TALLER DE INMUNOTERAPIA ESPECIFICA
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- María Carmen Maldonado Rivas
- hace 6 años
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1 - Manejo practico de las vacunas de ITE- TALLER DE INMUNOTERAPIA ESPECIFICA Estandarización Productos Stallergenes: Dr Adnan Tanovic Departamento Médico STALLERGENES-IPI, S.A. Diagnósticos Terapéuticos Algunos conceptos Extracto: Según la Farmacopea Europea los extractos alergénicos son preparados farmacéuticos que derivan de materiales existentes en la naturaleza, que contienen alergenos (en su mayoría proteínas y glicoproteínas) y que son sustancias que causan y/o provocan enfermedad alérgica. Alergeno: Componente antigénico de un extracto capaz de inducir una respuesta inmunológica. 1
2 Estandarización: Garantía de Calidad, Eficacia y Seguridad Conjunto de métodos que aseguran la reproducibilidad, lote a lote, de la actividad biológica de los extractos alergénicos comparándolos con un extracto de referencia (IHR*). *In House Reference Extracto de Referencia Interno. Renovado cada 5 años. Historial de la estandarización Cook, Stull PNU Unidad de Nitrógeno proteico 76 Ref. Estandarizadas o Reestandarizadas HEP Stallergènes IR AU IU Noon P/V IgE Debido al no conocerse medidas para alergenos individuales, la estandarización se basó en la medición de la actividad alergénica global. OMS 1998 Recomienda utilizar extractos estandarizados 2
3 Proceso de una estandarización biológica Control exhaustivo para asegurar la identidad y la pureza de la materia prima mediante: Radio-esterilización sistemática de toda la materia prima de ácaros, hongos y alergenos de origen animal. Medios de cultivo patentados sin proteínas animales (STALMITE APF ) Polen sin pesticidas y metales pesados. Proceso de una estandarización biológica EL EXTRACTO DE REFERENCIA INTERNO (IHRS) SE OBTIENE A PARTIR DE: - CARACTERIZACIÓN IN VITRO DE LAS PROTEÍNAS Y ALERGENOS DE LOS EXTRACTOS Métodos: CUANTITATIVO- Cuantificación del contenido proteico total: Isoelectroenfoque (IEF), SDS Page, electroforesis y 2D electroforesis. CUALITATIVO- Dosificación de los alergenos: Immunoblotting, RAST- o ELISA-inhibición. - CALIBRACIÓN IN VIVO Objetivo: Calibrar la potencia alergénica del extracto determinando su capacidad para inducir una reacción alérgica. Métodos: Los tests cutáneos se realizan en una población de pacientes clínicamente sensibilizados al alergeno para ajustar la actividad alergénica. EL EXTRACTO DE REFERENCIA (IHRS) PUEDE ENTONCES SER UTILIZADO PARA CALIBRAR LA ACTIVIDAD ALERGÉNICA DE EXTRACTOS INDUSTRIALES. 3
4 Proceso de una estandarización biológica Allergène 1 = Allergène majeur Allergène 2 Allergène 3 Isoelectroenfoque (IEF), SDS Page, electroforesis y 2D electroforesis. Proteins Molécules non allergéniques = ballast pool IgE Allergens Bet v 7 Bet v 1 histamine (T+) Diluant (T-) Extract (dilution A) Extract (dilution B) Extract (dilution C) Bet v 2 IgE inmunoblot IN VITRO IN VIVO IR (INDICE DE REACTIVIDAD) EL EXTRACTO DE REFERENCIA PUEDE ENTONCES SER UTILIZADO PARA CALIBRAR LA ACTIVIDAD ALERGÉNICA DE EXTRACTOS INDUSTRIALES. Proceso de una estandarización biológica Allergène 1 = Allergène majeur Proteins Caracterización de proteínas Allergène 2 Allergène 3 Molécules non allergéniques = ballast pool IgE Allergens Bet v 7 Bet v 1 Bet v 2 IN VITRO Isoelectroenfoque (ph) Gramíneas SDS-Page (PM) Avellana Electroforesis 2D (ph & PM) La presencia de las bandas proteicas permiten visualizar la presencia de los alérgenos mayores y menores Abedul 4
5 Proceso de una estandarización biológica Allergène 1 = Allergène majeur Allergène 2 Proteins Caracterización de alergenos Allergène 3 Molécules non allergéniques = ballast pool IgE Allergens IgE Inmunoblot / Western blot Bet v 7 Bet v 1 Bet v 2 Bet v 7 Bet v 1 Bet v 2 Amb a 1 Amb a 2 Amb a 1 Amb a 5 Amb a 6 Amb a 7 IN VITRO Mediante Inmunoblot se separan proteínas por electroforesis, para posteriormente detectar con anticuerpos séricos los antígenos presentes. Estandarización de extractos: la garantía de calidad 3 diluciones del extracto IHRS a razón de 1:10 P/V. Se realizan pruebas cutáneas en cuadruplicado para cada una de las tres diluciones a 30 pacientes. IN VIVO histamine (T+) Diluant (T-) Extract (dilution A) Extract (dilution B) Extract (dilution C) 5
