PROYECTO GENOMA HUMANO Y PROYECTO ENCODE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO VARIACION GENÉTICA HUMANA IDENTIFICACIÓN DE GENES IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES

Transcripción

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2 GUIÓN DE LA CLASE PROYECTO GENOMA HUMANO Y PROYECTO ENCODE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO VARIACION GENÉTICA HUMANA IDENTIFICACIÓN DE GENES IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES

3 Diciembre 1999 Febrero : se inicia el proyecto 2000: Se completa el trabajo 2001: Los análisis del borrador son publicados. Abril de 2003: se completa el proyecto.

4 OBJETIVOS DEL PGH; GENERAR UN MAPA DE GENES 1. Identificar todos los genes y sus funciones (tratamiento de enfermedades geneticas, envejecimiento, cáncer..) 2. Recaudar información acerca de nuestro origen, el de nuestros antepasados y el de otras civilizaciones a través el análisis del ADN. 4. Conocer la huella genética mediante el análisis de la variabilidad genética.

5 ENCODE Encyclopedia of DNA Elements Publicado 30 artículos en Septiembre, Nature Encode explorer

6 PROYECTO ENCODE OBJETIVO (2003): analizar y explorar en profundidad los ELEMENTOS FUNCIONALES candidatos en el genoma humano. ELEMENTO FUNCIONAL: región del genoma que codifica un producto definido (por ejemplo: una proteína o RNA no codificante) o un proceso bioquímico reproducible (como la unión de proteínas o una estructura específica de la cromatina). GENES (codificantes y no codificantes) y sus transcritos. REGIONES TRANSCRIPCIONALES REGULADORAS. METODOLOGIA: Identificación y cuantificación de especies de RNA en la célula entera y en compartimentos subcelulares localizando proteínas de unión a DNA que interaccionan con regiones reguladoras en el genoma, incluyendo factores de transcripción, distintas versiones de histonas y otros marcadores y patrones de metilación del DNA

7 Todos estos datos se han recogido en una base de datos de acceso gratuito: (

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10 DNA Mitocondrial (mtdna) Multicopia ~16.5Kbp Herencia de tipo materna En algunos casos posee heteroplasmia (formas originales y mutadas coexisten) No sufre recombinación Menor tasa de cambio Más estable para análisis forenses

11 ORGNIZACION DEL GENOM,A HUMANO

12 GENES VARIAN EN TAMAÑO Y NÚMERO DE EXONES

13 GENES VARIAN EN TAMAÑO Y NÚMERO DE EXONES

14 SOLAPAMIENTO DE GENES

15 SPLICING ALTERNATIVO PROMOTORES ALTERNATIVOS

16 REDEFINICIÓN DEL CONCEPTO DE GEN

17 FUNCIONES DE LOS RNAs Estructurales, enzimáticas, regulatorias o pueden contener información rrna (ribosomas) trna (traducción) mrna (traducción proteínas) Ribozymas (enzimática) RNA telomerasa (enzimática) sirna (regulación) shrna (regulación) mirna (regulación) snrna snorna (splicing) grna (editing) Virus

18 ncrna: RNA no codificantes

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20 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA: mirna Interacciona con el 3 UTR de un mrna diana. Inhibe la TRADUCCIÓN sin inducir degradación Importante tambien para silenciar retrotransposones y retrovirus endógenos Importante en desarrollo y diferenciación. Relacionado con procesos tumorogénicos

21 mirna: reguladores antisentido de la expresión génica Union al 3 UTR de mrna impiden traducción

22 Cancer : fallo en regulación de la expresión génica por hipermetilacion de mirna.

23 Mutaciones en TARBP2 (TAR RNA binding protein 2), que codifica para un componente integral de DICER 1 en cancer esporádico y hereaditario porque afecta al procesamiento de mirna

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28 FAMILIAS MULTIGÉNICAS AGRUPADAS

29 FAMILIAS MULTIGÉNICAS AGRUPADAS

30 Pseudogenes:

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33 DNA altamente repetido en tandem

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35 Familias de transposones de mamíferos

36 SECUENCIAS REPETIDAS: secuencias LINE

37 SECUENCIAS REPETIDAS: secuencias LINE

38 GUIÓN DE LA CLASE PROYECTO GENOMA HUMANO Y PROYECTO ENCODE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO VARIACIÓN GENÉTICA HUMANA IDENTIFICACIÓN DE GENES IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES

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40 VARIACIÓN GENETICA HUMANA SNP (RFLPs): cambios nucleotidicos Copy number variation (CNV): grandes variaciones estructurales STR y VNTR : Repeticione en tandem. Ha revoluciondo el proceso de búsqueda de genes y de la genética de poblaciones.

