TEMA 15. PRODUCCIÓN DE VACUNAS

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1 TEMA 15. PRODUCCIÓN DE VACUNAS 1. INTRODUCCIÓN Las vacunas son suspensiones de microorganismos, o alguna parte o producto de ellos, que producirán inmunidad al ser inoculadas en un huésped. Una vacuna oral o parenteral induce en el huésped la formación de anticuerpos frente al organismo causante de la enfermedad, por lo que durante futuras exposiciones al microorganismo, el agente infeccioso es inactivado (neutralizado o matado), se previene su proliferación y por lo tanto no se establece el estado de enfermedad. La persona se contamina pero se impide la infección y por tanto, la enfermedad. Una vacuna es una mezcla de: Antígenos (principio activo): microorganismos causantes de la enfermedad, muertos o debilitados. Conservadores: sustancias que evitan la descomposición y contaminación. Estabilizantes: sustancias que mantienen las características iniciales de la vacuna, crean un ambiente en el que no se produzcan cambios en la estructura de los antígenos. Adyuvantes: sustancias que potencializan el efecto inicial de la vacuna, al liberarse los antígenos lentamente. El inicio de las vacunas modernas se produce gracias a Louis Pasteur, al que encargaron una vacuna contra el ántrax del ganado vacuno, contra el cólera de las gallinas y la vacuna antirrábica (primera vacuna contra un virus humano), Pasteur diseñó un modelo que sigue siendo válido con ciertos cambios, para la atenuación de un virus. La vacuna antirrábica partió de la base de que los microorganismos eran patógenos porque estaban adaptados a la fisiología humana, Pasteur pensó que si cambiaba su temperatura óptima al cultivarlo en otros animales cambiaría el potencial de su actividad. Pasteur lo probó en muchos animales y lo consiguió en la médula espinal del conejo, fue realizando cultivos seriados, al final de 8 o 10 comprobó que ese virus se había adaptado y cambiado, había perdido su capacidad de afectar al hombre, era un virus atenuado. La viruela es una enfermedad erradicada, su virus es complejo y solo habita en el hombre (hay otros parecidos de otros animales), esto hace que de forma natural no existan reservorios naturales, por eso pudo ser erradicada; en cambio, la rabia es un virus poco específico que afecta al hombre y a muchos reservorios naturales (perros, gatos, murciélagos, mapaches). A partir de 1920 es cuando comienza el gran auge de desarrollo de vacunas. La poliomielitis tuvo dos etapas, la primera con vacunas de virus muertos y la segunda con virus atenuados. El número de casos paso de a 800 en solo 10 años, se ha intentado erradicar pero al tener reservorios naturales está siendo muy difícil, en 1973 se detectaron solo 14 casos. La vacuna ideal posee unas características: 1) Reproducir (mimetizar) una respuesta inmunológica similar a la de la infección natural 2) Efectiva (más del 90% de protección) 3) Mínimos efectos secundarios y completamente segura 4) Inmunidad persistente a largo plazo 5) Dosis única y compatible con otras vacunas 6) Administración no invasiva (vía oral preferentemente) 7) Administración precoz en los primeros meses de vida 8) Estable a temperatura ambiente 9) Fácil producción y económicamente asequible 1

2 2. VACUNAS TRADICIONALES TIPOS DE VACUNAS TRADICIONALES VACUNAS ATENUADAS: Son preparaciones de bacterias o virus vivos que están tan debilitados o alterados que ya no son virulentos, siendo todavía capaces de provocar una respuesta inmune. Ej: Sabin contra la polio, fiebre amarilla, sarampión, rubéola, parotiditis, BCG (antituberculosa). MÉTODOS DE ATENUACIÓN: 1.Patógenos animales: Empleo de patógenos de animales que causan enfermedades parecidas en los humanos y proporcionan inmunidad frente al agente infeccioso que causa la variante humana. Ej: viruela, el único caso. 2.Atenuación por pases sucesivos de cultivos celulares: Cultivo sucesivo del microorganismo en células hasta la pérdida de la patogenicidad. Ej: polio, sarampión, rubéola, parotiditis y varicela. 