11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : G01N 33/ Inventor/es: Macri, James N. 74 Agente: Dávila Baz, Ángel

Transcripción

1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : G01N 33/76 G01N 33/68 G06F 19/00 // G06F 159:00 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Aparato para detectar el síndrome de Down por medio de un examen no invasivo de sangre materna. 30 Prioridad: US US US US US Titular/es: JN MACRI TECHNOLOGIES L.L.C. 403 Oakwood Road Huntington Station, New York 11746, US 45 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Macri, James N. 45 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Dávila Baz, Ángel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Aparato para detectar el síndrome de Down por medio de un examen no invasivo de sangre materna La presente invención se refiere a la detección del síndrome de Down fetal (trisomía 21) durante un examen prenatal y también se refiere a otras trisomías cromosómicas más raras pero detectables tales como la trisomía 13 y la trisomía 18. Más particularmente, la presente invención se refiere a una mejora de la eficacia de detección en el examen del síndrome de Down por medio de la medición de la cantidad de la subunidad beta libre de la gonadotropina coriónica humana (hcg) en la sangre de mujeres embarazadas. El síndrome de Down, también denominado trisomía 21, es la causa congénita más común de retraso mental grave. En general, el síndrome de Down fetal puede determinarse por un procedimiento de diagnóstico que incluye amniocentesis y determinación del cariotipo. Sin embargo, este procedimiento de diagnóstico es invasivo e implica riesgos para las mujeres y los fetos. La amniocentesis y la determinación del cariotipo no se realizan rutinariamente durante todos los embarazos. En su lugar, pueden utilizarse uno o más métodos de selección para determinar cuándo el riesgo del embarazo justifica el riesgo de someterse a un procedimiento de diagnóstico invasivo. La incidencia del síndrome de Down aumenta significativamente al aumentar la edad materna. Históricamente, el examen prenatal para detectar el síndrome de Down se ha centrado en mujeres embarazadas con una edad de 35 años o más, edades en las que el riesgo de síndrome de Down se aproxima o excede el riesgo de los procedimientos de diagnóstico utilizados para detectar el síndrome de Down fetal. Por lo tanto, el método convencional de examen prenatal ha implicado la selección de mujeres para amniocentesis de diagnóstico basada en la edad materna. Sin embargo, la edad es un criterio de selección inadecuado, ya que por medio de la realización de amniocentesis y del cariotipo en el 5% de las mujeres embarazadas con un índice máximo de riesgo, es decir, las que tienen 35 años o más, sólo puede detectarse aproximadamente un 20% de todos los embarazos con síndrome de Down. Además, como en la práctica clínica real sólo aproximadamente la mitad de las mujeres con 35 años o más se somete a amniocentesis y a la determinación del cariotipo, se detectan antes del nacimiento menos del 10% de los embarazos con síndrome de Down. En 1984 se descubrió una asociación entre la reducción de los niveles de alfa fetoproteína (AFP) en sangre materna y el síndrome de Down fetal. Por ejemplo, véase An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities ; Merkatz, Macri, et al.; Am. J. Obstet. Gynecol. 148:886, 1984; cuya descripción se incorpora en el presente documento como referencia. En esta publicación se indicó que otras trisomías cromosómicas, en particular la trisomía 13 y la trisomía 18, también estaban asociadas con la reducción de los niveles de AFP en la sangre materna. La incidencia de estas trisomías cromosómicas adicionales (1 de 5000 embarazos y 1 de 6600 embarazos, respectivamente) es significativamente menor que el riesgo a priori general asociado con la trisomía 21 (síndrome de Down). Sin embargo, debido a la asociación de estas otras trisomías cromosómicas con la reducción de los niveles de MSAFP, también se detectarán tales anormalidades dentro de un protocolo de selección que utiliza la AFP en sangre materna y la subunidad beta libre de la hcg y posiblemente marcadores adicionales descritos en este documento. Será evidente para los especialistas en la técnica que por medio del uso del protocolo descrito en este documento para la trisomía 21, también puede conseguirse la detección de la trisomía 13 y 18. La asociación entre la reducción de los niveles de AFP en sangre materna y el síndrome de Down fetal presentó la oportunidad de usar un ensayo de selección en sangre no invasivo en la detección de casos de síndrome de Down en familias jóvenes y aparentemente no afectadas en las que se produce aproximadamente un 80% de los casos de síndrome de Down. Se estima que el uso de un ensayo de selección basado en un bajo nivel de AFP en sangre materna (como marcador de selección) conduciría a la detección prenatal de aproximadamente un 20% de todos los casos de síndrome de Down fetal. Otro método de selección implica medir el nivel de estriol no conjugado (UE) en sangre materna. Por ejemplo, véase Maternal blood screening for Down syndrome in early pregnancy ; Wald, et al. British Journal of Obstetrics and Gynecology (BMJ), volumen 95, Abril de 1988, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. Sin embargo, la medición de UE proporciona una base deficiente para la selección. Más recientemente, se descubrió una asociación entre los niveles elevados de hcg en sangre materna, el nivel elevado de la subunidad alfa de la hcg en sangre materna (la hcg se compone de dos subunidades, denominadas en lo sucesivo alfa-hcg y beta-hcg, respectivamente) y el síndrome de Down fetal. Por ejemplo, véase Abnormal Maternal Serum Chorionic Gonadotropin Levels in Pregnancies with Fetal Chromosome Abnormalities ; Bogart, Pandian and Jones; Prenatal Diagnosis, Vol. 7, (1987) cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. En el artículo de Bogart se estima que el uso de niveles elevados de hcg en sangre materna y de niveles elevados de la subunidad alfa de hcg en sangre materna, detectaría aproximadamente un 68% de los fetos cromosómicamente anormales. Sin embargo, estos resultados se obtuvieron a partir de un estudio sobre embarazos a las semanas de gestación y los casos afectados parecían ser de mujeres previamente identificadas como mujeres con riesgo de un embarazo con síndrome de Down. Generalmente, como se ha sugerido anteriormente, la selección por medio de la evaluación de la hcg en sangre materna ha implicado sólo la medición de la hcg en general y además la medición de la alfa-hcg. Aunque estos métodos de selección detectan el síndrome de Down fetal, existe la necesidad y el deseo de un método que detecte un mayor porcentaje de casos con síndrome de Down fetal. 2

