Análisis de mezclas líquidas multicomponente mediante un espectrofotómetro IR y redes neuronales

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1 Análisis de mezclas líquidas multicomponente mediante un espectrofotómetro IR y redes neuronales Ingeniería Técnica Industrial en Electrónica Industrial. AUTOR: Diego Vargas Pando. DIRECTOR: Eduard Llobet Valero. Junio del 2007.

2 ÍNDICE GENERAL CAPÍTULOS PÁGINA ÍNDICE GENERAL OBJETIVOS Y CONTENIDO DEL PROYECTO ESPECTROSCOPIA EN EL INFRARROJO PRÓXIMO (NIR) INTRODUCCIÓN. EL ESPECTRO DE LA RADIACIÓN ESPECTROSCOPIA EN EL INFRARROJO ORIGEN DE LA ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN TIPOS DE MEDIDAS EN INFRARROJO INSTRUMENTACIÓN LOS ESPECTROFOTÓMETROS DISPERSIVOS LOS ESPECTROFOTÓMETROS NO DISPERSIVOS Funcionamiento del espectrofotómetro FT-NIR Interferómetro de Michelson DIFERENCIAS ENTRE DISPERSIVOS Y NO DISPERSIVOS ANÁLISIS EXPERIMENTAL MUESTRAS LÍQUIDAS ANALIZADAS Metanol P-xileno Ethane, 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoro-. Triclorotrifluoretano INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO Cubetas porta muestras Espectrofotómetro FT-NIR VERTEX TRABAJO REALIZADO EN EL LABORATORIO REDES NEURONALES MODELO BIOLÓGICO MODELO ARTIFICIAL FUNCIONES DE TRANSFERENCIA APRENDIZAJE DE UNA RED NEURONAL ARTIFICIAL TOPOLOGÍA DE UNA RED NEURONAL ARTIFICIAL PRINCIPALES TIPOS DE REDES NEURONALES ARTIFICIALES LA RED PERCEPTRON SIMPLE LA RED PERCEPTRON MULTICAPA LA RED BACKPROPAGATION ALGORITMO DE BACKPROPAGATION VENTAJAS DE UNA RED NEURONAL ELABORACIÓN DE LA RED NEURONAL ARQUITECTURA DE LA RED ELECCIÓN DE LOS ENTRENAMIENTOS DE LA RNA Entrenamiento A Entrenamiento B PREPARACIÓN DE LOS DATOS OBTENIDOS MÉTODO DE REDUCCIÓN DE VARIABLES (PCA)

3 Introducción sobre el método PCA Implementación del PCA Realización del PCA para el Entrenamiento A Realización del PCA para el Entrenamiento B CREACIÓN, ENTRENAMIENTO Y VALIDACIÓN DE LA RNA Entrenamiento y validación de la RNA con el Entrenamiento A Entrenamiento y validación de la RNA con el Entrenamiento B RESULTADOS OBTENIDOS Resultados del Entrenamiento A Análisis de los resultados del Entrenamiento A Resultados del Entrenamiento B Análisis de los resultados del Entrenamiento B ELECCIÓN DE UN TERCER ENTRENAMIENTO PCA para el Entrenamiento C Entrenamiento y validación de la RNA con el Entrenamiento C Resultados obtenidos del Entrenamiento C Análisis de los resultados del Entrenamiento C INTRODUCCIÓN SOBRE EL MÉTODO PLS Implementación del PLS Entrenamiento y validación de la RNA después de haber aplicado el PLS Resultados obtenidos con PLS Análisis de los resultados obtenidos con PLS Otra alternativa con el PLS Resultados obtenidos Análisis de los resultados obtenidos CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

4 Objetivos y contenido del proyecto 1. OBJETIVOS Y CONTENIDO DEL PROYECTO El principal objetivo del proyecto es el de analizar mezclas líquidas utilizando la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIR) y la realización de una red neuronal. La espectroscopia es una técnica analítica experimental, muy usada en química y en física. Esta basada en el estudio de los espectros de emisión o absorción de los materiales. Las redes neuronales artificiales (RNA) son modelos computacionales que tratan de replicar, de manera simplificada, el complejo funcionamiento del cerebro humano. La capacidad de aprendizaje de las RNA, a través de ensayos repetidos, las ha hecho muy populares en los últimos años en una amplia variedad de aplicaciones en todas las ciencias. En la actualidad las redes neuronales están resultando ser una herramienta fundamental ya que proponen una estrategia de resolución de problemas basada en la adaptación al entorno de información. A continuación enumeramos las actividades que se han ido siguiendo desde el inicio de la realización del proyecto: 1- Puesta a punto del sistema de medidas con el espectrofotómetro IR del DEEEA. Se utilizó un espectrofotómetro NIR de transformada de Fourier, el cual dispone de un interferómetro de Michelson para modular la información espectral. 2- Realización de las medidas experimentales. Se realizaron un total de 439 medidas de mezclas líquidas. Los compuestos utilizados, en distintas concentraciones, han sido: metanol, p-xileno y un disolvente llamado Ethane, 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoro (Triclorotrifluoretano). 3- Extracción de las características de los espectros IR. Los avances instrumentales, la automatización, y la incorporación de los ordenadores en el control y adquisición de señales de instrumentos, como el espectrofotómetro, nos permitieron obtener una gran cantidad de información analítica y extraer las características más relevantes de los espectros de las mezclas líquidas analizadas. 4- Análisis cuantitativo basado en redes neuronales. Se crea una RNA con el programa Matlab versión 6.5. La entrenamos de tres formas distintas y posteriormente, comprobamos, validamos y analizamos los resultados obtenidos.