3.Atenuación por pases sucesivos en medio de cultivo: Cultivo sucesivo del microorganismo en medios de cultivo hasta la pérdida de la patogenicidad. Ej: tuberculosis (para bacterias), es el único caso. Estos son los casos antiguos, ahora con los nuevos medios: 4. Atenuación por reasortado o recombinación: Coinfección de dos virus con genomas diferentes en cultivos celulares, hasta formar un virus recombinado, este se compone de la mayoría de los genes de un virus animal no patógeno para el hombre, y genes que contienen la información del antígeno inmunizante. Al ser tan sencillos los virus, se intercalan fragmentos de uno en otro, y se produce una recombinación natural. Este metodo se usa cada vez más. Ej: rotavirus 5. Atenuación por métodos químicos: Atenuación mediante agentes mutagénicos químicos (nitroso-guanidina), es un método de recombinación-selección, seleccionamos los mutantes que han perdido su capacidad de virulencia. Ej: fiebre tifoidea. 6. Atenuación por mutagénesis: Selección de mutantes en función de su capacidad de multiplicarse a temperaturas diferentes de la del cuerpo humano. Estos mutantes se replican com menor intensidad que las variantes salvajes, con lo que serán menos virulentos sin perder su inmunogenicidad (mutantes sensibles a la temperatura o TS). Ej: rotavirus, gripe. VACUNAS INACTIVADAS: Son suspensiones de bacterias o virus que han sido matados por la acción de calor, radiaciones o desinfectantes como el fenol o formaldehído. Ej: Salk contra la polio, rabia, gripe, tosferina... Estas vacunas necesitan dosis de recuerdo, ya que al no estar vivos no pueden actuar como antígenos permanentemente. -Vacunas de subunidades: Son suspensiones de fracciones subcelulares con capacidad antigénica procedentes de bacterias o virus. Suelen ser las proteínas o los polisacáridos. -Vacunas de toxoides: Son preparaciones obtenidas a partir de toxinas bacterianas inactivadas. Se suele usar el formol (38% de formaldehido en agua). Ej: difteria, tétanos.en realidad es un método de atenuación, obtenemos la toxina que provoca la enfermedad y mediante un tratamiento químico provocamos una alteración que la hace menos virulenta (anatoxina o toxoide), pierde su capacidad tóxica pero no su capacidad antigénica. 2

3 Hay que coger cultivos que no favorezcan la proliferación sino que favorezcan la producción de toxinas. Se usan cepas que sean estables en liófilos, de Clostridium tetani y de Corynebacterium diptheriae. Las toxinas bacterianas no se producen en grandes cantidades en medios sintéticos por lo que se utilizan medios complejos, con tres fuentes de carbono (glucosa, sacarosa-rápido crecimiento y maltosa-crecimiento lento), extracto de levadura (suplemento de aminoácidos y vitaminas) y una fuente de nitrógeno (carne digerida con papína o tripsina, caseína digerida con ácido o tripsina, harina de soja). Clostridium es anaerobio y sacarolítico estricto. El tiempo de incubación depende de la cantidad de toxina que se produce para lo cual existen diversas técnicas enzimáticas (lecitinasa, hemólisis, proteolisis) como ensayos en animales (cobayas, ratones, conejos) usando como indicadores la muerte o lesiones en la piel. La inactivación se realiza siempre con formaldehído. El aslamiento es distinto, el de Clostridium tetani es más simple, el toxoide se purifica por ultrafiltración utilizando membranas con un tamaño de poro de μm. La toxina de Corynebacterium diptheriae se purifica primero y después se convierte en toxoide: 1. Eliminación de la mayor parte de las proteínas por precipitación con sulfato amónico al 25% en presencia de carbón activo y en condiciones alcalinas. 