3 El documento JP-A describe la preparación de anticuerpos específicos contra hcg y contra la subunidad β de la hcg La invención hace uso del descubrimiento de una asociación previamente desconocida entre los niveles elevados de beta-hcg libre en sangre materna y el síndrome de Down fetal, entre el nivel de beta-hcg libre en sangre materna y el nivel de AFP en sangre materna y el síndrome de Down, y entre la relación del nivel de beta-hcg libre en sangre materna con el nivel de la molécula de hcg intacta en sangre materna y el síndrome de Down fetal. La invención también demuestra que usando una técnica de análisis discriminatorio multivariante se mejora la eficacia de detección de un método de selección usando el nivel de beta-hcg libre en sangre materna, o el nivel de beta-hcg libre en sangre materna y el nivel de AFP en sangre materna, o el logaritmo de cualquiera de los dos, o el logaritmo de ambos, especialmente cuando también se incorpora la edad gestacional como variable en la técnica de análisis discriminatorio, para un nivel de límite de riesgo elegido. La edad gestacional se refiere a la edad del feto de la mujer embarazada. La eficacia de detección se refiere al porcentaje de casos de síndrome de Down fetal que se detectan correctamente para un nivel de limite de riesgo elegido. El nivel de límite de riesgo se explicará con más detalle en la siguiente sección. El análisis discriminatorio es una estrategia conocida generalmente de análisis multivariante que implica la separación de una población en dos o más grupos por una evaluación del riesgo univariante. El análisis discriminatorio algunas veces también se describe como una forma para construir una combinación lineal de variables independientes, que reduce de esta manera el problema de medir diferencias de grupos en un problema univariante. El análisis discriminatorio también puede realizarse cuando sólo hay una variable implicada en un problema. Puede encontrarse un descripción general del análisis discriminatorio en Marketing Research; Churchill, G.A.; Dryden, 1976; Capítulo 15, páginas , cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. He descubierto que al someter los niveles de beta-hcg libre en sangre materna, los niveles de hcg intacta en sangre materna, la relación del nivel de beta-hcg libre en sangre materna con el nivel de la molécula intacta de hcg en sangre materna, el nivel de AFP en sangre materna, el nivel de UE en sangre materna y la edad gestacional a un análisis discriminatorio multivariante, se detecta un mayor porcentaje de casos de síndrome de Down fetal que con cualquier otro método de selección conocido para la detección prenatal del síndrome de Down, con una menor proporción de falsos positivos. Además, he descubierto que puede detectarse un número aún mayor de casos de síndrome de Down fetal usando sólo las mediciones de los niveles de beta-hcg libre en sangre materna y los niveles de AFP en sangre materna y sometiendo el log de cada medición y la edad gestacional a un análisis discriminatorio multivariante. Estos y otros descubrimientos se explicarán con más detalle en la sección del sumario de la invención y en la sección de descripción detallada de la invención. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un aparato para investigar el síndrome de Down fetal que detecte un mayor porcentaje de casos de síndrome de Down fetal con una proporción dada de falsos positivos en comparación con otros métodos de selección prenatal conocidos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un aparato para la selección del síndrome de Down fetal que tenga una menor proporción de falsos positivos para un porcentaje de detección dado que otros métodos conocidos. Otro objeto de la presente invención es aplicar aparatos de análisis discriminatorio multivariante para investigar el síndrome de Down para detectar un mayor porcentaje de casos de síndrome de Down fetal con una menor proporción de falsos positivos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un aparato para investigar el síndrome de Down fetal midiendo el nivel de beta-hcg libre en sangre materna. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un aparato para investigar el síndrome de Down fetal midiendo el nivel de AFP en sangre materna y el nivel de beta-hcg libre en sangre materna. Otros objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes en la siguiente descripción de la invención. Para conseguir estos y otros objetos, de acuerdo con la presente invención se miden los niveles de beta-hcg libre en el suero materno de una mujer embarazada (en los sucesivo la paciente) por métodos inmunológicos convencionales que pueden incluir técnicas de inmunoensayo tales como las mencionadas en los documentos anteriores, y otras técnicas conocidas en la técnica. El nivel de beta-hcg libre después se compara con una serie de datos de referencia para determinar el riesgo de la paciente de llevar un feto con síndrome de Down. Para mejorar la eficacia de detección, el nivel de beta-hcg libre y la edad gestacional pueden compararse con una serie de datos de referencia. Para mejorar adicionalmente la eficacia de detección, se miden los niveles de beta-hcg libre y de AFP (denominados marcadores ) en sangre materna de la paciente por métodos inmunológicos convencionales, que incluyen técnicas de ensayo conocidas en la técnica tales como las mencionadas en los documentos anteriores. Los niveles de cada marcador después se comparan con una serie de datos de referencia para determinar el riesgo de la paciente de llevar un feto con síndrome de Down. Se usa una técnica de análisis discriminatoria multivariante para comparar los niveles de los marcadores con respecto a una serie de datos de referencia. Más particularmente, después se calcula el riesgo específico de una paciente usando la regla de Bayes, el riesgo a priori de la paciente, y las frecuencias relativas de embarazos afectados y no afectados que se determinan por la incorporación del logaritmo de los niveles cuantitativos en la paciente de cada marcador en las funciones de densidad de probabilidad para los datos de referencia desarrollados usando un análisis discriminatorio multivariante. Si el riesgo de la paciente de llevar un feto con síndrome de Down es mayor que un nivel de límite de riesgo dado, debe aconsejarse a la paciente que se someta a ensayos de diagnóstico adicionales para confirmar la presencia de síndrome de Down. La incorporación de la edad gestacional como marcador junto con el nivel 3

4 de beta-hcg libre y el nivel de AFP en sangre materna mejorará adicionalmente la eficacia de la detección. Como el nivel de beta-hcg libre en sangre materna y el nivel de AFP en sangre materna en varias muestras tiende a distribuirse de acuerdo con una curva de distribución logarítmica gausiana, la mayor eficacia de detección puede conseguirse incorporando el logaritmo de los niveles cuantitativos de la paciente de cada marcador y la edad gestacional en las funciones de densidad de probabilidad para los datos de referencia desarrollados usando un análisis discriminatorio multivariante. Una ventaja del aparato de la presente invención es que predice correctamente un mayor porcentaje de casos con síndrome de Down fetal, con una menor proporción de falsos positivos que otros métodos y procesos conocidos. Otras ventajas de la presente invención serán evidentes tras la siguiente descripción más detallada y los siguientes ejemplos. La fig. 1 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra el nivel de significado de marcadores individuales para la trisomía 21. La fig. 2 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la eficacia de selección de marcadores individuales en el síndrome de Down La fig. 3 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la eficacia de selección de marcadores compuestos en el síndrome de Down. La fig. 4 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la proporción de casos con síndrome de Down por encima de los percentiles dados de distribución de la subunidad beta libre de la hcg en embarazos no afectados. La fig. 5 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la eficacia de marcadores individuales en el síndrome de Down La fig. 6 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la eficacia de selección del log de AFP y el log de la subunidad beta de hcg en el síndrome de Down como un marcador compuesto a diferentes intervalos de edades gestacionales. La fig. 7 es un tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, que muestra la eficacia de selección proyectada en el síndrome de Down de la AFP, la beta-hcg libre y la edad materna a lo largo de los Estados Unidos. La fig. 8, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, muestra los niveles de subunidad beta libre de hcg en casos de trisomía 21 en relación con diversos percentiles de los embarazos no afectados La fig. 9, a la que se hace referencia en el ejemplo 2, muestra las distribuciones de los niveles de la subunidad beta libre de hcg. La fig. 10 es una tabla, a la que se hace referencia en el ejemplo 3, que muestra la eficacia de selección en el síndrome de Down para una diversidad de combinaciones de marcadores. La fig. 11 muestra el aparato de la presente invención utilizado para realizar el método para detectar el síndrome de Down. Las figs. 12 y 13 muestran un diagrama de proceso de un programa de ordenador para calcular los parámetros de referencia para uso junto con la determinación del riesgo específico de una paciente de llevar un feto afectado. La fig. 14 muestra un diagrama de proceso para un programa de ordenador que utiliza los parámetros de referencia calculados en el programa mostrado en las figs. 12 y 13 para determinar el riesgo específico de la paciente de llevar un feto afectado. En una realización de la presente invención, se toma una muestra de sangre materna de una paciente. Después se mide el nivel de beta-hcg libre en la sangre materna por métodos analíticos convencionales, tales como métodos inmunológicos conocidos en la técnica. El nivel de beta-hcg libre en la sangre materna después se compara con una serie de datos de referencia para determinar si la paciente tiene un mayor riesgo de llevar un feto con síndrome de Down. Para aumentar la eficacia de detección, la edad gestacional y el nivel de beta-hcg libre en la sangre materna pueden compararse con una serie de datos de referencia para determinar si la paciente tiene un mayor riesgo de llevar un feto con síndrome de Down. Aunque cualquiera de los métodos analíticos conocidos para medir el nivel de beta-hcg libre en sangre materna funcionará en la presente invención, como será evidente para un especialista en la técnica, el método analítico usado para la beta-hcg libre debe ser el mismo método usado para generar los datos de referencia para la beta-hcg libre. Si se usa un nuevo método analítico para la beta-hcg libre, debe generarse una nueva serie de datos de referencia basándose en los datos creados con el método. 4