5 Objetivos y contenido del proyecto El gran volumen de información que nos proporciona la espectroscopia NIR hace muy difícil el tratamiento de los datos obtenidos. Esta problemática ha propiciado que nos hayamos visto obligados a desarrollar métodos quimiométricos (PCA, PLS), basados en cálculos matemáticos, estadísticos y de lógica formal, que permiten diseñar o seleccionar procedimientos de medida óptimos y obtener la máxima información relevante de los datos analíticos. Con esto conseguiremos reducir al máximo la cantidad de información con la que partiremos a la hora de realizar el estudio y la predicción del resultado de la muestra a analizar. Por último, destacar que el espectro infrarrojo es una de las propiedades más características de un compuesto ya que no existen dos espectros iguales para dos compuestos diferentes, es como una huella dactilar. Esto facilitará el análisis y la predicción de los resultados obtenidos mediante nuestra red neuronal. 5

6 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) 2. ESPECTROSCOPIA EN EL INFRARROJO PRÓXIMO (NIR) 2.1. INTRODUCCIÓN. EL ESPECTRO DE LA RADIACIÓN En determinadas condiciones, los cuerpos emiten energía en forma de radiación. Hay distintos tipos de radiaciones. Todas ellas viajan a la velocidad de la luz (c = 3x10 8 m/s) pero se diferencian unas de otras en su frecuencia y longitud de onda. La frecuencia de una onda es el número de ciclos ondulatorios que pasan por un punto fijo en un segundo. Se representa por la letra griega υ y se mide generalmente en herzios. La longitud de onda es la distancia entre dos picos (o dos valles) cualquiera de la onda. Ésta, se representa por la letra griega λ (lambda) y, dependiendo del tipo de radiación, puede ser desde muy pequeña, como en el caso de la llamada radiación gamma, hasta muy grande en las ondas de radio. Se mide usando nanómetros (10-9 m) y Ángstroms (10-10 m). El rango completo de las longitudes de onda es lo que se denomina el espectro electromagnético. La longitud de onda y la frecuencia son inversamente proporcionales y se relacionan mediante la siguiente ecuación: (1) La principal emisión de radiación de los cuerpos es la electromagnética en forma de luz visible. La luz blanca se descompone en un espectro de diferentes bandas coloreadas, cada una definida por una longitud de onda distinta. Así, la luz de menor longitud de onda es la luz violeta, que es de alrededor de unos 4000 Ángstroms, y la luz de mayor longitud de onda es la luz roja, que es de alrededor de unos 7000 Ángstroms. Sin embargo, hay radiaciones de menor y también de mayor longitud de onda que las anteriormente citadas, es decir, inferior a 4000 Ángstroms y superior a los 7000 Ángstroms. Las radiaciones que van desde el violeta al rojo se dice que forman el espectro visible, pues procede de la descomposición de la luz blanca. Las radiaciones de longitud de onda inferior al violeta son las llamadas ultravioleta, rayos X, rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de onda. Las radiaciones de longitud de onda superiores al rojo son denominadas infrarrojos, microondas y ondas de radio, por orden creciente en la longitud de onda.

7 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) En la figura 1 se refleja el espectro de radiación y en la tabla 1 se muestra los intervalos de las longitudes de onda de los distintos tipos de radiación. Figura 1.Espectro de radiación Tabla 1. Intervalos de longitudes de onda y tipos de radiación. TIPO DE RADIACIÓN Rayos Gamma Rayos X Ultravioleta Espectro Visible Infrarrojo Región de Microondas Ondas de Radio Intervalos de las longitudes de onda Inferiores a 10-2 nanómetros Entre 10-2 nanómetros y 15 nanómetros Entre 15 nanómetros y nanómetros Entre nanómetros y 7, nanómetros Entre 7, nanómetros y 10 6 nanómetros Entre 10 6 nanómetros y nanómetros Mayores de nanómetros Como se aprecia, la zona de radiación infrarroja del espectro electromagnético, que en definitiva es la que nos interesa, está limitada por las regiones del espectro visible y del microondas ESPECTROSCOPIA EN EL INFRARROJO La palabra espectroscopia deriva de la raíz latina spectrum (apariencia, imagen) y de la palabra griega skopia (ver). La espectroscopia infrarroja, o IR, es una técnica analítica sumamente simple. Es un tipo de espectroscopia vibracional donde se analizan las vibraciones moleculares. 7

8 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Como se muestra en la tabla 2, la región infrarroja del espectro está comprendida aproximadamente entre las longitudes de onda de 700 nm a 10 6 nm. Observamos tres zonas distintas en esta región: infrarrojo próximo (NIR, Near Infrared), infrarrojo medio (MIR, Middle Infrared) e infrarrojo lejano (FIR, Far Infrared). Nuestro interés se centrará en la zona del infrarrojo próximo. Tabla 2. Zonas espectrales infrarrojas. DENOMINACIÓN INTERVALO λ (nm) INFRARROJO PRÓXIMO (NIR) INFRARROJO MEDIO (MIR) INFRARROJO LEJANO (FIR) La radiación en la zona del infrarrojo cercano fue descrita en los inicios del siglo XIX por William Hersche, aunque la aplicación de la espectroscopia NIR, en el ámbito de la química analítica, es reciente. De hecho, el primer registro fotográfico documentado de un espectro de líquidos orgánicos en la zona de 700 a 1200 nm tiene fecha de 1881 y fue realizado por Abney i Festing. Las características especiales de la amplia zona del infrarrojo, hizo que durante la primera mitad del siglo XX, los espectroscopistas se interesaran más por la zona media del espectro (MIR) a la hora de buscar aplicaciones analíticas, olvidándose de la zona del infrarrojo cercano. No fue hasta la década de los 50, cuando se empezaron a desarrollar las primeras aplicaciones analíticas en el infrarrojo cercano, como consecuencia de la aparición de los primeros espectrofotómetros comerciales. En la década de los 60 se produjo un fuerte impulso y aumentó considerablemente el interés por la espectroscopia NIR. En los años 70 se empezaron a introducir nuevos equipos con diseños mejorados y mayores prestaciones. De esta forma se construyen los primeros espectrofotómetros que permiten registrar espectros de forma rápida y altamente reproducibles. Los avances en la informática también ayudaron mucho a la expansión de la técnica, poniendo al alcance del usuario una capacidad de cálculo inexistente hasta el momento. Con el paso de los años, el número de aplicaciones NIR en los diferentes campos ha crecido considerablemente. Actualmente se pueden encontrar aplicaciones de está técnica en el análisis de alimentos, productos farmacéuticos, fibras textiles, derivados del petróleo, etc. 8