2. Filtrar 3. La toxina presente en el filtrado se precipita por adición de sulfato amónico al 20% 4. Filtración 5. Redisolución 6. Eliminación del sulfato amónico por diálisis 7. Inactivación PRODUCCIÓN DE VACUNAS VIRALES Los virus son microorganismos acelulares con un solo tipo de ácido nucleico (DNA o RNA), un virus es un parásito intracelular estricto ya que no tiene maquinaria metabólica, solo puede multiplicarse dentro de las células de otros organismos. Se han descubierto virus muy grandes, los megavirus, que son iguales en tamaño que una bacteria y solo parasitan a un determinado tipo de amebas (protozoos unicelulares). El objetivo de estas vacunas es obtener una gran cantidad de material rico en antígenos virales. La complicación que presentan es que las células vivas son esenciales para la replicación de los virus, necesitamos como medio de cultivo células vivas; se infectan tejidos animales (complicado por su mantenimiento y porque podían llevar distintos virus que afectaran a los humanos), embriones de pollos (se usa el embrión y las membranas que le rodean en el huevo) o cultivos celulares de celulas humanas y animales. Es de vital importancia para la producción el mantener un lote de virus como inoculante, estos lotoes se suelen conservar liofilizados o congelados en nitrógeno líquido. CULTIVO DE VIRUS ANIMALES: Es esencial mantener el virus seleccionado inalterado, usando métodos de conservación, ya que va a ser la referencia. para estas vacunas. Un lote semilla consiste en que una vez aislado y modificado el virus se realiza un cultivo masivo en el medio de cultivo vivo, este primer lote se guarda normalmente en nitrógeno líquido -196º, repartida la muestra en suspensiones del microorganismo en alícuotas, cuantas más mejor. Esto nos sirve como referencia en todos los test de identidad (starter), son el inicio para la producción industrial de los siguientes lotes. El uso de animales vivos está prácticamente abandonado en la actualidad, se usó para la obtención de vacunas contra la viruela, la rabia y la fiebre amarilla. 3

4 La técnica con huevos embrionados de pato o pollo empezó a usarse en 1931, los huevos tienen unos sistemas celulares diferenciados (membrana corioalantoica, cavidad alantoica, liquido amniótico, albumen...) que nos permiten el cultivo de un gran numero de microorganismos (los virus de la viruela y el herpes se cultivan en la membrana corialantoica, los virus de la gripe y las paperas en la cavidad amniótica). Además las condiciones de higiene son muy buenas y es un método muy barato. La manipulación es muy sencilla, se perfora el huevo con una aguja y se inocula el virus en el tipo de célula que interesa, se sella el agujero con parafina y se incuba 2-3 días a 36ºC hasta que se rompe el huevo y se centrifuga para separar los componentes. Este método no es tan sencillo, y actualmente lo más utilizado es el cultivo de tejidos, en riñón de mono y células diploides humanas. Igual que se hace un césped de bacterias, se puede hacer un césped de celulas diploides, donde se inocula el virus, hay distintas metodologías para realizar esto. Se observa el efecto citopático (rotura de las células) y luego se filtran los virus, se inactivan o no y se liofilizan. Este método es caro. Con estos métodos se producen vacunas contra la polomielitis, el sarampión, la rabia, la rubéola, la fiebre amarilla, las paperas y la gripe. 4

5 CONTROL DE CALIDAD El objetivo de esto es garantizar la seguridad y la eficacia de las vacunas (el proceso es el mismo para vacunas bacterianas). Los dos controles más importantes son los de seguridad (peligro potencial) y los de eficacia (ensayo). VACUNAS VÍRICAS INACTIVADAS Peligro potencial: incompleta inactivación de los virus (ver presencia de organismos viables, se hace una inoculación masiva y se ve si hay efecto citopático, si sucede esto es que hay un microorganismo virulento) Ensayo (detección de virus vivos): Inoculación en cultivos de tejidos (detección de efectos citopáticos), inoculación en animales susceptibles (síntomas de la enfermedad, evidencias histológicas de infección en la autopsia) VACUNAS VÍRICAS ATENUADAS Peligro potencial: reversión del virus a un grado de virulencia capaz de causar enfermedad con las vacunas (cada lote de producción se prueba en animales de experimentación