METODOS INMUNOLOGICOS PARA LA DETECCION DE MENSAJEROS QUIMICOS

Transcripción

1 METODOS INMUNOLOGICOS PARA LA DETECCION DE MENSAJEROS QUIMICOS Se debe entender cómo se puede detectar y cuantificar los mensajeros químicos. Nos vamos a basar en métodos para hormonas de tipo peptídico o proteico. Son tres métodos que se utilizan para la medición y detección de las hormonas aunque no son muy recientes Métodos para la detección y cuantificación de hormonas. - Radioinmunoensayo (RIA). Rosalind Yallow, Premio Novel 1977 no lo hizo sola pero participó en el desarrollo de esta técnica, que permitió por primera vez medir cantidades muy pequeñas en la sangre y en los tejidos, de tal manera que en esta época se pudo conocer cual era la función de machas de las hormonas que se sabía que existía pero no sus funciones ni donde se situaban. - Enzime-linked inmuno sorbent assay (ELISA) en algunos casos ha sustituido al radioinmunoensayo, es una variedad de todo un grupo de técnicas en las cuales se van a utilizar una serie de moléculas como son las enzimas para detectar las hormonas. - Tecnicas inmunohistoquimicas. En las cuales podemos detectar en cortes de tejido la localización de las hormonas. Estas técnicas tienen en común la necesidad de producir anticuerpos específicos contra la sustancia que queremos medir. Producción de anticuerpos específicos: (puede ser de dos tipos) Policlonales son más rápidos de hacer (producido por varios clones de células plasmáticas por lo que se obtiene diferentes clones y cada uno sigue una línea y los anticuerpos son ligeramente diferentes y se pueden unir a diferentes epitopos dependiendo de la especificidad) se produce en conejos, caballo al inyectarle una sustancia extraña. Monoclonales solo se pueden producir in vitro son idénticos y se unen a epitopos especifico.

2 Producción experimental de anticuerpos (sirve para los dos tipos) - La respuesta inmune humoral y anticuerpos. - Antígenos, portadores, conjugación. - Influencia del conjugado sobre anticuerpos. - Adyuvantes y protocolo de inmunización. - Anticuerpos monoclonales producción y selección. Bases moleculares de la inmunidad Sistema inmunitario de vertebrados: (su función es) Distinguir entre lo propio y lo extraño al organismo. Como puede ser cualquier molécula, organismo ya que puede ser peligroso para este organismo Destruir a las moléculas extrañas. La misión va a ser destruir cualquier molécula para que no dañe al organismo vivo. Características: Especificidad cuando el organismo recibe una molécula extraña va a reaccionar contra concretamente y no contra otra Memoria cuando vuelve esta sustancia al organismo hay unas células que ya están preparadas para actuar contra esa sustancia y lo hacen de una forma más rápida y más efectiva que la primera vez por lo que es muy útil para protegernos de cualquier sustancia nociva y es de gran utilidad cuando se quiere producir anticuerpos específicos contra una sustancia. Bases moleculares de la inmunidad Tipos de respuesta del organismo: Humoral de lugar a los anticuerpos (es la que nos interesa) Celular Ambas se van a producir al mismo tiempo Enfermedades autoinmunes: cuando el sistema inmunitario no funciona adecuadamente y reconoce como extraño lo que es propio, va a producir anticuerpos contra las propias células y sustancias del organismo provocando efectos muy graves en el organismo.