9 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) 2.3. ORIGEN DE LA ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN La espectroscopia de absorción en el infrarrojo tiene su origen en las vibraciones moleculares. Generalmente, se piensa que las moléculas son estructuras formadas por una red estática de núcleos atómicos unidos entre sí por enlaces electrónicos. Sin embargo, la realidad es muy diferente, y puede decirse que, cada átomo que la constituye está desplazándose permanentemente, uno con respecto al otro, sobre una distancia promedio llamada longitud de enlace. Para entenderlo mejor, imaginemos dos esferas, o masas, conectadas por medio de un resorte. Una vez puestas en movimiento, las esferas comenzarán a oscilar, o vibrar de aquí para allá a lo largo del resorte, a una cierta frecuencia que dependerá de las masas de las esferas y de la rigidez del resorte. Una esfera de masa pequeña se moverá con mayor facilidad que otra de masa mayor. Por lo tanto, las masas más pequeñas oscilan a mayor frecuencia que las masas más grandes. Un resorte sumamente rígido, es difícilmente deformable y rápidamente retorna a su forma original cuando se deja de aplicar la fuerza deformante. Por otro lado, un resorte débil se deforma fácilmente y tarda mucho tiempo en volver a su forma original. De ahí que un resorte más rígido oscilará a mayor frecuencia que uno débil. El enlace químico entre dos átomos puede ser considerado como un oscilador armónico simple. El enlace sería el resorte y los dos átomos o grupos de átomos conectados por el enlace, serían las masas. Cada átomo tiene una masa diferente y los enlaces simples, dobles o triples poseen distinta rigidez, por lo que cada combinación de átomos y enlaces posee su propia frecuencia armónica característica. La radiación electromagnética infrarroja tiene una energía que no es suficiente para producir transiciones electrónicas; sin embargo, su energía es similar a las pequeñas diferencias energéticas entre los distintos estados vibracionales y rotacionales existentes en la mayoría de las moléculas. Da la casualidad de que la luz infrarroja está en el mismo rango de frecuencia que la molécula en vibración. Y si irradiamos una molécula en vibración con luz infrarroja, absorberá aquellas frecuencias de la luz que sean exactamente iguales a las frecuencias de los distintos osciladores armónicos que constituyen dicha molécula. Cuando la luz es absorbida, los pequeños osciladores de la molécula seguirán vibrando a la misma frecuencia, pero dado que han absorbido la energía de la luz, tendrán una amplitud de vibración más grande. Esto significa que los "resortes" se estirarán más que antes de absorber la luz. La luz que no fue absorbida por ninguno de los osciladores de la molécula, es transmitida desde la muestra a un detector y una computadora la analizará y determinará las frecuencias que fueron absorbidas. Es decir, el espectro de infrarrojo de una molécula se obtiene como resultado de medir la intensidad de una radiación exterior absorbida, para cada longitud de onda, que hace posible la transición entre dos niveles de energía vibracional diferentes. Cada una de estas absorciones características de energía se corresponde con un movimiento 9

10 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) vibracional de los átomos en la molécula. Por lo tanto, analizando cuales son las longitudes de onda que absorbe una determinada sustancia en la zona del infrarrojo, podemos obtener información acerca de las moléculas que componen dicha sustancia. En moléculas sencillas es posible definir el tipo de vibraciones que tienen lugar entre los distintos átomos enlazados e identificar la radiación electromagnética que es absorbida para modificar su estado vibracional. En moléculas complejas esta posibilidad es más difícil tanto por el elevado número de vibraciones como por las interacciones entre los distintos centros vibracionales que se producen. Antes, sólo era posible obtener buena información irradiando la molécula con una sola frecuencia de luz IR por vez. Esto llevaba mucho tiempo porque existe una gran cantidad de frecuencias y debían realizarse muchos barridos para obtener un buen espectro. Pero ahora, como comentaremos posteriormente, gracias al sorprendente Algoritmo de la Transformada de Fourier, puede irradiarse una molécula con cada frecuencia de luz IR a la vez y obtener un espectro perfecto en poco tiempo. No todas las vibraciones fundamentales de una molécula dan bandas de absorción de radiación electromagnética en el espectro, para que esto ocurra han de cumplirse las siguientes condiciones: - Se debe presentar un cambio en el momento dipolar de la molécula durante la vibración, sólo en estas circunstancias el campo eléctrico de la radiación puede interaccionar con la molécula. - No deben coincidir en la misma frecuencia varias vibraciones fundamentales. - La banda debe ser suficientemente intensa. - La energía vibracional debe corresponder a una longitud de onda que esté dentro del intervalo de trabajo del instrumento TIPOS DE MEDIDAS EN INFRARROJO Cuando la radiación incide en la muestra (Figura 2), pueden producirse diferentes fenómenos: - Absorción. - Transmisión. - Reflexión. - Tranflectancia. 10

