MASTER DUAL STAINING KIT

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1 Avda. Conocimiento, 100 P.T. Ciencias de la Salud Granada Fax: Tlf.: MASTER DUAL STAINING KIT DESCRIPCIÓN: Master Dual Staining Kit contiene reactivos para llevar a cabo de forma manual o automatizada la doble tinción immunohistoquimica sobre secciones de tejidos humanos fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina. Este kit contiene un sistema de revelado basado en el sistema de Micropolímeros y es suficiente para la realización de 30 determinaciones siguiendo el protocolo recomendado. Presentación : La referencia/presentación general para este Kit es: MAD QK 30 test Esta referencia es para presentación en envases de Polietileno de Baja Densidad (LDPE) con gotero. En caso de que el usuario desee otro tipo de presentaciones (referencias/volúmenes diferentes) deberá contactar con el proveedor. Uso Previsto : Diagnóstico in vitro en la especie humana Condiciones de almacenamiento : Frigorífico entre 2 y 8ºC. Periodo de validez : El envase una vez abierto puede conservarse hasta la fecha de caducidad del reactivo señalada en la etiqueta. Si el reactivo ha sido almacenado en otras condiciones a las señaladas en este documento el usuario deberá chequear previamente su correcto funcionamiento teniendo en cuenta que la garantía del producto ya no es válida. Instrucciones especiales de manipulación: Este reactivo está especialmente diseñado para su manejo en los inmunoteñidores LabVision Autostainer 480 y 780. Advertencias y precauciones: 1) El producto solo debe ser manejado por usuarios entrenados y en laboratorios autorizados. Para su manejo en investigación existen otras presentaciones igualmente idóneas. 2) Téngase en cuenta que la última responsabilidad en la optimización e interpretación de las hibridaciones cromogénicas practicadas corresponde al facultativo responsable y los técnicos que emplean el kit y que, asimismo, este conjunto de reactivos no es más que una herramienta útil para la interpretación de los hallazgos morfológicos de cada caso en conjunción con otros tests diagnósticos y los pertinentes datos clínicos del paciente. 3) El reactivo contiene azida sódica (NaN3) como conservante. Aunque este producto es altamente tóxico y si se mezcla con agua o ácidos, principalmente en presencia de metales, existe peligro de explosión, estos riesgos están minimizados al máximo cuando se emplea a concentraciones inferiores al 0,05% como ocurre en este caso. No obstante para el manejo de este reactivo deben tomarse las siguientes precauciones: a) Uso de guantes y del equipo de protección establecido para las técnicas de hibridación e inmunohistoquímicas del laboratorio así como estricto respeto de las prácticas generales de seguridad existentes en el mismo; b) No almacenar los reactivos en envases metálicos ni emplear utillaje de esta naturaleza para su manejo; c) Almacenar los residuos para su eliminación reglada en contenedores apropiados según la normativa vigente en cada laboratorio. Nunca arrojarlos por el desagüe. POSIBLES COMBINACIONES DE ANTICUERPOS Y SUS APLICACIONES DIAGNÓSTICAS 1 : Mix anticuerpos Utilidad Foto MelanA+PHH3 (MAD MAD QD) Identificar con facilidad el número de mitosis en una lesión melánica 1 los anticuerpos utilizados no están incluidos en el kit Página 1 de 5

2 CK7+CDX2 (MAD QD+ MAD QD) Posible utilidad en diferenciar un tumor metastásico de origen intestinal de un tumor de origen pulmonar, pancreático, mamario o con origen primitivo en el ovario p504 (racemasa)+p63 (MAD QD) PIN cóctel diferenciar las áreas de próstata normal, PIN y adenocarcinoma acinar de próstata p63+c-erbb2 (MAD QD+ MAD QD) Valoración simultanea de la expresión proteica del gen HER2 tanto en el componente in situ como en el infiltrativo p501(prosteína)+p63 (MAD QD+ MAD QD) Diferenciar entre carcinoma urotelial y de próstata en posibles casos pobremente diferenciados y con morfología semejante p16 (RUO)+PHH3 (MAD QD+ MAD QD) Identificar el nivel de las mitosis en un epitelio cervical displásico. Página 2 de 5