5 También se entenderá generalmente que para generar anticuerpos monoclonales específicos para la cadena beta de hcg, algunos anticuerpos serán específicos para la proteína y otros serán específicos para los sitios antigénicos asociados con carbohidratos. La medición del nivel de beta-hcg libre mencionado a lo largo de la descripción de la invención incluye el uso de anticuerpos específicos para la proteína o los sitios antigénicos asociados con carbohidratos o cualquier otro sitio de la beta-hcg libre. Además, los especialistas habituales en la técnica entenderán que aunque la subunidad alfa libre de la hcg está codificada por un solo gen, la subunidad beta libre está codificada por una familia compleja de al menos siete genes o seudogenes muy similares. Por ejemplo, véase Human chorionic gonadotropin beta-subunit is encoded by at least eight genes arranged in tandem and inverted pairs, Boorstein, Vamvakopoules, & Fiddes; Nature Vol 300, 2 de diciembre de 1982; cuyas enseñanzas se incorporan en este documento como referencia. Se sabe que sólo tres de los siete genes de la beta hcg libre se expresan en la producción placentaria normal de la beta hcg libre. Por ejemplo, véase Fragmentation of the Beta-Subunit of Human Chorionic Gonadotropin Produced by Choriocarcinoma ; Nishimura, Ide, Utsunomiya, Kitajima, Yuki y Mochizuki; Endocrinology, Vol. 123, Nº. 1, 1988; cuyas enseñanzas se incorporan en este documento como referencia. No se ha determinado si estos mismos tres genes se expresan en estados de enfermedad tales como durante la presencia del síndrome de Down fetal. Por lo tanto, es posible que se sinteticen múltiples formas de la beta hcg libre con pequeñas diferencias en las secuencias de aminoácidos, u otras diferencias pequeñas. También es posible que en el síndrome de Down se expresen uno o más de los genes de la beta hcg libre, produciendo de esta forma una sola variante o variantes de beta hcg libre. De acuerdo con la presente invención, estas variantes, si existen, se miden por técnicas inmunológicas convencionales para medir la beta hcg libre. Un ensayo producido para medir la variante específica o las variantes de la beta hcg libre asociadas con el síndrome de Down, si es el caso, puede mejorar aún más la eficacia de detección. Hemos usado eficazmente técnicas de ensayo de anticuerpos monoclonales para medir la subunidad beta libre de la hcg para distinguir entre los embarazos afectados y no afectados por la trisomía 21. Se ha conseguido una eficacia de detección de la trisomía 21 tan alta como de un 83%. Como es bien conocido para los especialistas en la técnica, el uso de anticuerpos para cuantificar analitos específicos puede producir grados de reactividad cruzada con una substancia distinta aunque similar. Por lo tanto, la distinción entre los casos afectados y no afectados puede deberse a la presencia de una forma distinta de la subunidad beta libre de la hcg que, debido a algún grado de reactividad cruzada con los anticuerpos que se están usando, se está detectando. Si se identifica tal forma aberrante de la subunidad beta libre de la hcg, puede designarse como una nueva substancia bioquímica. De hecho, la información de la bibliografía científica indica que se han reconocido formas aberrantes de la beta hcg (por ejemplo, véase Nishimura et al. infra.) Los casos afectados por la trisomía 21 también pueden caracterizarse por una forma aberrante de la subunidad beta libre de la hcg. Si la trisomía 21 se caracteriza por la producción de una forma aberrante de la subunidad beta libre de la hcg, los especialistas en la técnica podrán crear anticuerpos específicos contra tales formas aberrantes que pueden mejorar adicionalmente la eficacia de detección de este síndrome. Los datos de referencia reflejan el nivel de beta-hcg libre en sangre materna para mujeres embarazadas que llevan fetos con síndrome de Down (también denominadas afectadas ) y/o el nivel de beta-hcg libre en sangre materna para mujeres embarazadas que llevan fetos normales (también denominadas no afectadas ). Como se entenderá generalmente por los especialistas en la técnica, los métodos para investigar el síndrome de Down fetal son procesos de toma de decisiones por comparación. Para cualquier proceso de toma de decisiones, se necesitan valores de referencia basados en pacientes que tienen la enfermedad o afección de interés y/o pacientes que no tienen la enfermedad o afección de interés. En la presente invención, los valores de referencia son el nivel del marcador o marcadores medidos en sangre materna, por ejemplo, la beta-hcg libre, tanto en mujeres embarazadas que llevan fetos con síndrome de Down como en mujeres embarazadas que llevan fetos normales. Se establece una serie de datos de referencia recogiendo los valores de referencia para varias muestras. Como será evidente para los especialistas en la técnica, la serie de datos de referencia mejorará al incluir números crecientes de valores de referencia. Para determinar si la paciente tiene un mayor riesgo de llevar un feto con síndrome de Down, debe establecerse un límite. Es evidente para los especialistas en la técnica que un límite establecido para determinar si una paciente tiene un mayor riesgo de llevar un feto con trisomía 13 o trisomía 18 también puede ser eficaz para identificar casos de trisomía 21. Este límite puede establecerse por el laboratorio, por el médico o en una base de caso por caso por cada paciente. El nivel límite puede basarse en varios criterios incluyendo el número de mujeres que se someterían a ensayos de diagnóstico invasivos adicionales, el riesgo medio de llevar un feto con síndrome de Down de todas las mujeres que se someten a ensayos de diagnóstico invasivos adicionales, una decisión de que cualquier mujer cuyo riesgo específico de la paciente sea mayor que un cierto nivel de riesgo tal como 1 de 400 debe someterse a ensayos de diagnóstico invasivos adicionales u otros criterios conocidos por los especialistas en la técnica. El nivel límite puede establecerse usando varios métodos que incluyen: percentiles, media más o menos desviación típica (desviaciones típicas); múltiplos del valor medio; riesgo específico de la paciente u otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica. En otra realización de la presente invención, que tiene como resultado la detección de un mayor número de casos de síndrome de Down fetal, se toma una muestra de sangre materna de una paciente. Después se miden los niveles de la molécula de hcg intacta, beta-hcg libre, UE y AFP (denominadas en lo sucesivo marcadores ) en la sangre materna por métodos analíticos convencionales, tales como métodos inmunológicos conocidos en la técnica. Aunque en la presente invención funcionará cualquiera de los métodos analíticos conocidos para medir los niveles en sangre 5

