Desarrollo y Validación de Técnicas Analíticas
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- Pablo Crespo Poblete
- hace 6 años
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1 Desarrollo y Validación de Técnicas Analíticas Nerea Leal Eguiluz DynaKin, S.L. Farmacoterapia Personalizada en Oncología 3 de julio de 2009
2 Definiciones Método Bioanálitico: conjunto de todos los procedimientos involucrados en la obtención, tratamiento, almacenamiento y análisis de muestras (especímenes) biológicas para la determinación cuantitativa de una sustancia en una matriz biológica determinada. Validación de Métodos Bioanáliticos: establecimiento de la evidencia documentada de que un método bioanalítico es lo suficientemente fiable para la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones de calidad establecidas previamente. Slide 2
3 Método Bioanálitico Toma de Muestra Transporte y Almacenamiento Adición ESTÁNDAR INTERNO Laboratorio de Bioanálisis Especímen a analizar (PLASMA) Precipitación de proteínas Dilución Extracción líquido-líquido Extracción en fase sólida Cromatogragía (LC): La cromatografía es un método de separación; se basa en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Espectrometría de Masas (MS/MS): es una técnica experimental que permite la medición de iones derivados de moléculas. El espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-carga) LC/MS/MS Producto Estándar Interno Slide 3
4 Definiciones Método Bioanálitico: conjunto de todos los procedimientos involucrados en la obtención, tratamiento, almacenamiento y análisis de muestras (especímenes) biológicas para la determinación cuantitativa de una sustancia en una matriz biológica determinada. Validación de Métodos Bioanáliticos: establecimiento de la evidencia documentada de que un método bioanalítico es lo suficientemente fiable para la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones de calidad establecidas previamente. Slide 4
5 Parámetros de Validación 1.- Selectividad Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar los analitos de interés de forma inequívoca sin interferencia de otras sustancias presentes en la matriz de la muestra. 2.- Linealidad Denominada normalmente curva patrón o curva de calibración. La linealidad de un método es su capacidad para obtener (dentro de un cierto intervalo) resultados que son directamente proporcionales a la concentración en la muestra de la sustancia que se pretende analizar. 3.- Exactitud Capacidad del método analítico para proporcionar resultados lo más próximos posible a los valores que son aceptados convencionalmente como verdaderos o reales 4.- Precisión Grado de dispersión de los resultados analíticos respecto a su valor medio. 5.- Límite de cuantificación inferior Es la mínima concentración de un analito que se puede determinar con una exactitud y precisión adecuadas 6.- Estabilidad 7.- Otros Parámetros: Recuperación Robustez Reproducibilidad Slide 5
6 1.- Selectividad Comprobación que los compuestos medidos son los analitos de interés y que su cuantificación no se ve afectada por la presencia de la matriz biológica, ni por metabolitos del compuesto o productos de degradación, ni por fármacos administrados conjuntamente. Procedimiento: Analizar 6 blancos de procedencias distintas. Criterio de aceptación: Las respuestas de los picos interferentes en el tiempo de retención de los analitos deberán ser menores al 20% de la respuesta del límite de cuantificación. Blanco LLOQ Slide 6
7 1.- Selectividad Para MS/MS evaluar Efecto Matriz (EM) analizanado 6 blancos de procedencias distintas: Respuesta EM = Respuesta Pico Pico Presencia Ausencia Iones Iones Matriz Matriz Criterio de aceptación: la variabilidad del efecto matriz, determinada como coeficiente de variación, no debe superar el 15%. Slide 7