11 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Figura 2. Absorción, reflectancia, y transmitancia de la radiación. En la figura 3, observamos que la intensidad de luz transmitida a través de la muestra (PT) es menor que la intensidad incidente (P0). Una parte de esta intensidad incidente se ha reflejado (PR), mientras que otra parte ha sido absorbida por la sustancia (PA). Figura 3. Fenómenos de absorción, transmisión y reflexión de la radiación electromagnética al interaccionar con la materia. La medida más común en el infrarrojo es la que se basa en la absorción/transmisión aunque también se han desarrollado espectroscopias basadas en el fenómeno de la reflexión, como son la reflectancia total atenuada y la reflectancia difusa. Absorción / Transmisión El espectro por transmisión nos determina PA (figura 3), ya que la pérdida en la intensidad luminosa incidente está relacionada con la concentración de la muestra. 11

12 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) La transmitancia (T) se calcula como la fracción de radiación (PT/P0) transmitida a través de la muestra. La intensidad de absorción de la luz, absorbancia (A), se mide como: (2) La representación de la transmitancia o absorbancia como una función de la longitud de onda es lo que conforma el espectro de la muestra. La medida por transmisión utiliza una porción mayor de la muestra y esto provoca una mayor sensibilidad y homogeneidad espectral. Pero tiene como principal inconveniente que componentes muy sensibles a la radiación, puedan ser afectados por la gran cantidad de energía que la atraviesa. La Transmisión NIR, donde el detector está ubicado detrás de la muestra (figura 4), es ideal para líquidos transparentes y algunos productos que no son demasiado densos ópticamente. Reflexión Existe a menudo una mala interpretación del término Reflectancia NIR. Los rayos no son simplemente reflejados de la superficie externa, sino que realmente penetran la muestra. Cada vez que se halla que una unión química no absorbe una particular longitud de onda, los rayos son diseminados y reflejados en todas direcciones. Estos haces dispersos pueden entonces ser absorbidos o reflejados por otras uniones químicas, hasta que una porción de los rayos eventualmente salga de la muestra en todas direcciones (figura 4). La profundidad de penetración del haz dentro de la muestra no está determinada por la posición del detector, sino más bien por la potencia de la fuente de luz. Figura 4. Penetración de los rayos en el modo de transmisión y reflectancia. 12

13 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Tranflectancia Combinación de reflectancia y transmitancia. En este caso se mide la transmitancia después que la radiación haya atrevasado dos veces la muestra, la segunda después que un reflector colocado al lado de la muestra provoque que el haz de luz pase una segunda vez por la misma antes de llegar al detector INSTRUMENTACIÓN Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas. Al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en la ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación. El aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la radiación en sus componentes, se llama espectroscopio. Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama espectrógrafo, y si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro. Cuando consigue medir también la intensidad de la radiación, se llama espectrofotómetro. Por lo tanto, se puede definir el espectrofotómetro como aquel instrumento capaz de medir la radiación infrarroja absorbida por las moléculas, ocasionando una modificación en los niveles de energía vibracional, que le permite identificar grupos funcionales (átomos enlazados) en la molécula y la identificación de la misma. Los primeros espectrofotómetros comerciales NIR aparecieron en la década de los 50. El primero que se comercializó fue el Cary Model en el 1954 (fabricado por Applied Physics Corporation, Monrovia, California). Después de esta etapa inicial, se desarrollaron espectrofotómetros basados en diversas técnicas ópticas, introduciendo nuevos sistemas de selección de longitudes de onda y detección. Se consiguió registrar espectros de forma más rápida y fiable. Actualmente se utilizan dos tipos de instrumentos para obtener espectros de absorción en el infrarrojo: Los espectrofotómetros dispersivos y los no dispersivos LOS ESPECTROFOTÓMETROS DISPERSIVOS Los dispersivos generalmente utilizan como elemento dispersor de la luz, para el análisis de ésta, redes de difracción o prismas de refracción para generar la radiación monocromática. En espectrofotometría acostumbran a ser instrumentos de doble haz, los cuales son menos exigentes con las características de las fuentes y los detectores. 13

14 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Los tres componentes básicos que caracterizan a estos espectrofotómetros son: a) una fuente de radiación infrarroja, que suministra la iluminación incidente sobre la muestra que se estudia; b) un monocromador, que dispersa la energía radiante en sus muchas frecuencias y c) una serie de rendijas o aberturas, que seleccionan la banda estrecha de frecuencias que incide sobre el detector. Este último componente transforma la energía de la banda de frecuencias en una señal eléctrica que se amplifica lo suficiente para ser registrada. El detector es otro componente importante en la configuración de un espectrofotómetro IR. Mide la energía radiante residual que emerge de la muestra y la compara con aquella que proviene de la celda llamada blanco. Esta diferencia de energía se mide con una termocupla, que tiene la propiedad de traducir las diferencias de intensidad de la radiación que sale de la muestra en impulsos eléctricos. La señal amplificada se utiliza para mover un atenuador de peine en el haz de referencia. El peine reduce la cantidad de energía del haz de referencia hasta que se restablece el equilibrio energético entre la muestra y la referencia. Esto se conoce como método de anulación óptica. En este momento, el detector deja de emitir señales. La extensión de la compensación del haz de referencia necesario para equilibrar las energías de la muestra y de la referencia es una medida de la absorción de la muestra. Mediante un sistema de registro en movimiento sincronizado con el atenuador, puede medirse la absorción de la muestra. De forma esquemática, los componentes de este tipo de espectrofotómetros están representados en la figura 5: Figura 5. Componentes de un espectrofotómetro de infrarrojo de doble haz. La resolución del espectro dependerá de la calidad del monocromador entre otras variables, de la velocidad con la que se mueve la red y del detector. 14