6 materna de estos marcadores, como será evidente para un especialista en la técnica, el método analítico usado para cada marcador debe ser el mismo método usado para generar los datos de referencia para el marcador particular. Si se usa un nuevo método analítico para un marcador particular, debe generarse una nueva serie de datos de referencia basada en los datos creados con el método. Después se calcula un riesgo específico de la paciente de llevar un feto con síndrome de Down usando la regla de Bayes, el riesgo a priori de la paciente y las frecuencias relativas de embarazos afectados y no afectados que se determinan por la incorporación de niveles cuantitativos de cada marcador (la molécula de hcg intacta, beta-hcg libre, UE y AFP) de la paciente y la relación entre la beta-hcg libre y el nivel de la molécula de hcg intacta, junto con la edad gestacional de la paciente, en las funciones de densidad de probabilidad desarrolladas para los datos de referencia usando un análisis discriminatorio multivariante. El análisis discriminatorio multivariante puede realizarse con el paquete estadístico de programas informáticos disponible en el mercado Statistical Analysis System (fabricado y vendido por SAS Institute Inc.) o por otros métodos de análisis estadísticos multivariantes u otros paquetes de software estadísticos conocidos para los especialistas en la técnica. La función de densidad de probabilidad proporciona un método para comparar el nivel de cada marcador de la paciente con una serie de datos de referencia. A continuación se proporciona un tipo de función de densidad de probabilidad, aunque como será evidente para un especialista en la técnica, otras funciones de densidad de probabilidad se comportarán de forma similar y por lo tanto serán adecuadas en la presente invención. Fórmula para calcular el riesgo de síndrome de Down El subíndice a se refiere a los casos afectados El subíndice u se refiere a los casos no afectados (X-M) es un vector donde cada elemento es el nivel de cada variable menos la media de la variable. cov 1 es la inversa de la matriz de covarianzas reunidas de los casos afectados y no afectados de todas las variables en el modelo X-M) es la transposición del vector (X-M). EXP se refiere a la función exponencial. COV se refiere al determinante de la matriz de covarianza de todas las variables en el modelo para los datos de referencia. Como será evidente para los especialistas en la técnica, la matriz de covarianzas reunidas puede substituirse por las matrices de covarianzas individuales para embarazos afectados y no afectados. Entonces la fórmula para calcular el riesgo de síndrome de Down pasaría a ser la siguiente: COV se refiere al determinante de la matriz de covarianzas de todas las variables en el modelo para los datos de referencia. Para los fines del análisis discriminatorio, se realiza una suposición en cuanto a la probabilidad previa de síndrome de Down en la población no seleccionada general. En general, la probabilidad previa es de aproximadamente 1 de 800. Para el análisis discriminatorio multivariante se toma una decisión en cuanto al nivel de límite de riesgo que constituyen un resultado de ensayo positivo. Por ejemplo, si es deseable realizar ensayos de diagnóstico adicionales en una mujer embarazada que tiene una posibilidad de 1 de 400 o mayor de llevar un feto con síndrome de Down, entonces cuando los resultados del análisis discriminatorio indican que una mujer embarazada tiene una posibilidad de 1 de 400 o mayor de llevar un feto con síndrome de Down, la mujer embarazada se considera con un resultado de 6

7 ensayo positivo. Si se indica un resultado de ensayo positivo, se debe aconsejar a la paciente que se someta a ensayos de diagnóstico adicionales para confirmar la presencia de síndrome de Down Haciendo referencia a las figs , se muestra el aparato y un diagrama de proceso para un programa de ordenador para calcular los parámetros de referencia y el riesgo específico. Como se muestra en la fig. 11, la edad gestacional GA, el nivel de AFP y el nivel de beta hcg libre se determinan por técnicas convencionales a partir de embarazos afectados y no afectados para desarrollar datos de referencia. Se elige un gran número de muestras para aumentar la fiabilidad. Las mediciones para el desarrollo de los parámetros de referencia se indican esquemáticamente en 10. Una vez calculados los parámetros de referencia 22 por la unidad de procesamiento 20 después de la entrada a través de un dispositivo de entrada 15 adecuado, el riesgo 25 específico para una paciente particular puede calcularse basándose en los valores de los marcadores medidos específicos del individuo, indicados en 30. El programa para determinar los parámetros de referencia se muestran en las figs. 12 y 13 y el programa para calcular el riesgo específico se muestra en la fig. 14. Haciendo referencia ahora a las figs. 12 y 13, en un primer ciclo 100, el programa lee en los datos de identificación ID la edad gestacional GA, las cantidades de AFP y beta hcg libre y un código que indica si el embarazo está afectado o no afectado por la trisomía 21 a partir de un grupo de referencia para desarrollar datos de referencia. Esto se muestra en la etapa 102. En el diagrama del proceso, la edad gestacional GA se denota por la variable X 1, el log de AFP se proporciona por la variable X 2 y el log de la subunidad beta libre se proporciona por X 3, como se muestra en la etapa 104. Después se determinan o se calculan las matrices de suma y de productos de suma o se calculan como se muestra en la etapa 106 basándose en las cantidades X 1, X 2 y X 3. Después, se incrementa la variable N CODE que representa el número de casos afectados y no afectados en el grupo de referencia. Una vez terminado el ciclo, como se muestra por la línea de flujo 110, se calculan las medias a través de una serie de ciclos definidos por las cantidades I, J y K como se indica por el número de referencia 112. En estos ciclos, la matriz de covarianza se calcula utilizando la matriz de suma definida en el ciclo 100 y la matriz de producto de suma calculada en el ciclo 100. Después de estos ciclos, se elige si se reúnen o no se reúnen las matrices de covarianza para los casos afectados y no afectados. Esta elección se introduce en las etapas 114, 116 y 118. Si se elige la reunión, las covarianzas se reúnen para formar una matriz de covarianza reunida como se proporciona en la etapa 120, la matriz de covarianza reunida se invierte dando como resultado la matriz de covarianza reunida invertida IPCM como se muestra en 122, y las medias y la matriz de covarianza reunida invertida se graban en un archivo y se imprimen en las etapas 124 y 126. Si se elige no reunir las matrices de covarianza, entonces cada una de las dos matrices de covarianza se invierte en las etapas 123 y 125 y las medias y las matrices de covarianza invertidas se graban en un fichero y se imprimen en las etapas 125 y 127. Estas cantidades comprenden los parámetros de referencia para el cálculo del riesgo de un individuo específico de llevar un feto afectado. Haciendo referencia a la fig. 14, los parámetros de referencia determinados durante la ejecución del programa mostrado en las figs. 12 y 13, los parámetros de referencia que comprenden las medias y la matriz de covarianza reunida invertida, se leen como se muestra en 130. Después se leen el registro de la paciente específica, incluyendo la identificación de la paciente, la edad gestacional GA, la AFP y la hcg beta libre como se muestra en 132. Después se calcula la edad gestacional más específicamente en 134 y se realiza un cálculo de la edad materna en 136. En 138 se determina el riesgo previo basándose en la edad materna y en los datos de incidencia. En los ejemplos discutidos más adelante, el resultado de este cálculo es el factor 1/800, un número típico. En 140 se determina la frecuencia relativa de llevar un feto afectado (ABT) en tiempos de riesgo previo, que es el numerador de las ecuaciones (1) o (2) descritas anteriormente. En 142 se determina la frecuencia relativa de llevar un feto no afectado multiplicado por (1-riesgo previo) (NT), que es el segundo factor en el denominador de las ecuaciones (1) o (2) presentadas anteriormente. En 144 se determina el riesgo específico usando la regla de Bayes, es decir ABN = ABT/(ABT+NT). (Ecuaciones (1) y (2)). En 146, se imprimen los resultados, es decir, el riesgo específico de la paciente ABN y el número de identificación de la paciente. Como será evidente para una persona especialista en la técnica, también pueden usarse otras técnicas estadísticas y matemáticas para calcular los parámetros de referencia, distintas de un procedimiento de análisis discriminatorio lineal. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se toma una muestra de sangre materna de una paciente. Después se miden los niveles de beta-hcg libre y AFP (denominados en lo sucesivo marcadores ) en sangre materna por métodos analíticos convencionales, incluyendo métodos inmunológicos conocidos en la técnica. Aunque en la presente invención funcionará cualquiera de los métodos analíticos conocidos para medir los niveles de estos marcadores en sangre materna, como será evidente para un especialista en la técnica, el método analítico usado para cada marcador debe ser el mismo método usado para generar los datos de referencia para el marcador particular. Si se usa un nuevo método analítico para un marcador particular, debe generarse una nueva serie de datos de referencia, basados en los datos creados con el método. Después se calcula el riesgo específico de la paciente de llevar un feto con síndrome de Down usando la regla 7