3 Se va a considerar por un lado los anticuerpos, por otro los antígenos y por otro la unión antígenoanticuerpo (forma por la que los anticuerpos se van a unir a los antigenos) Anticuerpos - Proteínas solubles del tipo inmunoglobulinas - Especificidad unirse específicamente a unas sustancias y no a otras - Afinidad debe ser alta para que con poca sustancia (hormona en tejidos y sangre) que haya estos se adhieran fuertemente - Producción por células plasmáticas, del sistema inmune Antígenos - Moléculas extrañas del organismo, se le puede dar al organismo y provocar la producción de anticuerpos - Provocan la producción de anticuerpos - Determinante antígeno o epitopo, uno o varios. Para provocar la producción debe tener un determinante antigénico o epitopo (parte de una molécula que va a ser reconocida por el sistema inmunitario y se van a producir anticuerpos específicamente contra esta parte de la molécula, no contra toda la molécula y puede suceder que en una proteína grande existan varias zonas que sean reconocidos por el sistema inmunitario y que este produzca anticuerpos que se unan específicamente a esta parte y no a otra) y puede tener uno o varios en una misma molécula Unión antígeno- anticuerpo

4 Se observa un esquema de la respuesta inmune humoral, teniendo en cuenta que se va a producir la respuesta celular a la vez. Las células B del sistema inmunitario cuando se encuentra con un antígeno se activa y prolifera y se diferencia. Esto da lugar a las células de memoria y a las células plasmáticas, por el hecho de producirse estos dos tipos de células tras la activación de los linfocitos B es por lo que podemos tener la característica de memoria del sistema inmune. Son las células plasmáticas las que van a producir los anticuerpos y estos se van a unir a los antígenos. Foto de una célula plasmática en la cual hay un elevado desarrollo del RER pues es donde se va a producir los anticuerpos que son las proteínas que nosotros vamos a utilizar

5 Este es el esquema completo en el que aparece la respuesta celular y como funciona en conjunto.

6 Respecto a la estructura de los anticuerpos se sabe que existen diferentes inmunoglobulinas del plasma, las que son realmente anticuerpo son las inmunoglobulinas G, son la mayoría de los anticuerpos que son funcionantes y son los que se van a querer obtener pero también se van a producir unas pequeñas cantidades de inmunoglobulina C. Dentro de esto nos interesa que cuando se trata de determinadas enzimas se tiene la fracción F c y la fracción F a, en algunos casos nos va a interesar ya que so peden producir anticuerpos contra diferentes partes de estas moléculas (estas inmunoglobulinas) y se puede fabricar anticuerpos contra la unidad F c en procariotas y se puede por ejemplo producir anticuerpos contra células de una misma especie, así se obtiene anticuerpos contra anticuerpos del mismo animal contra inmunoglobulinas de otro animal (lo que interesa es la parte de la unión entre los dos anticuerpos) y también interesa la zona de unión con el antígeno con una serie de datos en cadenas ligeras y pesadas.

7 Se observan los dominios F ab y los dominios F c y la unión que se encuentra en la molécula. Lo importante para la especificidad son los lumis que son exactamente donde se van a unir los antígenos y es donde van a ser diferentes las moléculas de IgG en los diferentes anticuerpos. Se observa una proteína que no está plegada y que cuando se pliega puede dar lugar las inmunoglobulinas pero las cadenas laterales de estos aminoácidos que forman parte del hueco de unión es importante para determinar la especificidad de cada una de estas moléculas, van a ser diferentes dependiendo de las células plasmáticas de las que procedan. La especificidad no va a ser al 100% por lo que habrá algunas excepciones y se hablará de un anticuerpo con diferentes.

8 Las uniones entonces de los anticuerpos con los diferentes antígenos forma la serie inmune.

9 Los anticuerpos policlonales son más rápidos de hacer, producido por varios clones de células plasmáticas por lo que se obtiene diferentes clones y cada uno sigue una línea y los anticuerpos son ligeramente diferentes y se pueden unir a diferentes epitopos dependiendo de la especificidad. Se produce en conejos, caballo al inyectarle una sustancia extraña. Los anticuerpos monoclonales solo se pueden producir in vitro son idénticos y se unen a epitopos especifico.