15 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) LOS ESPECTROFOTÓMETROS NO DISPERSIVOS Con los espectrofotómetros de doble haz convencionales con monocromador es difícil acceder a la región del IR lejano, por eso los primeros espectrofotómetros de transformada de Fourier se diseñaron para esta región. Hoy en día, este método se ha extendido a aparatos que permiten barrer toda la región IR. Actualmente los espectrofotómetros FT IR han desplazado a los espectrofotómetros con monocromador. Éstos no poseen red de difracción o prismas, sino que utilizan un interferómetro que produce el fenómeno de la interferencia de la luz. En estos instrumentos la luz que proviene de la fuente llega a un interferómetro que será el encargado de generar el interferograma. El interferograma es el espectro de la muestra en el dominio del tiempo. La interpretación o resolución de éste se realiza matemáticamente, utilizando la transformación de Fourier, auxiliado con un computador. En este tipo de espectroscopia la señal obtenida es el resultado de la combinación de diferentes frecuencias. Esta combinación genera un resultado complejo ya que proviene de la superposición de ondas, las cuales están ligeramente desfasadas unas con otras. A continuación explicaremos el funcionamiento del espectrofotómetro por transformada de Fourier en el infrarrojo cercano, así como cada una de las partes que lo forman Funcionamiento del espectrofotómetro FT-NIR El haz producido por la fuente NIR (lámpara halógena con filamento de Tungsteno) pasa a través de una apertura y de un filtro óptico penetrando en el interferómetro. Cuando el haz de luz policromática entra en contacto con el interferómetro es modulado por un escáner (espejo móvil). Es a partir de aquí cuando se conduce el haz de luz hacia la muestra, donde será transmitido o reflejado, y donde finalmente llegará al detector. Cada detector contiene un preamplificador o un amplificador programable de ganancia. Por lo tanto, la señal de salida de este preamplificador (interferograma) será enviada al amplificador principal, donde la señal será amplificada, filtrada y digitalizada. Esta señal digital se enviará posteriormente a un sistema de registro y procesado de datos, en el que se realizarán los procesos matemáticos necesarios para convertir el interferograma en un espectro. En la figura 6 se muestra un esquema con los componentes principales de un espectrofotómetro de transformada de Fourier. 15

16 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Figura 6. Esquema de un espectrofotómetro de transformada de Fourier. Existen dos tipos de interferómetros muy populares: el de Michelson y el de prismas. En el apartado siguiente describiremos detalladamente el de Michelson ya que es éste el que se ha utilizado en la parte experimental de nuestro proyecto Interferómetro de Michelson El interferómetro sustituye al tradicional monocromador. Es la parte esencial del espectrofotómetro, pues es el encargado de modular cada frecuencia del infrarrojo con el fin de realizar la transformada de Fourier. Como observamos en la figura 7, el interferómetro consta de un espejo fijo, un espejo móvil y un espejo divisor de haces: Figura 7. Esquema de un interferómetro de Michelson El divisor de haces, llamado beam splitter, delgado y con una película semireflectora (generalmente de germanio) divide la luz colimada de la fuente en dos haces aproximadamente iguales. 16

17 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Estos haces se reflejan en dos espejos internos, uno fijo y otro móvil de velocidad perfectamente conocida. La diferencia de distancias recorridas por los haces a los espejos fijos y móvil recibe el nombre de retardos. El primero de los dos haces se transmite al espejo móvil, mientras que el segundo es reflejado hacia el espejo fijo. La parte del haz transmitida, se refleja en el espejo móvil, retornando hacía el separador de haz (beamsplitter), donde de nuevo, parte del haz será transmitido de vuelta hacia la fuente emisora NIR, mientras que la otra parte es reflejada hacia la muestra (a esta parte del haz la llamaremos TR). La parte del haz que ha sido reflejada, se refleja en el espejo fijo y retorna hacia el beamsplitter, donde se dividirá en dos partes: una retorna hacia la fuente emisora NIR, mientras la otra parte se transmite hacia la muestra (a esta otra parte del haz la llamaremos RT). Por lo tanto, tendremos en la salida del interferómetro, dos haces que se dirigen hacia la muestra de una forma combinada (TR+RT). La recombinación de los dos haces con un desfase entre ellos provoca interferencias constructivas y destructivas que se reflejan en la potencia radiante que recibe el detector. Cuando se representa la potencia radiante en función del retardo, se dispone del interferograma. Cuando el espejo móvil y fijo, esta equidistante con el beamsplitter (esto significa retardo óptico cero), los dos haces se encuentran perfectamente en fase después de la recombinación que se produce al incidir ambos nuevamente en el beamsplitter. En este punto, los haces interfieren de una manera constructiva, siendo la intensidad del haz incidente en el detector, la suma de las intensidades de los dos haces que pasan a través de los dos espejos. La transformación de Fourier se usa como método matemático para el desarrollo en serie de la curva obtenida (interferograma). La transformada de Fourier del interferograma es el espectro ordinario obtenido por aparatos convencionales IR. Las ventajas de los espectrofotómetros FT IR son básicamente dos: - Mejorar la resolución de los espectros. - Obtener mayor sensibilidad. La mejora de sensibilidad es consecuencia de una mayor energía de flujo del haz de luz hasta llegar al detector y de la mejora de la relación señal/ruido por promediación de interferogramas. Es tan notable el avance de sensibilidad, que en el momento en que tecnológicamente los interferómetros de Michelson fueron precisos y asequibles económicamente, prácticamente todos los espectrofotómetros comerciales pasaron a ser FT IR. En el siguiente apartado comentaremos más ampliamente las ventajas de estos espectrofotómetros. 17