8 de Bayes, el riesgo de la paciente a priori y las frecuencias relativas de embarazos no afectados y afectados que se determinan incorporando los niveles cuantitativos de cada marcador en la paciente junto con la edad gestacional de la paciente, en las funciones de densidad de probabilidad creadas para los datos de referencia usando un análisis discriminatorio multivariante. Para aumentar adicionalmente la eficacia de detección, el logaritmo de los niveles cuantitativos de la paciente de beta-hcg libre y AFP, junto con la edad gestacional de la paciente, se incorporan en las funciones de densidad de probabilidad desarrolladas para los datos de referencia usando un análisis discriminatorio multivariante. El análisis discriminatorio multivariante puede realizarse en un paquete estadístico de programas informáticos disponible en el mercado Statistical Analysis System (fabricado y vendido por SAS Institute Inc.) o por otros métodos de análisis estadístico multivariante u otros paquetes de software estadísticos conocidos para los especialistas en la técnica. Para el análisis discriminatorio se realiza una suposición en cuanto a la probabilidad previa de síndrome de Down en la población general no seleccionada. En general, la probabilidad previa es de aproximadamente 1 de 800. Para el análisis discriminatorio multivariante se toma una decisión en cuanto al nivel de límite de riesgo que constituye un resultado de ensayo positivo. Por ejemplo, si es deseable realizar ensayos de diagnóstico adicionales en una mujer embarazada que tiene una posibilidad de 1 de 400 o mayor de llevar un feto con síndrome de Down, entonces cuando los resultados del análisis discriminatorio indican que una mujer embarazada tiene una posibilidad de 1 de 400 o mayor de llevar un feto con síndrome de Down, se considera que la mujer embarazada tiene un resultado de ensayo positivo. Si se indica un resultado de ensayo positivo, se debe aconsejar a la paciente que se someta a ensayos de diagnóstico adicionales para confirmar la presencia de síndrome de Down. Como será evidente para un especialista en la técnica, en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, el cambio del nivel del límite de riesgo de un resultado positivo o el uso de diferentes riesgos a priori que pueden aplicarse a diferentes subgrupos de la población, podría cambiar los resultados del análisis discriminatorio para cada paciente. La presente invención no se limita a las realizaciones descritas anteriormente, sino que más bien incluye todas las realizaciones posibles y combinaciones de marcadores descritos en los siguientes ejemplos Ejemplo 1 Se utilizaron más de 400 muestras de pacientes para estudiar la relación entre el síndrome de Down fetal y los niveles de beta-hcg libre en la sangre materna junto con el nivel de AFP en suero materno (MSAFP), UE y hcg intacta. Estas muestras incluían 25 muestras de sangre materna de mujeres embarazadas que se sabía que llevaban fetos con síndrome de Down y muestras de control equivalentes a los casos afectados. Para cada muestra de sangre se determinaron los niveles cuantitativos de AFP, la molécula de hcg intacta, betahcg libre y UE (en lo sucesivo, cada una se denomina marcador ) por las siguientes técnicas de ensayo: Marcador MSAFP UE hcg intacta beta-hcg libre Técnica de Ensayo Ensayo de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA) Radioinmunoensayo ELISA de tipo de perlas ELISA El nivel de cada marcador se transformó en una variable en el procedimiento discriminatorio por etapas y el procedimiento discriminatorio lineal en el paquete estadístico de software informático disponible en el mercado Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.) para generar una serie de datos de referencia. La relación entre la beta hcg libre y la molécula de hcg intacta y la edad gestacional de la paciente también se incorporaron como variables. El procedimiento discriminatorio por etapas determinó que todas las variables podían incorporarse en el procedimiento discriminatorio lineal. Después se realizó el procedimiento discriminatorio lineal en cada variable por separado y en diferentes combinaciones de variables. Los resultados de estos análisis discriminatorios se resumen en el siguiente esquema. La sensibilidad es el porcentaje de casos con síndrome de Down fetal que muestran un resultado de ensayo positivo. Los falsos positivos son el porcentaje de fetos normales que muestran un resultado de ensayo positivo