6 3 diluciones del extracto IHRS a razón de 1:10 P/V. Se realizan pruebas cutáneas en cuadruplicado para cada una de las tres diluciones a 30 pacientes. IN VIVO histamine (T+) Diluant (T-) Extract (dilution A) Extract (dilution B) Extract (dilution C) Estandarización de extractos: la garantía de calidad Extracto experimental Extracto de referencia 100 I.R. IR (ÍNDICE DE REACTIVIDAD) A un extracto alergénico se le asigna un valor de 100 IR/ml cuando, mediante prick-test utilizando la lanceta Stallerpoint en 30 pacientes sensibilizados a este alergeno, provoca una pápula de diámetro medio de 7 mm (o 38.5 mm 2 ). A cada paciente se le practican controles positivos con dihidrocloruro de histamina 1% (10 mg/ml) o fosfato de codeína (9%) y cuatro pricks para cada una de las tres diluciones del extracto. 6
7 Extracto experimental Extracto de referencia 100 I.R. IC (ÍNDICE DE CONCENTRACIÓN) Cuando un extracto estandarizado existe en la familia del alergeno, el proceso de fabricación no es diferente al extracto alergénico estandarizado: 100 IC/ml se obtiene utilizando el mismo ratio de extracción que el extracto estandarizado a una concentración de 100 IR/ml. Cuando un extracto estandarizado no existe en la familia, entonces se utiliza una constante de extracción y ratio de reproducibilidad (100 IC = 1/100 P/V). Estandarización de extractos: la garantía de calidad CONCLUSIÓN RAST-inhibition RAST-Inhibición MATERIAS PRIMAS Selección de fuentes, Controles Lote a Lote FABRICACION DE SOLUCIONES-MADRES: Extracción, purificación, dilución Ajuste de la actividad EXTRACTO DE REFERENCIA 100 IR/ml RAST Inhibición RAST-inhibition LIOFILIZACION : Control y ajuste RAST Inhibición RAST-inhibition Almacenamiento + 4 C RECONSTITUCION IR / IC IR / IC IR / IC IR / IC Alustal Phostal Staloral Staloral300 Diagnósticos APEP 7
8 VENTAJAS VENTAJAS de los extractos estandarizados: La estandarización es una garantía de eficacia y seguridad tanto para el diagnóstico como para el tratamiento. Diagnóstico: seguro y cuantificable. Control y uniformidad de dosis de lote a lote. Homogeneidad en la potencia y composición cualitativa de los lotes. Relación entre dosis y eficacia. Limites de estandarización de extractos LIMITES La cantidad de alergenos mayores (alergenos reconocidos por IgE especifica en más de 50% de pacientes) difiere hasta 1000 veces entre diferentes extractos. La calibración in vivo (reacción cutánea mediada por IgE) puede ser problemática debido a las variaciones en metodología, reactividad y epidemiología de diferentes poblaciones. Diferentes técnicas de laboratorio para la medición de los alergenos dan resultados diferentes. Las unidades biológicas difieren de laboratorio a laboratorio e incluso pueden diferir entre los diferentes rangos de productos de un mismo laboratorio. (IU - international unit, AU - allergy unit, BAU - biological allergy unit, BU - biological unit, TU - therapeutic unit, IR - index of reactivity). Definiciones y estándares pueden diferir entre países: Estados Unidos: son establecidas por las autoridades sanitarias como referencias externas estándares oficiales; Europa: son establecidas por el mismo laboratorio, como estándares internos. 8
9 Proyecto: Create Project (Certified References for Allergens and Test Evaluation) Ronald Van Ree and the Create partnership. The create project: EU support for the improvement of allergen standardization in Europe. Allergy 2004: 59: Objetivo principal: Estudio multicéntrico para A) la evaluación de los alergenos mayores recombinantes o naturales purificados (y anticuerpos monoclonales) para obtener material de referencia certificado y B) validación de ELISA Sándwich para su cuantificación (medir la cantidad, no la actividad). Alergenos implicados: Der p 1, Der p 2, Der f 1, Der f 2 (Ácaros) Bet v 1 (Abedul) Ole e 1 (Olivo) Phl p 1, Phl p 5a-b (Gramíneas). AcM nº 2 AcM nº 1 * B Coloración TECNICA ELISA Sandwich Alergeno mayor Fase sólida Estandarización de extractos: la garantía de calidad 9
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