susceptibles, en las bacterias se identifica directamente los genotipos responsables de la virulencia) Ensayos (pruebas de virulencia: en la producción de la vacuna atenuada de la poliomielitis se compara la neurovirulencia de cada lote con el de una vacuna control por inoculación intraespinal en monos VENTAJAS E INCOVENIENTES DE LAS VACUNAS CLASICAS VACUNAS VIVAS ATENUADAS VACUNAS INACTIVADAS VENTAJAS -Alta efectividad (las más eficaces) -Inmunidad intensa y duradera -Respuesta humoral y celular -No necesitan dosis de recuerdo ni adyuvantes -No requieren administración de gran cantidad de patógeno -Bajo coste de producción (las más baratas) -Estabilidad -Seguridad -Bajo coste de producción (no necesitan tantas medidas de seguridad) DESVENTAJAS -Posible reversión a la virulencia del patógeno -Variaciones genéticas en el caso de los virus -Baja estabilidad -Difícil producción -Inmunidad menos intensa y duradera -Escasa respuesta celular -Requieren dosis de recuerdorequieren adyuvantes -Altas dosis para conseguir efectividad -Efectos secundarios VACUNAS DE SUBUNIDADES -Menos efectos secundarios que las vacunas con microorganismos enteros -Bajo coste de producción -Toxoides: posible reversión a la toxicidad -Polisacáridos: sin respuesta humoral LIMITACIONES DE LAS VACUNAS TRADICIONALES 1. No todos los agentes infecciosos pueden crecer en cultivo 2. La producción de virus animales y humanos requiere cultivos celulares que son caros y de bajo rendimiento 5

6 3. Son necesarias grandes medidas de seguridad para asegurar que tanto el personal de laboratorio como de producción no van a estar expuestos al agente patógeno 4. Se corre el riesgo de que los lotes de vacunas no estén completamente inactivados por lo que se pueden introducir organismos virulentos en las vacunas y dispersar la enfermedad 5. Las cepas atenuadas pueden revertir, una posibilidad que requiere continuos ensayos para asegurar que no ha ocurrido una readquisición de la virulencia 6. No todas las enfermedades infecciosas se pueden prevenir a través del uso de vacunas tradicionales 7. La mayor parte de las vacunas actuales tienen una vida media limitada y a menudo requieren refrigeración para mantener su potencia, lo que ocasiona problemas de almacenamiento en aquellos países con grandes áreas rurales sin electrificar 3. NUEVAS VACUNAS VACUNAS ATENUADAS MEDIANTE MODIFICACIÓN GENÉTICA VENTAJAS -Respuesta humoral y celular -No requieren adyuvantes -No requieren administración de gran cantidad de patógeno DESVENTAJAS -Riesgo de seguridad -Variaciones genéticas en el caso de los virus VACUNAS SINTÉTICAS VACUNAS ANTI-IDIOTIPO VACUNAS DE PÉPTIDOS RECOMBINANTES VACUNAS COMESTIBLES INSERCIÓN O CLONAJE DE GENES DE INTERÉS EN VECTORES VIVOS VACUNAS DE DNA -Seguridad -Estabilidad térmica -No requieren adyuvantes -No requieren administración de patógeno -Potente respuesta humoral -Efectivas -No hay riesgos de seguridad -Seguridad -Fuerte inmunidad en mucosas -Fácil administración -Respuesta humoral y celular -Respuesta humoral y celular -Estabilidad relativa -No hay riesgos de seguridad -Vacunación neonatal posible -Múltiples antígenos en la misma vacuna -Antígenos de proteínas transmembrana -Fácil producción -Caracterización del antígeno -Sin respuesta celular -No tiene formas nativas -Sin respuesta celular -Respuesta menos duradera -No adquiere configuración nativa -Escasa respuesta celular -Requieren dosis de recuerdo -Baja estabilidad -Requieren adyuvantes -Requiere de altos niveles de expresión del antígeno en el tejido vegetal -Posible reversión a la virulencia del vector -Resistencia/anticuerpos preexistentes -Requieren dosis de recuerdo -Costes de producción muy elevados -Respuesta celular insuficiente -Posibles dosis de recuerdo -Baja eficacia en la transfección in vivo -Respuestas inmunutarias frente al DNA, inmunotolerancia y autoinmunidad -Expresión de antígenos inapropiadamente -Respuesta inmune mucosa pobre -Alto coste de producción 6