9 Variable Sensibilidad Falsos Positivos MSAFP 15,4% 4,2% UE 15,4% 2,8% hcg intacta 37% 8,6% MSAFP, UE, hcg intacta 50,0% 7,2% beta-hcg libre + hcg intacta 60,0% 8,5% relación w/o compuesta 76% 5,3% UE w/o compuesta 76% 5,3% Compuesto 80% 4,3% beta-hcg libre w/o compuesta 60,0% 5,3% * log hcg intacta + (log beta-hcg libre + hcg intacta) 68% 7,6% * log hcg, log MSAFP 88% + (log beta-hcg libre + hcg intacta) 7,4% Compuesto = MSFAP + beta-hcg libre + hcg intacta + UE + Relación de edad gestacional se incorpora junto con cada nivel límite de riesgo variable = 1 de 400 excepto (*) que es 1 de 365. Como es evidente para un especialista en la técnica, el cambio del nivel límite de un positivo o el uso de diferentes riesgos a priori que pueden aplicarse a diferentes subgrupos de la población cambiará los resultados del procedimiento discriminatorio para la paciente. Ejemplo 2 Se utilizaron más de 550 muestras de pacientes para estudiar la relación entre el síndrome de Down fetal y los niveles de beta-hcg libre en sangre materna. Inicialmente se analizaron 29 muestras de mujeres embarazadas que se sabía que llevaban fetos con síndrome de Down y 520 muestras no afectadas equivalentes en cuanto a la edad gestacional (la misma semana), la edad materna (con una variación de 3 años) y el tiempo de almacenamiento en el congelador (con una diferencia de un mes). Todas las muestras procedían de mujeres embarazadas no diabéticas y con un solo feto. Para evitar las desviaciones de formación en las estimaciones de la eficacia de selección, se usó el concepto de una serie de validación. Una serie de validación es una serie de datos independiente de la serie de datos de referencia. Los resultados de las pacientes de la serie de validación no se usan para establecer los datos de referencia. En su lugar, los resultados de las pacientes de la serie de validación se comparan con la serie de datos de referencia para determinar la eficacia de la selección. Esta segunda serie de validación constaba de 26 casos confirmados adicionales de trisomía 21 (55 casos en total) y un grupo seleccionado aleatoriamente de 159 muestras de control. Las muestras de control se extrajeron de forma similar a partir de mujeres embarazadas no diabéticas con un solo feto. El estudio total constaba de 4388 determinaciones en 7 ensayos diferentes de los niveles de los marcadores en sangre materna que se indican a continuación: 45 Marcador Ensayo MSAFP ELISA hcg intacta ELISA hcg intacta + beta-hcg libre ELISA beta-hcg libre RIA (radioinmunoensayo) alfa-hcg libre RIA UE 2 métodos, inmunoensayo enzimático y RIA ELISA = Ensayo inmunoabsorbente con enzima unido El nivel de cada marcador se transformó en una variable en el procedimiento discriminatorio por etapas y el procedimiento discriminatorio lineal en el paquete estadístico de software informático disponible en el mercado Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.) para generar una serie de datos de referencia. También se incorporó la edad gestacional como variable. Después se realizó el procedimiento discriminatorio lineal en cada variable por separado y en diferentes combinaciones de las variables. Las pacientes se clasificaron como afectadas o no afectadas basándose en un límite de riesgo de síndrome de Down de 1 de 365. Los casos no afectados que se clasificaron como afectados se consideraron falsos positivos. El riesgo de síndrome de Down de cada paciente se calculó usando la regla de Bayes, las funciones de densidad de probabilidad normal multivariantes para casos afectados y no afectados y un riesgo general a priori de 1 de 800. Para cada función de densidad de probabilidad se usó una matriz de covarianza reunida. 9

10 Los resultados encontrados en las tablas 1 a 3, mostradas en las figs. 1-3, se refieren a la serie de estudio inicial. Los resultados de las tablas 5-7, figs. 5-7 se basan en la clasificación de pacientes en la serie de validación. La tabla 4 mostrada en la fig. 4 y las figs. 8 y 9 se basan en la serie de estudio inicial indicado y en todos los casos afectados Los resultados de los procedimientos de ensayo se analizaron para determinar si existían diferencias significativas en los niveles de cada marcador entre los casos afectados y no afectados. La tabla 1 (fig. 1) indica que los casos afectados fueron significativamente diferentes de los no afectados en todos los marcadores excepto en el UE. Además, se determinó la proporción de falsos positivos y la eficacia de detección de cada marcador como se muestra en la tabla 2 (fig.2). La mayor eficacia de detección se consiguió con un ensayo de hcg que medía tanto la molécula intacta como la subunidad beta libre. Se observó un aumento adicional en la eficacia de detección combinando marcadores individuales en compuestos. El compuesto que contenía el ensayo de hcg, que medía tanto la molécula de hcg intacta como la subunidad beta libre de hcg, producía la mayor eficacia de detección entre los compuestos como se muestra en la tabla 3 (fig. 3). La evaluación de la subunidad beta y alfa de hcg individualmente demostró que no existían diferencias significativas entre los casos afectados y no afectados para la subunidad alfa (p = 0,23), mientras que se observó un aumento significativo en la subunidad B en los casos afectados (p = 0,001). Como se conoce generalmente en la técnica, el valor de p mide la fuerza de la evidencia en estudios científicos indicando la probabilidad de que un resultado al menos tan extremo como el observado se produzca por casualidad. Cuanto menor es el valor de p más fuerte es la evidencia de que la observación no es una casualidad. La fig. 8 muestra los percentiles del 10%, 50% y 90% de beta-hcg libre por edad gestacional. Se observa una tendencia descendente continua por edad gestacional en los embarazos no afectados. El análisis de los niveles de betahcg libre en los casos de síndrome de Down fetal, como se muestra en la tabla 4 (fig. 4), revela que el 86% está por encima de la mediana de los casos no afectados. Los niveles de beta hcg libre tanto en los casos afectados como no afectados presentan una distribución logarítmica gausiana (p = 0,78 y 0,86). La fig. 9 ilustra estas distribuciones. La tabla 5 (fig. 5) proporciona los datos de eficacia de detección sobre la subunidad beta-hcg libre y la subunidad alfa-hcg libre individualmente. En la tabla 5 se muestra la alta eficacia de detección de la beta-hcg libre. Se consiguió una eficacia de detección incluso mayor con un compuesto de AFP y beta-hcg libre. Al incorporar el log del nivel de beta-hcg libre y el log del nivel de MSAFP en el procedimiento de discriminación lineal en el paquete estadístico de software informático disponible en el mercado Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.), como se ha descrito anteriormente, se consiguió una eficacia de detección superior como se muestra en la tabla 6 (fig. 6). También se conseguiría una alta eficacia de detección usando el nivel de beta-hcg libre y el nivel de AFP, en lugar de logaritmo de cada uno. Un análisis adicional de los datos indicó que tanto la AFP como la beta-hcg libre son independientes de la edad materna (p = 0,8394 y 0,5214 usando el ensayo de Kruskal-Wallis a través de cuatro grupos de edad materna diferentes para AFP y beta-hcg libre respectivamente (edades = 30, 31-35, y 40). Además, la correlación (r) de los niveles de la subunidad beta libre de hcg y AFP no fue significativamente diferente de 0 (r = 0,04, p = 0,39 y r = - 0,06, p = 0,81 para los casos afectados y no afectados, respectivamente). La observación fundamental encontrada en nuestros datos confirma el hecho de que la subunidad beta-hcg libre contribuye a la mayor eficacia de detección para el síndrome de Down. De hecho, el uso de un ensayo que medía únicamente la beta-hcg libre producía una eficacia de detección y una proporción de falsos positivos del 65,4% y 5,2% respectivamente. Estas proporciones son comparables a las presentadas por otros que utilizan una combinación de tres ensayos. De esta manera, como se ha indicado previamente, la reducción del número de ensayos es un ventaja de la presente invención. Nuestros hallazgos sobre la contribución de la beta-hcg libre se basan en lo siguiente: (a) el mejor contribuyente individual a la eficacia de detección del síndrome de Down era un ensayo de la beta hcg libre, (b) un ensayo para la molécula de hcg intacta produce substancialmente menores proporciones de detección, y (c) un ensayo que mide una combinación de la molécula de hcg intacta y la beta-hcg libre produce una mayor eficacia de detección que un ensayo que mide la molécula de hcg intacta sola. Se establece que el riesgo de síndrome de Down fetal aumenta con la edad materna. Por lo tanto, como se ha descrito anteriormente, para producir riesgos con especificidad de paciente para el uso clínico de la presente invención, se incorpora un riesgo a priori específico de la edad materna en el procedimiento de análisis discriminatorio multivariante. Como tanto los niveles de AFP como los niveles de beta-hcg libre son independientes de la edad materna, hemos analizado nuestros datos para ver cuántas mujeres afectadas y no afectadas tendrían resultados positivos dado un riesgo a priori para cada edad individual. La información anterior se usó para proyectar, basándose en la distribución de edades maternas de nacimientos vivos en Estados Unidos, la proporción de falsos positivos y sensibilidad para una selección nacional exhaustiva dentro de los Estados Unidos. Como se muestra en la tabla 7 (fig. 7), las proyecciones indican que es posible conseguir una proporción de detección del 80%, con un 5% de falsos positivos. 10