18 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) DIFERENCIAS ENTRE DISPERSIVOS Y NO DISPERSIVOS Existen claras diferencias entre los dos equipos. Los espectrofotómetros con transformada de Fourier es un equipo más moderno que el espectrofotómetro dispersivo y presenta una serie de ventajas como las que se citan seguidamente: 1.- Simplicidad mecánica: sólo existe un componente en movimiento (el espejo móvil). 2.- Elevada sensibilidad y velocidad. Todas las frecuencias se miden simultáneamente. Un espectro completo se puede obtener en un espacio de tiempo muy corto, pudiéndose tomar muchos barridos para realizar promedios y reducir el ruido. 3.- Mayor flujo de energía. 4.- Utiliza un láser como referencia interna. La calibración en frecuencias del interferómetro es muy precisa y estable al utilizar un láser de He-Ne. Los sistemas basados en este láser presentan una elevada exactitud y precisión en la selección de onda (inferior a 0.01cm -1 en el intervalo entre 4800 y 400cm -1 ). Esto hace posible el promediado de espectros con el consecuente incremento de la relación señal-ruido. Los efectos debidos a las radiaciones parásitas son minimizados al tratarse de una señal modulada. 5.- Elimina la luz difusa. Debido a cómo el interferómetro modula cada frecuencia, no hay equivalente en un FT IR a la luz difusa en los sistemas dispersivos. 6.- Resolución constante a todas las frecuencias. 7.- Ausencia de discontinuidades en el espectro, al no haber cambios de red de difracción. 18

19 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) 2.6. ANÁLISIS EXPERIMENTAL MUESTRAS LÍQUIDAS ANALIZADAS Después de esta breve introducción sobre la espectroscopia, y antes de ponernos a explicar el trabajo realizado en el laboratorio, comentaremos cuales han sido los compuestos, los materiales y los instrumentos utilizados para la realización de nuestro proyecto, que consistía en el análisis de mezclas líquidas mediante la espectroscopia NIR y la elaboración de una red neuronal. En primer lugar, destacaremos y expondremos las principales propiedades de los compuestos utilizados y analizados en el laboratorio. Se eligieron para las distintas pruebas experimentales tres componentes distintos: metanol, p-xileno, y un disolvente llamado Ethane, 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoro-. Estos tres componentes han sido elegidos por varios motivos, entre los que destacamos los siguientes: - Por sus características y propiedades. Metanol y p-xileno no reaccionan entre sí. - Por su disponibilidad en el laboratorio. - Por que tanto el metanol como el p-xileno disponen de bandas de absorción en la zona del infrarrojo cercano. - Por que el disolvente no dañaba a ninguno de los materiales de la celda portadora de muestras y era transparente a la radiación, es decir, no se darán picos de absorción para ninguna longitud de onda del infrarrojo. - Por que no suponen un riesgo excesivo para la persona que trabaja con ellos. A continuación presentamos brevemente las propiedades más destacables de estos tres compuestos Metanol Propiedades y características El metanol, también llamado alcohol metílico, alcohol de madera, carbinol y alcohol de quemar, es el primero de los alcoholes. Su fórmula química es CH 3 OH. La estructura química del metanol es muy similar a la del agua, con la diferencia de que el ángulo del enlace C-O-H en el metanol (108.9 ) es un poco mayor que en el agua (104.5 ), porque el grupo metilo es mucho mayor que un átomo de hidrógeno. Figuras 8 y 9. 19

20 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Figura 8.Metanol Figura 9. Agua En condiciones normales es un líquido incoloro, de escasa viscosidad y de olor y sabor frutal penetrante, miscible en agua y con la mayoría de los solventes orgánicos. Es tóxico e inflamable. Es considerado como un producto petroquímico básico, a partir del cual se obtienen varios productos secundarios. Las propiedades físicas más relevantes del metanol, en condiciones normales de presión y temperatura, se listan en la tabla 3. Tabla 3. Propiedades físicas del metanol. Peso Molecular 32 g/mol Densidad 0.79 Kg./l Punto de fusión -97 C Punto de ebullición 65 C De los puntos de ebullición y de fusión se deduce que el metanol es un líquido volátil a temperatura y presión atmosféricas. Tienen propiedades semejantes al agua debido a que ambos tienen grupos hidroxilo que pueden formar puente de hidrógeno. El metanol forma puente de hidrógeno con el agua y por lo tanto es miscible (soluble en todas las proporciones) en este solvente. El metanol es considerado como un producto o material inflamable de primera categoría; ya que puede emitir vapores que mezclados en proporciones adecuadas con el aire, originan mezclas combustibles. Es un combustible con un gran poder calorífico, que arde con llama incolora o transparente y cuyo punto de inflamación es de 12,2 ºC. 20

21 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) P-xileno Propiedades y características Es el nombre de los dimetilbencenos. La fórmula química del p-xileno es C 6 H 4 (CH 3 ) 2 /C 8 H 10 Según la posición relativa de los grupos metilo en el anillo de benceno se diferencia entre orto, meta, y para xileno tal y como se muestra en la figura 10. p-xileno m-xileno o-xileno Figura 10. Diferencia entre los tres grupos de xileno. Los xilenos se encuentran en el los gases de coque, en los gases obtenidos en la destilación seca de la madera (de allí su nombre - xilon = griego para madera) y en algunos petróleos. Los xilenos son buenos disolventes y se usan como tales. Además forman parte de muchas formulaciones de combustibles de gasolina. Son nocivos. Sus vapores pueden provocar dolor de cabeza, náuseas y malestar general. Se trata de líquidos incoloros e inflamables. Las propiedades físicas más relevantes del p-xileno, en condiciones normales de presión y temperatura, se listan en la tabla 4. Tabla 4. Propiedades físicas del p-xileno. Densidad relativa 0.86 Kg/l Punto de fusión 13 C. Punto de ebullición 138 C. Solubilidad en agua Ninguna Punto de inflamación 27 C 21