8 2.- Linealidad Se debe demostrar la relación entre la concentración del analito y la respuesta del detector, y esta respuesta debe estar bien definida y ser reproducible. Para ello, se debe utilizar como curva de calibrado el modelo más simple que describa la relación entre la concentración del analito y la respuesta del detector. Procedimiento: 1. Preparación de los patrones de calibración en la misma la misma matriz que las muestras a cuantificar. 2. Un mínimo de 6 muestras patrón distribuidas uniformemente a lo largo del rango de concentraciones, junto con un blanco y una muestra cero. 3. Evaluación de un mínimo de tres curvas de calibrado. Estas curvas se realizarán en diferentes días (1 curva/1 día). Siempre que sea posible, se realizarán mediante pesadas independientes para eliminar el posible error sistemático que podría arrastrar la pesada. Criterio de aceptación: Al menos 2/3 de los patrones deben presentar valor de desviación 15% (o 20% para el límite de cuantificación inferior) Slide 8
9 2.- Linealidad Ejemplo: Slide 9
10 3.- Exactitud La exactitud debe valorarse a dos niveles: intraensayo, representativa de la variabilidad obtenida en las mismas condiciones de trabajo, e interensayo, representativa de la variabilidad obtenida en diferentes series analíticas. Procedimiento: Deben realizarse como mínimo tres ensayos en días diferentes (1 ensayo/1 día). Para ello, se prepararán al menos tres muestras de tres concentraciones (baja, media y alta) dentro del rango establecido: nivel bajo: inferior o igual a tres veces el límite de cuantificación inferior nivel medio: la mitad del rango de concentración nivel alto: entre el 75-90% del patrón de calibrado de mayor concentración Criterio de aceptación: La exactitud intra e interensayo, expresada como E.R. (%), deberá estar comprendida entre ±15% del valor de la concentración real para las concentraciones baja, media y alta. Slide 10
11 4.- Precisión Debe valorarse a dos niveles: intraensayo, representativa de la variabilidad obtenida en las mismas condiciones de trabajo, e interensayo, representativa de la variabilidad obtenida en diferentes series analíticas. Procedimiento: Deben realizarse como mínimo tres ensayos en días diferentes (1 ensayo/1 día). Para ello, se prepararán al menos tres muestras de tres concentraciones (baja, media y alta) dentro del rango establecido: nivel bajo: inferior o igual a tres veces el límite de cuantificación inferior nivel medio: la mitad del rango de concentración nivel alto: entre el 75-90% del patrón de calibrado de mayor concentración Criterio de aceptación: La precisión intra e interensayo, expresada como coeficiente de variación (C.V.) deberá estar ser 15% para las tres concentraciones baja, media y alta. Slide 11
12 4.- Precisión Ejemplo: Slide 12
13 5.- Límite de Cuantificación Procedimiento: Se prepararán, 5 muestras de analito de la concentración menor. Criterio de aceptación: La respuesta del analito en el límite de cuantificación debe ser al menos cinco veces la respuesta de la muestra blanco. La precisión y la exactitud del límite de cuantificación deben ser inferiores al 20% en valores de coeficiente de variación y error relativo porcentual, respectivamente. Slide 13
14 6.- Estabilidad La estabilidad del fármaco en un fluido biológico depende de las condiciones de almacenamiento, las propiedades fisico-químicas del fármaco, la matriz biológica en la que se encuentra, el recipiente de envasado y las manipulaciones a las que pueda estar sometido durante la preparación de una muestra. En este apartado van a detallarse los estudios de estabilidad que deben considerarse en un protocolo estándar de validación: Estabilidad de la muestra tras varios ciclos de congelación/descongelación Estabilidad de la muestra a Tª ambiente Estabilidad de la muestra en congelación estabilidad de la muestra en el inyector automático estabilidad de las disoluciones patrón Slide 14
15 6.1.- Ciclos de Congelación/Descongelación Procedimiento: Evaluar la estabilidad de las muestras durante tres ciclos de congelación/descongelación: - tres replicados de 2 niveles de concentración (alto y bajo) Criterio de aceptación: Se compara el resultado con el valor teórico y, además, se calcularán la exactitud y la precisión (que deberán ser 15%). Slide 15