3 p16(ruo)+ki67 (MAD QD+ MAD QD) Valoración del índice mitótico en un epitelio displásico cervical. Útil en la valoración de los extendidos citológicos cervicales CD20+CD3 (MAD QD+ MAD QD) Diferenciar entre el componente B y T de una proliferación linfoide CD4+CD8 (MAD QD+ MAD QD) Visualización simultanea de los linfocitos CD4 y CD8 positivos; de utilidad en proliferaciones linfoides de linfocitos T cutáneas CD10+Bcl2 (MAD QD+ MAD QD) Diferenciar entre el componente linfoide de tipo centro germinal benigno y maligno LIMITACIONES Y PRECAUCIONES DEL REACTIVO El uso sobre tejido congelado no ha sido evaluado. Las mezclas de anticuerpos usadas en la doble tinción inmunohistoquímica deben ser las recomendadas y suministradas por el proveedor. En caso contrario debe tenerse en cuenta que los dos anticuerpos tienen que proceder de animales diferentes (ratón/conejo). Debido a la presencia de un cromógeno soluble en soluciones alcohólicas, la deshidratación debe ser realizada al aire o mediante temperatura y el montaje hecho con medios de montaje acuosos. TIPOS DE MUESTRA Página 3 de 5

4 Secciones de 4 micras de espesor montadas sobre portaobjetos especiales para inmunohistoquímica y obtenidas de tejidos incluidos en parafina, preferiblemente fijados en formalina tamponada. PRINCIPIO DEL MÉTODO ANALÍTICO El objeto de la tinción inmunohistoquímica es convertir en una tinción visible la reacción anticuerpo-antígeno específica de las moleculas que se pretenden a estudiar en células o tejidos. De esta manera el Master Dual Staining Kit presenta un conjunto de reactivos altamente específicos y sensibles que permite la doble visualización de la unión de dos anticuerpos a sus antígenos específicos. El funcionamiento de este kit se basa en el uso de un mix de dos micropolímeros marcados cada uno con enzimas diferentes (Peroxidasa y Fosfatasa Alcalina), que reconocen cada uno a las inmunoglobulinas (anticuerpos) desarrolladas en conejo y ratón respectivamente. En el caso de haber ocurrido reacción entre los anticuerpos primarios y sus antígenos, los micropolimeros se unen específicamente a cada uno de ellos y debido al marcaje enzimático, añadiendo los cromógenos y los substratos correspondientes, se obtienen precipitados de diferentes colores que permiten detectar al microscopio la presencia de los antígenos específicos. En el caso del Master Dual Staining Kit, los precipitados obtenidos serán de color marrón para los anticuerpos desarrollados en Ratón y de color rojo/purpura para anticuerpos de Conejo. COMPONENTES Y REACTIVOS SUBMINISTRADOS EN EL KIT: Bloqueante de la Peroxidasa Endógena MAD Q-10 10ML Ultrabloqueante MAD QK-A 10ML Mix de Polímeros MAD QK-C 10ML Cromógeno DAB: Tampón substrato MAD QK-Q1 10ML DAB MAD QK-B 1ML Cromógeno Rojo Tampón substrato MAD QK-A 10ML Cromógeno rojo MAD QK-B 1ML EQUIPAMIENTO Y MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO EN EL KIT Módulo PT Buffers para el Módulo PT - CITRATO ph6 - EDTA ph8 - TRIS EDTA ph9 Portaobjetos tratados con silano o tratados eléctricamente Cubreobjetos Estufa Batería de desparafinado-hidratación (Xileno, etanol absoluto y a concentraciones del 80% y 70%) Tampón TBS - Tween 20 Hematoxilina de contraste Microscopio óptico PROTOCOLO TÉCNICO PARA LA DOBLE TINCIÓN INMUNOHISTOQUIMICA SOBRE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA UTILIZANDO EL MASTER DUAL STAINING KIT 1. Desparafinado y Recuperación antigénica por Calor a. Incubar los portaobjetos con las secciones de tejido parafinado en la estufa a 60ºC toda la noche. b. Colocar los portaobjetos en el módulo PT usando las siguientes condiciones: - Precalentar a 65ºC - Desparafinación y recuperación 20 minutos a 95ºC 2. Detección y revelado (manual o automático) Página 4 de 5

