercalcemia of malignancy with bisphosphonates. Semin. Oncol. 29, Bonde, M., Qvist, P., Fledelius, C., Iris, R. J. and Christiansen, C. (1994). Immunoassay for quantifying type I collagen degradation products in urine evaluated. Clin Chem. 40, Boyle, W. J., Simonet, W. S. and Lacey, D. L. (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature Canalis, E., Economides, A. N. and Gazzerro, E. (2003). Bone morphogenetic proteins, their antagonist and the skeleton. 24, Chagraoui, H., Tulliez, M., Smayra, T., Komura, E., Giraudier, S., Yun, T., Lassau, N., Vainchenker, W. And Wendling, F. (2003). Stimulation of osteoprotegerin production is responsible for osteosclerosis in mice overexpressing TPO. Blood. 101, Darnay, B. G., Ni, J., Moore, P. A. and Aggarwal, B. B. (1999). Activation of NF-kappa B by RANK requires tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF) 6 and NF-kappa B inducing kinase. Identification of a novel TRAF6 interaction motif. J. Biol. Chem. 274,

44 14. Delmas, P. D., Eastell, R. and Garmero. (2000). The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. Osteoporosis. Suppl Dougall, W. C., Glaccum, M., Charrier, K., Rohrbach, K., Brasel, K., De Smedt, T., Daro, E., Smith, J., Tometsko, M. E., Maliszewski, C. R., Armstrong, A., Shen, V., Bain, S., Cosman, D., Anderson, D., Morrissey, P. J., Peschon, J. J. and Schuh, J. (1999). RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev. 13, Helfrinch, M. H., Hobson, R. P., Grabowski, P. S., Zurbriggen, A., Cosby, S. L., Dickson, G. R., Frase, W. D., Ooi, C. G., Selby, P. L., Crisp, A. J., Wallace, R. G., Kahn, S. and Ralston, S. H. (2000). A negative search for a paramyxoviral etiology of Paget s disease of bone: molecular, immunogical and ultrastructural studies in UK patients. J. Bone Miner Res. 15, Helfrinch, M. H. and Horton, M. A. (1999). Integrins and adhesion molecules. In: Seibel, M. J., Robins, S. P., Bilezikan, J. P., editors. Dynamic of bone and cartilage metabolism. San Diego: Academic Press Horwood, N. J., Udagawa, N., Elliott, J., Grail, D., Okamura, H., Kurimoto, M., Dunn, A. R., Martin, T. and Gillespie, M. T. (1998). Interleukin 18 inhibits osteoclast formation via T cell production of granulocyte macrophage colony stimulating factor. J. Clin. Invest. vol