7 VACUNAS ATENUADAS MEDIANTE MODIFICACIÓN GENÉTICA Con el genoma secuenciado del patógeno, se aisla el fragmento de DNA que le da las características patógenas, se caracterizan las proteínas patogénicas y se provoca una deleción, obteniendo un mutante dirigido sin el fragmento del DNA responsable de la patogenicidad. Con Shigella flexneri se ha eliminado solo el centro activo del gen de la patogenicidad, el resto se mantiene. VACUNAS SINTETICAS Su exito no ha sido tanto como se pensaba, consiste en el desarrollo por síntesis química de péptidos que sean iguales al gen que produce la virulencia. VACUNAS ANTI-IDIOTIPO Se utilizan los propios anticuerpos como antígeno, se obtiene un anticuerpo frente al antígeno y se utiliza el anticuerpo para producir anticuerpos frente a él, el nuevo anticuerpo tendrá una estructura similar al antígeno y puede ser utilizado para producir la inmunidad artificial. VACUNAS DE PEPTIDOS RECOMBINANTE Se identifica la proteína de interés inmunológico, se aisla el fragmento de DNA que codifica la proteína y se inserta en un plásmido, se introduce el plásmido en un vector de expresión (como una bacteria) y se seleccionan los vectores de expresión que han incorporado el fragmente de DNA y expresan la proteína antigenica, se colocan las proteínas de los capsómeros, se ensamblan y producimos un pseudovirus (cápsulas vacías pero con la estructura idéntica al virón inicial). Un ejemplo de esta vacuna es la vacuna contra la hepatitis B, la hepatitis B es una enfermedad vírica producida por el VHB que origina insuficiencia hepática y cáncer y mata cada año a dos millones de personas. En 1976 el equipo de investigación del Dr. Hilleman de los laboratorios Merck demostró experimentalmente la viabilidad de una vacuna contra el VHB. La inyección del antígeno particulado purificado, procedente del plasma de personas infectadas, protegía a los animales de la infección por el VHB, la vacuna era eficaz pero no podía producirse en grandes cantidades dada la limitación de donantes. La solución vino de la mano de la clonación de genes del VHB y la expresión de las partículas del VHB en Saccharomyces cerevisiae, aunque la proteína de superficie no se glicosila, el autoensamblaje la convierte en VLPs (virus like particles) siendo eficaz para generar respuesta inmune artificial. 7

8 VACUNAS GENÉTICAS (DE DNA) Esta nueva estrategia provoca la aparición de anticuerpos sin la introducción de sus antígenos. Esta técnica, inmunización genética, consiste en introducir un gen que codifica para una proteína antigénica en las células de un animal donde se sintetizará el antígeno que provoca la respuesta inmune. VACUNAS COMESTIBLES Son plantas transgénicas a las que se les ha introducido, por medio de técnicas de ingeniería genética, la información necesaria para producir en su interior proteínas antigénicas. Estas plantas se pueden cutlviar para usar el tejido vegetal como vacunas comestibles en seres humanos o en animales. Gracias a esta vacuna se puede llegar a países subdesarrollados donde otras vacunas no pueden llegar; además, si existen reservorios no humanos, se eliminan con esta vacuna. Actualmente se usan plantas transgénicas como sistemas de producción para proteínas humanas recombinantes, las ventajas es que su coste es muy bajo, la calidad del producto es alta y la glicosilación tiene solo pequeñas diferencias con la humana, además el coste de almacenamiento es barato y la calidad del producto es alta. LA HEPATITIS B Existen 350 millones de portadores de la enfermedad en el mundo, esta enfermedad hepática puede terminar en cáncer de hígado y hay muertes por cirrosis y cáncer hepático. Es muy contagiosa, y se transmite por la sangre, fluidos corporales, contacto sexual, jeringuillas y transmisión vertical. Sus síntomas son dolor de cabeza, nauseas, vómitos, dolor abdominal, orina oscura, debilidad y fatiga. El VHB es un virus del grupo VII de Baltimore (ds DNA-RT), es decir, es un retrovirus con DNA de cadena doble y retrotranscriptasa (realiza la retrotranscripción