Cáncer de pulmón Biologia molecular

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1 Cáncer de pulmón Biologia molecular Ana Margarita Baldión Elorza Departamento de Patología y Laboratorio Clínico Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogotá

2 Cambio en el paradigma del estudio de neoplasias La expresión de moléculas, los cambios citogenéticos y los estudios moleculares adquieren un valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico

3 2005

4 Situación del cáncer de Pulmón Diagnostico tardío en la mayoría de los pacientes Neoplasia mas frecuente diagnosticada en el mundo Neoplasia de altísima mortalidad Sobrevida a 5 años del 15% sin variación en los últimos 30 años

5 Biomarcadores y Estudios Moleculares Enfermedad Diagnostico Pronostico Terapéutica Seguimiento Hematología Seno Cáncer Colon Ca. Pulmón GIST Próstata ? - Vejiga SNC

6 Situación del cáncer de Pulmón En la decada pasada los mayores avances en el estudios y manejo de cancer de pulmón especialmente el adnocarcinoma Inhibidores del EGFR Gefitinib 2002 Erlotinib 2003 Respuesta en un grupo de pacientes con Ca de Pulmón avanzado

7 1000 pacientes con ADENOCARCINOMA de pulmón en el National Cancer Institute Lung Cancer Mutation Consortium Kris MG, et al. J Clin Oncol 2011;29: (Suppl, abstract CRA 7506).

8 Cáncer de Pulmón y EGFR

9 Frecuencia de anormalidades moleculares Genetically informed lung cancer medicine. J Pathol 2011:

10 EGFR Receptor TK de la familia HER EGFR Localizado en Cromosoma 7p11.2, 28 exones en 200 kb Proteína de 464 aa, : extracelular-intramembranosa e intracelular Involucrado en señales relacionadas con : Proliferación Inhibición de apoptosis Incremento de angiogénesis

11 Familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico EGF, TGFα, β Cellulin Amphiregulin, HB-EGF No specific ligands - often acts as dimer partner Heregulins NRG2 NRG3 Heregulins β-cellulin TK TK TK erbb1 HER1 EGFR erbb2 HER2 neu erbb3 HER3 erbb4 HER4

12 Estructura Dominio extracelular Dominio transmembrana TK Dominio intracelular

13 EGFR Estimulación & dimerisación TK TK EGFR Homo Dimerisacion erbb1 HER1 EGFR TK erbb2 HER2 neu erbb3 HER3 TK erbb4 HER4

14 EGFR Función en celulas normales ATP TK TK ATP + Proliferación celular Transcripción genética Progresión ciclo celular Angiogénesis Antiapoptosis

15 EGFR estimulacion cont TK TK Hetero Dimerisacion TK erbb1 erbb2 HER1 HER2 EGFR Riesgo para cáncer neu erbb3 HER3 erbb4 HER4

16 EGFR señales de transducción en células tumorales TK PTEN PI3-K AKT py py STAT3 py GRB2 TK SOS RAS RAF MEK Proliferación/ maduración Quimioterapia / radioterapia resistancia Trasncripcion genetica G 1 M G 2 Angiogénesis S MAPK Supervivencia (anti-apoptosis) Metástasis

17 N Engl J Med 2011;364:947-55

18 Papel de los estudios moleculares Muestras: Biopsias, citologías, lavados ( células) Heterogeneidad intratumoral mínima (10%) Discordancias entre primario y metástasis dependiendo del gen (10-50%) Preferible el estudio sobre la recurrencia o metástasis (Potencial mayor número de anomalías moleculares)

19 Cáncer de Pulmón y EGFR Mutaciones en el EGFR pueden catalogarse en tres grupos Deleciones pequeñas en el marco de lectura en exón 19 ( Mejor sobrevida): 50% 20 variantes distintas Inserciones en el exón 20 (Resistentes 4%) Mutaciones sin sentido en el exón 21 (43%) y 18 (3%)

20

21

22 Selección de biomarcadores en pacientes que reciben inhibidores del EGFR Ø Expresión de EGFR por inmunohistoquímica Ø Número de copias del gen EGFR por FISH (Hibridación in situ con fluorescencia) 100 GGCGGGCCAAACTGCTG GGTGCG Ø Estudio de mutaciones en EGFR