5 a. Lavar en Tampón TBS - Tween 20 a TA b. Aplicar sobre el tejido 200 µl del bloqueante de la Peroxidasa e incubar 10 min a TA c. Lavar 3 veces en tampón TBS Tween 20. d. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Ultrabloqueante e incubar 8 min a TA. e. Desechar sin lavar. f. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Mix de Anticuerpos e incubar* 10 min a TA. g. Lavar 3 veces en tampón TBS Tween 20. h. Aplicar sobre el tejido 200 µl del Mix de Polímeros e incubar 30 min a TA. i. Lavar 3 veces en Agua Destilada j. Mezclar una gota del cromógeno DAB en 1 ml de Substrato del DAB y aplicar la solución resultante sobre el tejido; incubar 5 min a TA k. Lavar 3 veces en tampón TBS Tween 20. l. Mezclar una gota del cromógeno Rojo en 2.5 ml de Substrato del Crómogeno Rojo y aplicar la solución resultante sobre el tejido; incubar 10 min a TA m. Lavar 3 veces en Agua destilada. 5. Tinción de Contraste y montaje a. Teñir con Hematoxilina de Contraste 30 segundos. b. Azular en agua corriente. c. Deshidratar (secar al aire o con temperatura). d. Montar con medio de montaje acuoso e interpretar los resultados al microscopio. (*) Entre 10 y 20 minutos. Para conocer las condiciones adecuadas de cada mix de anticuerpos debe contactar con el proveedor. INCIDENCIAS Y RECLAMACIONES Se recomienda seguir exhaustivamente todas las indicaciones contenidas en estas instrucciones técnicas. En caso de que se produzcan resultados atípicos o no esperados se ruega contacten con el delegado comercial de la zona representante de Vitro S.A. En su defecto, pueden dirigirse a Master Diagnóstica en la dirección comercial, telefónica o electrónica arriba indicada. LIMITACIONES DEL REACTIVO Si se han cumplido todas las condiciones de almacenamiento y manejo en el laboratorio, este reactivo está garantizado durante todo su tiempo de caducidad. Master Diagnóstica no es responsable de los daños, lesiones personales o pérdidas económicas en que este reactivo pueda encontrarse implicado. BIBLIOGRAFÍA: 1. Xiao Chen, Dan-Bi Cho, Ping-Chang Yang. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci May; 2(5): Chris M. van der Loos. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. J Histochem Cytochem April; 56(4): T. van Agthoven, M. Timmermans, J. A. Foekens, L. C. Dorssers, S. C. Henzen-Logmans. Differential expression of estrogen, progesterone, and epidermal growth factor receptors in normal, benign, and malignant human breast tissues using dual staining immunohistochemistry. Am J Pathol June; 144(6): Ritu Bhalla, Lakshmi P Kunju, Scott A Tomlins, Kelly Christopherson, Connie Cortez, Shannon Carskadon, Javed Siddiqui, Kyung Park, Juan Miguel Mosquera, Gary Pestano, Mark A Rubin, Arul Chinnaiyan, Nallasivam Palanisamy. Novel Dual Color Immunohistochemical methods for detecting ERG-PTEN and ERG-SPINK1 status in prostate carcinoma. Mod Pathol. Author manuscript; available in PMC 2013 December 1.Published in final edited form as: Mod Pathol June; 26(6): Página 5 de 5

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