después de sintetizar las proteínas-al contrario que el VIH que lo hace al entrar en la célula). Existe en el mercado una vacuna de subunidades segura y eficaz, de levaduras transgénicas, no es cara pero necesita refrigeración; en cambio para los países en desarrollo es imposible utilizarla por ambas razones; y la vacuna comestible sería una buena alternativa. ETAPAS EN EL DESARROLLO DE VACUNAS COMESTIBLES 1-Aislamiento y modificación del gen: identificar y aislar el gen de interés primero y luego integrarlo en una construcción génica. Para el gen de la hepatitis, la construcción génica tiene: -cassette de resistencia a kanamicina (promotor NPT II y gen de resistencia a kanamicina) -promotor patatina para su expresión en el tubérculo de patata (dirige la transcripción de HbsAg) -gen de interés HbsAg (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) -terminador NOS 3' (de la nopalina sintasa de Agrobacterium) 8

9 2-Transformación de la planta (en el caso de la hepatitis B es Agrobacterium), se sustituye el T DNA en el pti por nuestra construcción, se obtiene el vector de clonación y se transforma la planta. 3-Multiplicación y selección de las células transformadas (en medio con kanamicina) 4-Regeneración y obtención de las plantas transgénicas 5-Cultivo de plantas transgénicas para su uso como vacuna comestible. Para vacunar de forma oral ratones con esta patata transgénica se usó la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) como adyuvante mucosal. Las células M especializadas reconocen estructuras de partículas, como bacterias o virus, y las transportan a las células B y T para iniciar una respuesta inmune, además tras la inmunización oral con HbsAg se generan células de memoria (respuesta secundaria). Para optimizar la expresión del gen introducido tenemos que elegir las secuencias reguladores más adecuadas para que estos genes se expresen correctamente, den lugar a la proteína y se mantenga estable: Secuencias reguladores de la expresión (secuencias promotoras, terminadoras, líder e intrones). Hay secuencias 3'alternativas, esto afecta a la producción del mrna HbsAg y a la estabilidad del mismo y producción de proteína; la línea HB114 produce la mayor cantidad de proteína Protección contra la degradación (direccionamiento al retículo endoplásmico, a las vacuolas, a los cloroplastos). Efecto de direccionamiento al RE: Se vió que las señales VPS añadidas al amino terminal de HbsAg direccionan al antígeno al ER, las línea HB106 y HB 107 producen más HbsAg por unidad de mrna; y una combinación de péptidos señal y KDEJ puede dar lugar a una mayor producción Péptido N-terminal de tránsito al cloroplasto: las plantas HB110 acumulan mrna pero no acumulan proteína HbsAg (integración en la membrana externa del plasto, no hay formación de puentes disulfuro ni plegamiento correcto, y se produce la degradación de la proteína; nos indica que el plegamiento correcto de HbsAg y la formación de puentes disulfurlo estables requieren la inserción en la membrana del ER) Promotores (constitutivos, inducibles, específicos de tejido o de órgano) Secuencias terminadores de la transcripción (influyen en expresión y la estabilidad del mrna, señales de poliadenilación del gen de la nopalina sintasa-nos de Agrobacterium) Otras secuencias: intrones (son secuencias de DNA que son transcritas a RNA pero que se eliminan en el proceso de maduración, aumentan la expresión del gen pero no se conoce su mecanismo de acción; se usan: intrón 1 de los genes de la actina de arroz, de ubiquitina de maiz, de sacarosa sintasa de maiz, y de alcohol-deshidrogenasa de maiz) secuencias líder en 5' no traducidas, que aumentan la expresión (la secuencia Ω dervida de la secuncia líder del virus del mosaico del tabaco) Para cuantificar la producción de HbsAg en patata se usa: -Northern blot (para cuantificar mrna) -ELISA (para cuantificar HbsAg) El éxito en humanos de la vacuna oral contra el VHB ha sido relativo por el protocolo de vacunación usado. 9