16 6.2.- Estabilidad a Tª ambiente Procedimiento: Tres replicados de 2 niveles de concentración (alto y bajo) se mantienen a Tª ambiente (o de trabajo) durante un período igual o superior al que las muestras problema permanecerán a esa temperatura durante los análisis (generalmente se analizan pasadas 24 horas). Criterio de aceptación: Se compara el resultado con el valor teórico y, además, se calcularán la exactitud y la precisión (que deberán ser 15%). Slide 16
17 6.3.- Estabilidad en durante el Almacenamiento Procedimiento: Tres replicados de 2 niveles de concentración se mantendrán en las mismas condiciones a las que se almacenarán las muestras a estudiar. Criterio de aceptación: El resultado obtenido (en cada nivel de concentración) durante el día del estudio de estabilidad se comparará con la media obtenida durante el primer día del estudio. Finalmente, se analizarán comparando el valor obtenido con el real y se calcularán la exactitud y la precisión (que deberán ser 15%). Slide 17
18 6.4.- Estabilidad en el carro de inyección Procedimiento: Deberá evaluarse la estabilidad del analito y del estándar interno durante el tiempo máximo de permanencia de las muestras ya procesadas en el inyector/procesador a la temperatura a la que se encontrarán en el mismo. Para este ensayo, se deberán analizar tres replicados de dos niveles de concentración del analito (un nivel alto y otro bajo). Generalmente, se estudiará la estabilidad a 24 y 48 horas, ya que es la validez máxima que se le asignará a las fases móviles de carácter acuoso. Criterio de aceptación: Los resultados de estos análisis se compararán con el valor real. Además, se establecerán la exactitud y la precisión (que deberán ser 15%) con los replicados de cada concentración. Slide 18
19 6.5.- Estabilidad de las disoluciones patrón La estabilidad de las disoluciones patrón del analito y del estándar interno debe ser evaluada a temperatura ambiente durante, al menos, 6 h (si además se desea determinar la estabilidad durante otro periodo, sólo habrá que describirlo en el protocolo correspondiente). Si las disoluciones patrón del analito y del estándar interno se refrigeran o congelan por un período de tiempo considerable (más de 12 h), se debe establecer la estabilidad en esas condiciones. Slide 19
20 7.- Otros Recuperación El cálculo de la recuperación se basará en la comparación entre la respuesta del analito y/o patrón interno, extraído de una muestra biológica y la respuesta de la misma cantidad de analito y/o patrón interno sin extraer (disuelto(s) en fase móvil; recuperación del 100%). Robustez Estudio del impacto de pequeños cambios (cambios de columna, fase móvil, etc.) en el método. Reproducibilidad (de muestras procedentes de un estudio) Estudio de la reproducibilidad del método en muestras reales. A la hora de llevar a cabo el análisis de muestras reales de un estudio, existen numerosos factores que pueden afectar a la cuantificación del analito con respecto a las muestras preparadas en el laboratorio para la validación de la técnica: interconversión fármaco-metabolito, presencia de metabolitos no identificados, falta de homogeneidad en la muestra, poblaciones especiales, etc. Slide 20
21 Documentación Generada 1.- Protocolo de Validación 2.- Informe de Validación 3.- PNT y Formularios Slide 21
22 Serie bioanalítica: Compound name: DK Correlation coefficient: r: , r 2 : Calibration curve: *x Response type: Internal Std, Area Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x Idoneidad del sistema Muestras Blanco y Cero Curva de Calibrado Muestras + Controles de Calidad (QC) Patrón calibración_1 Patrón calibración_2 Patrón calibración_3 Patrón calibración_4 Patrón calibración_5 Patrón calibración_6 Patrón calibración_7 Patrón calibración_8 Patrón calibración_9 Patrón calibración_10 Patrón calibración_11 Muestra_1 Muestra_2 Muestra_3 Muestra_4 QC.A_1 Muestra_5 Muestra_6 QC.B_1 Muestra_7 Muestra_8 Muestra_9 QC.A_2 Muestra_10 Muestra_11 Muestra_12 Muestra_13 Muestra_14 Muestra_15 QC.C_1 Muestra_16 Muestra_17 QC.B_2 Muestra_18 Muestra_19 Muestra_20 QC.B_2 Muestra_21 Muestra_22 Slide 22
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