22 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Ethane, 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoro-. Triclorotrifluoretano La fórmula química del triclorotrifluoretano es C 2 Cl 3 F 3 y su peso molecular es de g/mol. Su estructura química la podemos observar en la figura 11: Figura 11. Estructura del C 2 Cl 3 F INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO Cubetas porta muestras Se pueden analizar compuestos en estado sólido, líquido y gaseoso. El recipiente de la muestra será distinto según se presente la misma y ha de estar construido de un material transparente a la radiación. Presentamos solamente los recipientes para muestras líquidas, ya que son los que utilizamos en la realización del proyecto. Como se observa en la figura 12, las células que empleamos en el laboratorio y en las que depositábamos las mezclas líquidas, son rectangulares y montadas sobre marcos metálicos. Se han utilizado las células Omni-Cell de la casa Specac. Figura 12. Porta muestras utilizado en el laboratorio. 22

23 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Este porta muestras es desmontable y con espaciadores de teflón que permiten variar la longitud del camino óptico (figura 13). Figura 13.Celda desmontable de infrarrojo para muestras líquidas. Debido a la tendencia del disolvente a absorber radiación las celdas son estrechas (0,1-1 mm) y la concentración de la muestra fluctúa entre 0,1 y 10 %. La ventana por la que pasa la radiación es generalmente de NaCl Espectrofotómetro FT-NIR VERTEX 70 El modelo del espectrofotómetro FT-NIR utilizado en el laboratorio y con el que se han hecho las distintas pruebas experimentales es el VERTEX 70. Principales características: El VERTEX 70 es un espectrómetro versátil para aplicaciones exigentes en laboratorios analíticos y de investigación. Las dimensiones del espectrofotómetro son de 84cm x 65cm x 30cm y su peso aproximado es de 70kg (figura 14). Figura 14. Vertex 70 23

24 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Este espectrofotómetro contiene distintos compartimientos: - Compartimiento electrónico. - Compartimiento del detector. - Compartimiento del interferómetro. - Compartimiento de la fuente de luz. - Compartimiento de control de las direcciones del haz de luz. - Compartimiento de la muestra. El vertex 70 presenta las siguientes características: - Un láser de HeNe. - Un detector con un preamplificador integrado que convertirá la señal analógica en señal digital. - Rango estándar de a 370cm -1 con posibilidad de expansión a IR lejano y cercano ( cm -1 ). - Resolución estándar de 0,5 cm -1 con opción para 0,2 cm velocidades de barrido del espejo móvil (hasta 12 opcionalmente). - "Rapid-scan" estándar hasta 40 espectros/s a 8 cm -1 de resolución. - El diseño único de los puertos permite hasta cuatro puertos de entrada o salida de haz para una máxima versatilidad experimental. - El equipo incluye una electrónica muy mejorada y conexión ethernet con el PC de control. - Toda la óptica está recubierta por oro para un aprovechamiento máximo de la señal TRABAJO REALIZADO EN EL LABORATORIO Una vez se ha explicado cuáles han sido los compuestos y la instrumentación empleada en el análisis de las muestras líquidas, pasaremos a comentar el trabajo que se ha ido efectuando en el laboratorio, desde la preparación del espectrofotómetro hasta la obtención de la información espectral necesaria. En primer lugar, realizamos la puesta a punto del instrumento, controlando dos variables importantes del aparato a través del software de control OPUS for QA/QC del espectrofotómetro Vertex 70: - La apertura del hueco por donde pasa el haz de luz procedente de la fuente emisora IR. - La frecuencia o la velocidad del escáner (espejo móvil). Para ello, se ha realizado una gran cantidad de medidas de transmitancia de los diferentes compuestos, con distintas concentraciones de metanol, p-xileno y disolvente, probando y controlando distintos valores de la apertura del haz y de la frecuencia (velocidad del espejo móvil). Seguidamente, se han analizado los resultados obtenidos, con el fin de poder extraer conclusiones y elegir los valores del espectrofotómetro (apertura y frecuencia) que nos han proporcionado unos mejores resultados, es decir una buena relación señal-ruido. 24

25 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Es muy importante elegir correctamente los valores de estas variables, ya que en caso contrario, cuando posteriormente se hagan las distintas pruebas experimentales, la calidad de la información espectral obtenida puede ser alterada y proporcionarnos resultados saturados: - Cuando la apertura es demasiado grande, se producen efectos negativos a causa de la saturación percibida en el detector. A éste le llega mayor intensidad lumínica de la que puede recibir. Ocasionando un grave problema que se debe rectificar ajustando correctamente la apertura del hueco por donde pasa el haz de luz IR. - Para obtener espectros con rapidez y abarcar un amplio abanico de frecuencias, se debe ajustar la frecuencia del movimiento del espejo móvil del espectrofotómetro. Aumentando el valor de la frecuencia del escáner disminuimos el tiempo de ejecución de los espectros. La resolución de los espectros es inversamente proporcional a la frecuencia del escáner asignado. Una vez se ha comentado la importancia del control de estas dos variables, pasamos a explicar el procedimiento que hemos seguido para la elección de los valores de apertura y de frecuencia: 1- Se empezó analizando los resultados obtenidos al introducir solamente disolvente en la cela portadora de líquidos y realizar distintas medidas probando con diferentes valores de frecuencia y de apertura. A continuación, en la tabla 5, resumimos las primeras medidas experimentales efectuadas con el disolvente. Tabla 5. Medidas efectuadas con el disolvente. VELOCIDAD APERTURA (mm) ESCANER (Khz) No No - Las casillas de la tabla que han sido marcadas con una X y no están coloreadas representan las medidas efectuadas experimentalmente en las que hemos obtenido resultados satisfactorios. - Las casillas marcadas con una X y coloreadas de azul representan aquellas medidas en las que se obtuvieron resultados con zonas del espectro saturados. - Las casillas en las que aparece la palabra No representan aquellas medidas que no se hicieron por que no se creyó ni oportuno ni interesante realizarlas. Seguidamente, mostramos dos ejemplos de los espectros obtenidos en el análisis del disolvente. El primero de ellos no presenta los efectos de la saturación y utiliza como valores de velocidad del escáner y de apertura, 2,5 Khz y 2,5 mm respectivamente (figura 15). En el segundo espectro si que se observa la saturación y para este caso, se 25