23 PCR: Metodologías EGFR más económico, Rápido, mayor sensibilidad Tiempo real

24 Papel del patólogo en el estudio del Cáncer de Pulmón Papel del patólogo: Asegurarse que se estudia el tumor adecuado Garantizar un procesamiento adecuado Selección de los bloques de parafina: Alta celularidad tumoral >50% Realización de microdisección No utilizar tejidos decalcificados o fijados en etanol Evitar áreas de necrosis USCAP Long Course Target Therapy of Cancer Ladnyi M.

25 Aspectos prácticos 2. En qué momento? Momento del diagnóstico ideal (Escaso tejido, otros estudios futuro?) Adenocarcinomas en estadio avanzado III o IV 3. En qué tipo de muestra?: Primario vs Metástasis La mejor muestra (hasta 70% de discordancia) Tumor original en parafina Biopsias Citología de lavado o líquido pleural Citología por aspiración DNA tumoral sérico, plasmático o en sangre

26 Cáncer de Pulmón Rearreglos EML4-ALK ALK: receptor TK Múltiples fusiones Fusión EML4 ALK : Inversión pequeña dentro del brazo corto del Cr 2 que une el intron 13 del echinoderm microtubule associated protein-like 4 (EML4) con el intron 19 del ALK [inv(2) (p21;p23)]

27 Cáncer de Pulmón Rearreglos EML4-ALK

28 Cáncer de Pulmón Rearreglos EML4-ALK Tumores mucoproductores con células en anillo de sello Presencia se asocia a no respuesta a inhibidores del EGFR Rearreglos del ALK : no es un factor pronóstico favorable Usualmente en no fumadores Metodología de detección : FISH: Dual-color split-apart Positivo si > 15% de 50 células analizadas presentan la señal de ruptura acorde a las guias CAP/AMO Requiere observación por dos personas RT-PCR no recomendado: Falla frecuentes en tejidos parafinizados IHQ: poca sensibilidad, poca experiencia

29 Situación del cáncer de Pulmón En la actualidad hay 4 terapias aprobadas por FDA en el tratamiento del cáncer de pulmón Gefitinib 2002 Erlotinib 2003 Bevacizumab 2006 Crizotinib 2012

30 Diagnostico del carcinoma de células no pequeñas de pulmón era suficiente en el pasado Porque es necesario subclasificar? Erlotinib y gefitinib en mutaciones del EGFR Bevacizumab incrementa la incidencia de hemoptisis en carcinoma de células escamosas contraindicado 31% hemoptisis fatal Crizotinib en tumores EML4 ALK (linfoma anaplasico inhibidor de la quinasa ) carcinoma con células en anillo de sello Modern Pathology (2012); 25 S43 S57

31 Diagnostico del carcinoma de células no pequeñas de pulmón era suficiente en el pasado Porque es necesario subclasificar? En el pasado las su clasificaciones del CCNP no impacto en la terapia En el presente se observa impacto en carcinomas avanzados Patólogo: único que puede diferenciar un adenocarcinoma de un carcinoma de células escamosas Modern Pathology (2012); 25 S43 S57

32 Nueva clasificación carcinoma de pulmón Journal of Thoracic Oncology Volume 6, Number 2, February 2011

33 OBJETIVO IASLC (Asociación internacional para el estudio del ca pulmón), ATS, y la Sociedad Respiratoria Europea Propusieron una integración clínica, radiológica molecular y patológica Identificar factores pronóstico y predictivos y blancos terapéuticos

34 ADENOCARCINOMA MUCINOSO Vs NO MUCINOSO VARIANTES J Thorac Oncol. 2011;6:

35 Proliferación (< 5mm) de células atípicas Proliferación (< 3cm) revistiendo paredes con patrón lepídico alveolares y, a veces, bronquiolos Proliferación (< 3cm) con patrón lepídico y (Patrón lepídico). menos de 5 mm de invasión. Proliferación con más de 5 mm de invasión. J Thorac Oncol. 2011;6:

36 CLASIFICACION PARA BX Y CITOLOGIAS Mayoría de pctes con ca de pulmón localmente avanzado o con metástasis. Necesidad de distinguir entre ADC y Carcinoma escamocelular. ADC con mutaciones EGFR : terapia TKI, pemetrexed o bevacizumab

37 CLASIFICACION PARA BX Y CITOLOGIAS Uso racional del material de las bx y las citologías. Heterogeneidad histológica del cáncer del pulmón puede no ser representativa de todo el tumor. Muestras hetereogéneas hacen imposible el Dx de AIS, MIA, carcinoma de células grandes, o carcinoma pleomórfico Patrón de crecimiento lepídico : patrón de crecimiento no invasivo

38 USO MINIMO DE TINCIONES Un marcador para ADC y otro para escamocelular TTF-1: ADC, neumocitos, ayuda a confirmar tumor primario en 75 85%. Mucina: ADC.( NSCLC a favor de ADC) P63: carcinoma escamocelular (NSCLC a favor de escamocelular) CK5/6: carcinoma escamocelular CK7: MAS ADC que escamocelular,

39

40 La inmunohistoquímica puede excluir otros tumores primarios o metastásicos? Ayuda a tener claridad morfológica Ayuda a diferenciar de los carcinomas neuroendocrinos y otros primarios En algunos casos la inmunohistoquímica no aclara o excluye origen primario pulmonar Modern Pathology (2012); 25 S43 S57

41 RELEVANCIA PARA EL CLÍNCO Uso de inhibidores de tirosinkinasa (pemetrexed bevacizumab) en: Ø Adenocarcinomas Ø Carcinomas de célula no pequeña que favorecen adenocarcinoma Ø Carcinomas de célula no pequeña NOS

42

43 Manejo de las muestras para estudios moleculares Material disponible: Formol/Parafina Procesos pobremente estandarizados Calidad de los tejidos altamente variable Necesidad de conocer el impacto de los estudios moleculares y diseñar un proceso que permita realizar estudios de rutina y estudios moleculares

44 Principal objetivo Mayor cantidad y mejor calidad del tejido Relación células malignas/benignas Microdisección: >50% Fijación corta: 6-12 BX; 8-18 RX 10% Formol Neutro Solamente en laboratorios de referencia: > 95 S; 97% E Molecular Diagnostic of Lung Carcinomas Arch Pathol Lab Med Vol 135, May 2011

45 Metodología Selección de casos Búsqueda del bloque de cada caso Cortes de 10um a cada bloque 45

46 Microdisección del tejido tumoral La prueba es realizada sobre una muestra de tejido tumoral (en fresco o embebido en parafina)

47 Enriquecimiento de células tumorales por microdisección

48

49

50 Extracción de ADN a parer de ½ de tejido tumoral Reacción de PCR para amplificación de exones involucrados Electroforesis de los productos de PCR en un gel de agarosa al 3% 50

51 Verificación de amplificación

52 Secuenciación directa

53 Propuesta para manejo de biopsias con sospecha de carcinoma pulmonar Sospecha clínica de Carcinoma Cortes de Hematoxilina y Eosina Simultaneamente 2 cortes paralelos para posible FISH : ALK/EML4 Confirma Adenocarcinoma o no célula pequeña Microdisección Cortes de 10um a cada bloque EGFR 53

54 El manejo de las muestras en la medicina moderna Estamos preparados en los laboratorios de patología? NO

55 Conclusiones 1. El patólogo debe velar por que los procedimientos en el manejo de las muestras y en la detección sean los mejores contribuyendo a la seguridad de los pacientes y a la disminución en los errores 2. La responsabilidad en el logro de los objetivos es compartida con el clínico y el cirujano en el manejo adecuado de las muestras

56 Conclusiones 3. El patólogo es responsable del control de los factores analíticos y debe garantizar una adecuada interpretación y comunicación de los resultados. 4. A la luz de la terapéutica actual en cáncer la determinación incorrecta de los biomarcadores es un aspecto de vida o muerte; un error puede tener un impacto similar a un diagnóstico equivocado

57

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