10 Cuando se inyecta a un animal una sustancia extraña tenemos dos respuestas: - La respuesta primaria que se realiza después de la primera inyección de la sustancia extraña y lo que sucede es que hay un periodo de una serie de días (5) en los cuales no se puede detectar el anticuerpo, a partir de ahí ya se puede detectar y se observa un pico de IgM y un poco más tarde de IgG que es incluso más alto y después dejan de producirse en ambos casos. El rendimiento de estos anticuerpos es muy bajo y en pequeña cantidad. - La respuesta secundaria, se debe volver a inyectar a esos animales en la cual también hay una secreción de IgM pero la de IgG es más grande y más continua lo que se aprovecha para obtener mayor cantidad de anticuerpos. En comparación las respuestas son bastante distintas. El proceso va a consistir en inyectar repetidamente a un animal el antígeno e ir guardando esos sueros que llevan el anticuerpo, después se purifica el suero y se obtienen los anticuerpos policlonales.

11 Antígenos - Mensajeros químicos de naturaleza peptídica y proteica. - Baja capacidad antigénica moléculas pequeñas que cuando son inyectadas por sí mismas no provocan la producción de anticuerpos - Carecen de algunos requisitos para provocar una buena respuesta inmune humoral - Unir covalentemente a proteínas grandes que aporten características inmunogénicas: conjugación. - Agentes conjugantes (reactivos capaces de producir la unión covalente ente el antígeno y una proteína): Glutaraldehido Carbodimida Tiene la capacidad de relacionar con aminas N-terminales a aminas que se encuentran en las cadenas laterales de la lisina principalmente y también pero en menor grado de la histidina y la tirosina. Reacciona con aminas y las va a unir unas con otras.

12 Provoca un enlace de tipo peptídido tanto de de grupos carboxílicos de cadenas c-terminales de cadenas laterales con grupos amino N-terminales o de cadenas largas. Proteínas portadoras - Características: Soluble Degradable Fácil de obtener - Más comunes: BSA Pm Tiroglobulina ----Pm pesos moleculares grandes KHL (kenale- lipket hemocyarin) Se va unir el péptido pequeño con una proteína muy grande y eso se la va a inyectar al animal para que produzca anticuerpos anti ello.

13 A la hora de producir los anticuerpos policlonales y monoclonales hay que predecir de qué manera se van a producir estas uniones. Sí se conoce la secuencia de aminoácidos de un péptido como el GLP-1, los puntos rojos son los puntos probables de unión del péptido a la proteína por medio de la carbodiimida dependiendo de la cadena polipeptídica y si la unión la hacen a través del glutaraldehido pues se pueden ver en algunos casos, esto sucede en péptidos relacionados con el glucagón, no hay unión en los 10 anteriores al N-terminal o en este caso pocos. Lo interesante es que s la unión se produce cercana al extremo N-terminal lo que va a actuar como epitopo realmente en esta molécula (peptido) va a ser el extremo C-terminal. Esto es porque si se une con un enlace covalente al péptido pequeño a una molecula muy grande, esta enmascara mucho al péptido excepto lo que queda en el extremo C-terminal lo que queda en el extremo C-terminal es lo que el animal va a reconocer como extraño. Esto es importante porque se puede dirigir en que punto de nuestro péptido o proteína queremos que se nos una los anticuerpos.

14 En la molécula de proglucagón se ha utilizado este tipo de técnicas para que la célula α de los islotes de Languerhans lo produzcan, pero no en las del intestino. En las células-l del intestino se produce GRPP y oxitomudulina. Pero todas estas moléculas se van a producir en el organismo y a veces no se va a poder distinguir si lo que estamos midiendo es glucagón o glicentina (porque está entre la molécula vecina). Lo que se a podido conseguir son anticuerpos que se unan preferentemente al extremo N-terminal del glucagón y otro que se unan al extremo C-terminal del glucagón, por lo que habrá zonas de unión comunas para la glicentina para la oxintomodulina que es la parte del glucagón y esto nos sirve para medir las cantidades exactas de glucagón.