11 5 Las muestras descritas en el ejemplo 2 se analizaron adicionalmente para descubrir la eficacia de detección de otras combinaciones de los marcadores. Más particularmente, se realizó el procedimiento discriminatorio lineal del ejemplo 2 con el mismo límite de riesgo y un nivel de riesgo a priori, sobre diferentes combinaciones de los marcadores, múltiplos de la mediana (MOM) para el marcador y logaritmos de los marcadores, con y sin la incorporación de la edad gestacional. El procedimiento discriminatorio lineal se realizó usando tanto los datos de referencia como los datos de validación. Los resultados se resumen en la tabla 8 en la fig. 10. Ejemplo 3 10 El siguiente ejemplo ilustra la preparación de un ensayo de beta-hcg libre de una etapa y un ensayo de beta hcg libre de dos etapas y su uso en el método de la presente invención. Preparación de un ensayo de beta-hcg libre de una etapa Una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubre con un anticuerpo de captura que es específico para la subunidad beta libre de la molécula de gonadotropina coriónica humana (hcg). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La concentración de anticuerpo usada para recubrir la placa es de 0,8 microgramos por pocillo pero si se desea puede ser diferente. La placa se incuba a 4ºC durante al menos 16 horas. 2. La placa se lava con una solución salina tamponada con fosfato de ph 7,2 que contiene un 0,05% de Tween 20. Pueden emplearse otros tampones de lavado adecuados. La placa después se bloquea con una solución que contiene un 3% de proteína animal hidrolizada y un 0,05% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato de ph 7,2. Pueden usarse otras soluciones, con las que estarán familiarizados los especialistas en la técnica, tales como albúmina de suero bovino al 1%. A cada pocillo se le añaden 300 microlitros de solución de bloqueo y la placa se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. También son viables otros procedimientos de bloqueo, por ejemplo esmaltado. 3. La placa después se lava, como se ha descrito anteriormente, y se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene un anticuerpo biotinilado específico para la subunidad beta libre de la hcg. El tampón de ensayo usado es proteína animal hidrolizada al 3% y Tween 20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato de ph 7,2, pero puede ser cualquiera de varias soluciones adecuadas conocidas por los especialistas en la técnica. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y, según prefiera el operario, puede conjugarse con otra substancia distinta de biotina, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. La concentración del anticuerpo en el tampón de ensayo puede ajustarse para obtener valores de absorbancia óptimos. 4. A cada pocillo se le añaden 20 microlitros de muestra. La muestra puede ser: tampón de ensayo, procesado como blanco para verificar el rendimiento del ensayo; una solución de beta hcg libre usada para estandarizar valores de muestras desconocidas; o una muestra de suero de una segunda mujer embarazada en el segundo trimestre de embarazo. La placa se somete a agitación vorticial durante 30 segundos y después se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm, donde se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. 5. La placa después se lava como se ha descrito anteriormente. Después se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Esta etapa no se requiere si el segundo anticuerpo usado se conjuga con una substancia distinta de la biotina. La concentración de estreptavidinaperoxidasa en el tampón de ensayo es de 2,0 microgramos por mililitro. La placa se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 6. La placa después se lava como se ha descrito previamente. A cada pocillo se le añaden cien microlitros de una solución de substrato de o-fenilendiamina. Como alternativa, esta solución de substrato puede ser uno de varios colorantes apropiados conocidos por los especialistas en la técnica y depende de la substancia que se conjugue con el segundo anticuerpo. La placa se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm y se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 8 minutos. 7. Después se añaden cien microlitros de ácido sulfúrico diluido (1,0 N) a cada pocillo para detener la reacción del substrato. 8. La absorbancia de cada pocillo se determina espectrofotométricamente a 492 nm Preparación de un ensayo de beta hcg de dos etapas 1. Una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubre con un anticuerpo de captura que es específico para la subunidad beta libre de la molécula de gonadotropina coriónica humana (hcg). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. La concentración de anticuerpo usada para recubrir la placa es de 0,8 microgramos por pocillo, pero si se desea puede ser diferente. La placa se incuba a 4ºC durante al menos 16 horas. 2. La placa se lava con una solución salina tamponada con fosfato de ph 7,2 que contiene un 0,05% de Tween 20. Pueden emplearse otros tampones de lavado adecuados. La placa después se bloquea con una solución que contiene un 3% de proteína animal hidrolizada y un 0,05% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato de 11