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45 EFECTO EN EL FENOTIPO 20 millones de SNP; 1 SNP cada 150 bp ( 3,3 Gigas gdna)

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47 Primer proyecto de secuenciación completa de 1000 genomas por NGS Datos incluidos en una base de datos pública. Aporta información de los SNV que existen en el genoma en frecuencias < 1%. Muestras analizadas de todo el mundo

48 VARIACIÓN GENÉTICA HUMANA SNP (RFLPs): cambios nucleotidicos Copy number variation (CNV): grandes variaciones estructurales STR y VNTR : Repeticione en tandem. Ha revoluciondo el proceso de búsqueda de genes y de la genética de poblaciones.

49 Copy number variation (CNV) Una forma de variation genética humana: frente a dos copias de cada region en un cromosoma (diploide), algunas personas tienen amplificaciones o pérdidas (>1kb) en diferentes regiones del genoma Esto no incluye ni las translocaciones ni las inversiones Pueden existir entre 5& 240 de estas variaciones Son raramente causantes de enfermedad. 49

50 Copy number variation Population genomics

51 VARIACIÓN GENETICA HUMANA SNP (RFLPs): cambios nucleotidicos Copy number variation (CNV): grandes variaciones estructurales STR y VNTR : Repeticione en tandem. Ha revoluciondo el proceso de búsqueda de genes y de la genética de poblaciones.

52 Aplicaciones de los polimorfismos Pruebas de paternidad Medicina forense Evolución Huella genética Identificación de genes causantes enfermedad y de susceptibilidad HUELLA GENETICA

53 Aplicaciones de los MICROSATELITES en la Medicina forense identificación de individuos Se analizan diferentes microsatelites (5-15), lo que da un perfil de bandas para cada individuo Cada alelo tiene una frecuencia La frecuencia del perfil será el producto de dichas frecuencias

54 Marcadores genéticos: microsatelites DIPERSOS POR TODO EL GENOMA. LOS MAS FRECUENTES SON LOS DINUCLEOTIDOS.

55 Marcadores genéticos: microsatelites

56 ANÁLISIS DE REGIONES HIPERVARIABLES: HUELLA GENÉTICA Los perfiles de ADN varían de una persona a otra

57 Pruebas de paternidad padre C B A madre A D hijo 1 hijo 2 hijo 3 hijo 4? B C D

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61 IDENTIFICACIÓN DE GENES CLONAJE FUNCIONAL: basado en el conocimiento de la proteína implicada CLONAJE POSICIONAL: basado en el mapeo genómico CLONAJE IN SILICO : análisis de genes candidato y genómica comparativa SECUENCIACIÓN MASIVA: análisis completo del genoma

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64 ESTRATEGIAS DE IDENTIFICACION DE GENES

65 CDG: DEFECTOS CONGÉNITOS DE GLICOSILACIÓN Test bioquímicos Analisis de ligamiento Arrays CGH Mapeo por homocigosidad Secuenciacion del exomas otros

66 Nature genetics 40 (1): 32-34, 2008

67 Looking into de Future Next generation sequencing BÚSQUEDA DE GENES Y MUTACIONES PARA HACER MEDICINA PERSONALIZDA Es una tecnología muy potente para el diagnóstico de cáncer genético, ceguera, retinitis pigmentosa sordera Sequencing power : billion bp/dis Coste: decrece rapidamante desde millones de dolares (2008) hasta 2000 euros

68 DNA Sequencing > 2005 Radio - gel Fluorescent - capillary Next generation Thousand bp / day Million bp / day Billion bp / day

69 NEXT GENERATION PLATFORMS Roche 454-FLX Applied Biosystems SOLID Illumina GA Solexa

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72 Looking into de Future Next generation sequencing

73 Looking into de Future Next generation sequencing ANALISIS DEL GENOMA COMPLETO

74 NEXT GENERATION SEQUENCING AS DIAGNOSTIC TOOL Capturar la secuencia de interés: ANÁLISIS DEL EXOMA CELULAR REGION GENOMICA CODIFICANTE: exones e intrones adyacentes