15 De esta forma se ha podido hacer una serie de antisueros (porque no está purificado el anticuerpo) en los que se observa el titulo (dilución optima de un suero que delimita) y la especificidad (se mezclan los anticuerpos contra el glucagón al glucagón y a la oxntomodulina) en ambos casos se obtienen unas graficas diferentes ya que existe una diferencia entre los anticuerpos que se unen al glucagón y los que se unen a la oxintomodulina i se puede distinguir si son específicos del glucagón o no. Se observan graficas que representan el titulo y la especificidad (observando si se van a unir al extremo C-terminal estos no distinguen entre el glucagón y la oxintomodulina porque son comunes, o al extremo N-terminal). En la grafica de abajo izquierda no miden lo mismo por lo que se unen al extremo que no es común y la grafica de abajo a la derecha si mide lo mismo por lo que se unen al extremo común del glucagón. Adyuvantes - Sustancias oleaginosas (necesarias para emulsionar el conjugado) - Emulsión del conjugado en el adyuvante - Protegen al antígeno contra la degradación (para que partículas acuosas del conjugado estén recubiertas de sustancia oleaginosa) - Forman un deposito del antígeno cuando se inyecta en el animal - Producen inflamación local que estimula al sistema inmunitario a reaccionar contra lo inyectado. Adyuvante de Freund: Completo tiene unas bacterias activadas por calor que van a ayudar aun más al sistema inmunitario produciendo una inflamación importante donde se inyecta Incompleto

16 Se prepara el conjugado y después se mezcla con el adyuvante de freund completo y después se utilizan pequeñas cantidades se inyectan debajo de la piel y luego se obtienen los anticuerpos. Si se quieren policlonales se adquieren los del suero pero si se quieren los monoclonales se deben hacer otros pasos y se utilizan ratones. Producción experimental de anticuerpos monoclonales - Método original de Köler y Miltein (también ganaron el premio Novel) - Líneas mieloma que no expresen su propia IgG - Fusión de células por medio de polietilenglicol (PEG). Células del bazo con células de mieloma y da lugar a una célula hibrida llamada hibridoma, a partir de la cual se van a obtener los anticuerpos monoclonales. Se realiza in vitro. - Medios de cultivos selectivos: HAT (hipoxantina- aminopeptirina- timidina) - Medios de cultivo con factores de crecimiento - El ratón se inyecta con el antígeno, se le saca sangre para ver que produce los anticuerpos que nos interesa antes de pasar al siguiente paso. Se quitan las células del bazo y se unen con las células del mieloma que junto al polietilenglicol se forman células hibridas.

17 Se cultivan unas placas, en la placa se observa cuál de estos hibridomas esta secretando el anticuerpo, se selecciona y se obtienen grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. Se utiliza el medio HAT porque se quieren seleccionar las células para el cultivo (los hibridomas) y no las células del bazo. Si nos acordamos de las dos vías de biosíntesis de los ácidos nucléicos se tiene la vía principal y la vía de recuperación o salvamento. Se utiliza la hipoxanina, timidana y aminoadterina (la aminoadterina provoca que las células no produzcan los ácidos nucléicos por la vía principal). La vía de salvamento utiliza las bases púricas y pirimidínicas que vienen de la degradación de otros nucleótidos. Para esto se utiliza la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil_transferasa esto provoca y las células del bazo van a desaparecer porque no viven en medios de cultivo aunque contienen esta enzima y las células del mieloma desaparecen porque no tienen este anzima.

18 Las células hibridas que tienen ambas características van a poder prolifera. Después se selecciona el pocillo de los anticuerpos que se están produciendo y estos después se van a clonar obteniendo finalmente los anticuerpos monoclonales.

19 Ventajas e inconvenientes de los anticuerpos monoclonales - Ventajas: Inagotables ya que las células son inmortales y pueden seguir produciendolos Características constantes Contra distintos epitopos Purificados en grandes cantidades - Inconvenientes Muy costosos en tiempo y recursos Predominan las afinidades bajas (como se unen a un solo epitopo deben tener la suficiente fuerza de captarlo) Aplicaciones de los anticuerpos específicos - Métodos preparativos como cromatografía - Métodos analíticos: Cualitativoscomo si en el pocillo hay o no anticuerpos Cuantitativos es para medir la cantidad de hormona