12 ph 7,2. Pueden usarse otras soluciones, con las que estarán familiarizados los especialistas en la técnica, tales como albúmina de suero bovino al 1%. A cada pocillo se le añaden 300 microlitros de solución de bloqueo y la placa se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. También son viables otros procedimientos de bloqueo, por ejemplo esmaltado. 3. La placa después se lava como se ha descrito anteriormente y se añaden 100 microlitros de tampón de ensayo a cada pocillo. El tampón de ensayo usado es proteína animal hidrolizada al 3% y Tween 20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato de ph 7,2 pero puede ser cualquiera de varias soluciones adecuadas conocidas por los especialistas en la técnica. 4. A cada pocillo se le añaden 20 microlitros de muestra. La muestra puede ser: tampón de ensayo, procesado como blanco para verificar el rendimiento del ensayo; una solución de beta hcg libre usada para estandarizar valores de muestras desconocidas; o una muestra de suero de una segunda mujer embarazada en el segundo trimestre de embarazo. La placa se somete a agitación vorticial durante 30 segundos y después se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm, donde se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. 5. La placa después se lava como se ha descrito anteriormente y se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene un anticuerpo biotinilado específico para la subunidad beta de hcg. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y, según la preferencia del operario, puede conjugarse con una substancia distinta de la biotina, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. La concentración del anticuerpo puede ajustarse para obtener valores de absorbancia óptimos. La placa se agita vorticialmente durante 30 segundos y después se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm, donde se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. 6. La placa después se lava como se ha descrito anteriormente. Después se añaden a cada pocillo 100 microlitros de tampón de ensayo que contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Esta etapa no se requiere si el segundo anticuerpo usado se conjuga con una substancia distinta de la biotina. La concentración de estreptavidinaperoxidasa en tampón de ensayo es de 2,0 microgramos por mililitro. La placa se pone en un dispositivo giratorio a 220 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 7. La placa después se lava como se ha descrito previamente. A cada pocillo se le añaden cien microlitros de una solución de o-fenilendiamina. Como alternativa, esta solución de substrato puede ser uno de varios colorantes apropiados conocidos por los especialistas en la técnica y depende de la substancia que se conjugue con el segundo anticuerpo. La placa se pone en un dispositivo giratorio a 200 rpm y se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 8 minutos. 8. Después se añaden cien microlitros de ácido sulfúrico diluido (1,0 N) a cada pocillo para detener la reacción del substrato. 9. La absorbancia de cada pocillo se determina espectrofotométricamente a 492 nm. Estos dos ensayos se usaron para realizar el método de la presente invención. Se utilizaron ciento setenta y ocho (178) muestras de pacientes para estudiar la relación entre el síndrome de Down fetal y los niveles de beta-hcg libre en sangre materna. Se analizaron veintiséis (26) muestras de mujeres embarazadas que se sabía que llevaban fetos con síndrome de Down y 152 muestras no afectadas desconocidas. Todas las muestras procedían de mujeres embarazadas no diabéticas con un solo feto. En las muestras de las pacientes después se analizaron los niveles cuantitativos de MSAFP por un ensayo ELISA, y los niveles de beta-hcg libre por el ensayo de una etapa y el ensayo de dos etapas independientemente. El nivel de MSAFP y el nivel de beta-hcg libre por cada ensayo después se convirtió en una variable en el procedimiento discriminatorio lineal en el paquete estadístico de software informático disponible en el mercado Statistical Analysis System para generar una serie de datos de referencia. La edad gestacional de la paciente también se incorporó como una variable en el procedimiento discriminatorio. Los resultados de estos análisis discriminatorios, para todas las edades gestacionales y para edades gestacionales entre 14 y 16 semanas se resumen a continuación. Todas las semanas Falso Positivo Eficacia de Detección Controles Afectados Log (beta-1) 6,6% 69,2% Log (beta-1) + Log (AFP) 5,9% 72,0% Log (beta-2) 8,2% 33,3% Log (beta-2) + Log (AFP) 10,1% 64,7% Log (beta-2)* 9,6% 33,3% Log (beta-2) + Log (AFP)* 10,3% 52,9%

13 Semanas Falso Positivo Eficacia de Detección Controles Afectados 5 10 Log (beta-1) 5,8 68,4% Log (beta-1) + Log (AFP) 4,8% 73,7% Log (beta-2) 7,1% 45,4% Log (beta-2) + Log (AFP) 9,2% 63,6% Log (beta-2)* 10,4% 54,6% Log (beta-2) + Log (AFP)* 8,3% 63,6% Nota: todos los análisis incluyen la edad gestacional 15 * En los análisis con un * se eliminaron 2 resultados aislados con valores de 260 y

14 REIVINDICACIONES 1. Un aparato que comprende: medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel de beta (hcg) libre en la sangre materna de una mujer embarazada y medios informáticos para comparar los datos de medición del nivel de la beta (hcg) libre con una serie de datos de referencia para determinar las trisomías cromosómicas fetales. 2. El aparato de la reivindicación 1, donde la trisomía cromosómica fetal es el síndrome de Down. 3. Aparato para determinar si una mujer embarazada tiene un riesgo significativo de llevar un feto con síndrome de Down que comprende: medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel de beta (hcg) libre en sangre materna de la mujer embarazada, medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel de alfa fetoproteína en sangre materna de la mujer embarazada, y medios informáticos para calcular una serie de datos normativos a partir de una serie de datos de referencia que contienen valores de referencia del nivel de beta (hcg) libre y el nivel de alfa fetoproteína a diversas edades gestacionales en: (1) mujeres embarazadas que llevan fetos con síndrome de Down y (2) mujeres embarazadas que llevan fetos normales, y para incorporar dichos datos de mediciones de dichos niveles de dicha beta (hcg) libre y alfa fetoproteína, y dicha edad gestacional de la mujer embarazada en una función de densidad de probabilidad, comparándose de esta manera dichos niveles y dicha edad gestacional de la mujer embarazada con la serie de datos normativos para determinar dicho riesgo de la mujer embarazada de llevar un feto con síndrome de Down. 4. Aparato para determinar si una mujer embarazada tiene un riesgo significativo de llevar un feto con síndrome de Down que comprende: medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel de beta (hcg) libre en sangre materna de la mujer embarazada, y medios informáticos para calcular una serie de datos referencia y para incorporar dichos datos de medición de dicho nivel de beta (hcg) libre y dicha edad gestacional de la mujer embarazada en una función de densidad de probabilidad, comparándose de esta manera dicho nivel de beta (hcg) de la mujer embarazada y dicha edad gestacional de la mujer embarazada con la serie de datos normativos para determinar dicho riesgo de la mujer embarazada de llevar un feto con síndrome de Down. 5. El aparato de la reivindicación 3 o 4, que comprende además: medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel de alfa fetoproteína en la sangre materna de la mujer embarazada, y donde el medio informático también incorpora los datos de medición de la alfa fetoproteína en la función de densidad de probabilidad y, por lo tanto, también compara el nivel de alfa fetoproteína de la mujer embarazada con la serie de datos de referencia. 6. El aparato de las reivindicaciones 3, 4 o 5, donde la serie de datos de referencia se calcula a partir del logaritmo o los logaritmos de los datos de medición del nivel o los niveles, y el logaritmo o los logaritmos de los datos de medición se usan para comparar el nivel o los niveles de la mujer embarazada con la serie de datos normativos Aparato para determinar si una mujer embarazada tiene un riesgo significativo de llevar un feto con síndrome de Down, que comprende: medios adaptados para recibir los datos de medición del nivel en sangre materna de la mujer embarazada de un analito seleccionado entre el grupo compuesto por beta (hcg) libre, una variante (variantes) de beta (hcg) libre o una forma aberrante (formas aberrantes) de la beta (hcg) libre y medios informáticos para calcular una serie de datos de referencia y para incorporar dichos datos de medición de dicho nivel del analito y dicha edad gestacional de la mujer embarazada en una función de densidad de probabilidad, comparándose de esta manera dicho nivel de dicho analito en la mujer embarazada y dicha edad gestacional 14

15 de la mujer embarazada con una serie de datos normativos para determinar dicho riesgo de la mujer embarazada de llevar un feto con síndrome de Down NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 15

16 16 ES T3

17 17

18 18 ES T3

19 19

20 20 ES T3