75 SECUENCIACION DEL GENOMA CELULAR: WES 176,266 exones de 18,409 genes.

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77 SECUENCIACION DEL EXOMA CELULAR: 20-30,000 VARIANTES COMPARADAS CON EL GENOMA 10,000 SON NO-SINONIMAS: MISSENSE, NONSENSE, SS, PEQUEÑAS DEL/INS. 90% SE ENCUENTRAN EN LAS BASES DE DATOS DE SNP (1000 Genomes Project or in-house db PUEDEN AFECTAR A LA FUNCION. La HERENCIA AYUDA A LA IDENTIFICACIÓN. AD: UNA MUTACION EN PACIANTES AR: DOS MUTACIONES

78 Secuenciacion de varias familias

79 Homozygous missense mutation at highly conserved position in SLC26A3 in GIT Choi M et al. PNAS 2009;106: by National Academy of Sciences

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81 ESTUDIOS FUNCIONALES

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84 DIAGNÓSTICO GENÉTICO

85 IDENTIFICACION DE MUTACIONES MUTACIONES UNICAS: Anemia falciforme MUTACIONES FRECUENTES: Sordera Hemocromatosis PANEL ES DE MUTACIONES: Fibrosis cistica Hipercolesterolemia familiar MUTACIONES RARAS: Cancer hereditario ESTUDIO DE MUTACIONES ESPECIFICAS ESCANEO DE MUTACIONES

86 GENETIC ANALYSIS SAMPLES Genetic prenatal diagnosis Whole blood, skin biopsies, buccal scrapes, Nucleic acid isolation DNA RNA (RT-PCR) Nucleotides changes Effect on splicing. High number of exons Fetal DNA in maternal blood

87 Easy tests Disease Gene Mutation Fragile X FMR1 Repeat FRAXE FMR2 Repeat Friedreich ataxia FRDA Repeat Haw River DRPLA Repeat Huntington type 1 HD Repeat Kennedy AR Repeat Myotonic dystrophy type 1 DMPK Repeat Spinocerebellar ataxia SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17 Repeat Alpha 1 antitrypsin PI 2 common mutations Charcot-Marie-Tooth Type 1A PMP22 1 common mutation Cystic fibrosis CFTR Common mutations Deafness GJB2 1 common mutation Hemochromatosis type1 HFE 2 common mutations Hereditary neuropathy (HNPP) PMP22 1 common mutation Sickle cell anemia HBB 1 common mutation Spinal muscular atrophy SMN1 1 common mutation Beta thalassemia HBB 1 exon

88 Schematic of a mutation (or SNP) chip assay. PANEL OF MUTATIONS: CYSTIC FIBROSIS

89 EL ARRAY CONTIENE SONDAS PARA DETECTAR 214 MUTACIONES EN LOS GENES LDLR, PCSK9 y APOB PARA EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR

90 BRCA test BRCA1 : 23 exones, 1863 AA, bp BRCA2 : 28 exones, 3418 AA, bp Total : > bp Mutaciones privadas

91 Direct sequencing the final step of scanning methods IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES MEDIANTE SECUENCIACIÓN normal C>T heterozygous AAATGTCAGC AAATGTCAGC

92 NEXT GENERATION SEQUENCING AS DIAGNOSTIC TOOL CAPTURA EXOMICA DE GENES CANDIDATOS Captura de 21 genes incluidos BRCA1 and BRCA2 de predisposición al cancer de mama y ovarios

93 PREDICCION DE PADECER CANCER DE MAMA Y OVARIO: ANALSIS DE UN PANEL DE 21 GENES DNA GERMINAL PACIENTE CAPTURA DE 21 GENES SECUENCIACION MASIVA ALINEAMIENTO GENOMA HUMANO SNP (dbsnp) Variantes nuevas BASE DE DATOS DE MUTACIONES PREDICCION EFFECT mrna MUTACIÓN PATOGÉNICA

94 ESTRATEGIA para la detección de mutaciones/genes mediante SECUENCIACIÓN MASIVA del EXOMA celular Filtro genetico Presencia en Human Genome Mutation Database (HGMD) Presencia en otras bases de datos: SNPdb, 1000 Genome Project, HapMap, etc Presencia en otras muestras del lab. (in-house data) Presencia en controles Presencia de una o dos mutaciones en el gen candidato Segregación con el fenotipo de la enfermedad Análisis funcional Secuenciación exoma Detección de variantes Variantes o genes candidatos Aplicación diagnóstica Filtro funcional Predicción de la naturaleza de la variante: Nonsense, frameshift Expresión del gen en el tejido diana Análisis de conservación evolutiva Predicción de patogenicidad in silico : PolyPhen2, SIFT, MutPred Secuenciación directa gen candidato