26 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) han empleado como valores de velocidad del escáner y de apertura, 1,6 Khz y 3 mm respectivamente (figura 16). Figura 15. Espectro de transmitancia del disolvente sin los efectos de la saturación. Figura 16. Espectro de transmitancia del disolvente con los efectos de la saturación. 26

27 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) 2- Después se siguió experimentando al introducir una mezcla, en la cela portadora de líquidos, de disolvente con un 10% de metanol. Se probó con distintos valores de frecuencia y de apertura y se analizó el aspecto de los espectros obtenidos. Las medidas experimentales que se realizaron se presentan en la tabla 6. Tabla 6. Mezcla de disolvente con un 10% de Metanol. VELOCIDAD APERTURA (mm) ESCANER (Khz) No No 2.5 No No No - Las casillas de la tabla que han sido marcadas con una X y no están coloreadas representan las medidas efectuadas experimentalmente en las que hemos obtenido resultados satisfactorios. - Las casillas marcadas con una X y coloreadas de azul representan aquellas medidas en las que se obtuvieron resultados con zonas del espectro saturados. - Las casillas en las que aparece la palabra No representan aquellas medidas que no se hicieron por que no se creyó ni oportuno ni interesante realizarlas. A continuación, mostramos dos de los espectros obtenidos con la mezcla anterior. En la figura 17 se ha utilizado como valor de velocidad del escáner 2,5 Khz y como apertura 2,5mm y en la figura 18 la velocidad del escáner fue 2,5Khz y la apertura 3mm. En esta figura 18 observamos los efectos de la saturación. Figura 17. Espectro de transmitancia (10% de metanol) sin efectos de saturación. 27

28 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Figura 18. Espectro de transmitancia (10% de metanol) con efectos de saturación. 3- Seguimos probando y esta vez tomamos muestras de una mezcla que contiene disolvente y un 10% de p-xileno. Como en anteriores ocasiones, experimentamos con diferentes valores de frecuencia y de apertura y observamos los resultados o espectros conseguidos. Las medidas que se realizaron se pueden observar en la tabla 7. Tabla 7. Mezcla de disolvente con un 10% de p-xileno. VELOCIDAD APERTURA (mm) ESCANER (Khz) No No 2.5 No No - Las casillas de la tabla que han sido marcadas con una X y no están coloreadas de azul representan las medidas efectuadas experimentalmente en las que hemos obtenido resultados satisfactorios. - Las casillas marcadas con una X y coloreadas de azul representan aquellas medidas en las que se obtuvieron resultados con zonas del espectro saturados. - Las casillas en las que aparece la palabra No representan aquellas medidas que no se hicieron por que no se creyó ni oportuno ni interesante realizarlas. También mostramos a continuación un par de ejemplos de los resultados conseguidos. En la figura 19 observamos el espectro de transmitancia obtenido al utilizar unos valores de velocidad del escáner de 2,5 Khz y de apertura 2,5 mm y en la figura 20 se emplean unos valores de velocidad del escáner y de apertura de 1,6 Khz y 2,5 mm respectivamente. En el segundo espectro observamos los efectos de la saturación. 28

29 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Figura 19. Espectro de transmitancia (10% de p-xileno) sin los efectos de saturación. Figura 20. Espectro de transmitancia (10% de p-xileno) con efectos de saturación. 29

30 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) Una vez realizadas todas estas medidas, nos vimos capacitados para poder decidir cuales debían ser los valores a utilizar para la apertura y la frecuencia del espectrofotómetro: - Apertura: 2.5 mm. - Velocidad del escáner: 2.5 Khz. Utilizando estos valores, en las distintas pruebas efectuadas, nunca obtuvimos resultados saturados, y por eso hemos decidido trabajar y realizar todas las medidas posteriores con ellos. Si el espectrofotómetro FT IR del laboratorio fuera óptimamente ideal y no existieran efectos de saturación se escogería como valores de apertura y velocidad, 6mm y 1.6Khz respectivamente. Pero como no es ideal, se deben elegir valores lo más cercano posible a éstos. Intentando que la apertura por donde pasa el haz sea lo mayor posible, y la velocidad del escáner sea la más baja posible. A partir de aquí, se analizaron en el laboratorio un total de 439 muestras, con distintas concentraciones de p-xileno y metanol, con el fin de poder disponer de una gran cantidad de información que nos permitiera entrenar posteriormente con garantías a la red neuronal. El total de mezclas realizadas, utilizando los diversos compuestos, combinados en distintas concentraciones, se observan en la tabla 8. Tabla 8. Mezclas efectuadas. METANOL (%) P-XILENO (%) No 10 No - Las casillas marcadas con una X y coloreadas de amarillo representan las mezclas efectuadas en el laboratorio. - La casilla marcada de rojo representa el 0% de p-xileno y 0% de metanol. Se trata de disolvente 100% y esta concentración ya fue utilizada anteriormente para la elección de la apertura del haz de luz y la frecuencia del escáner. Estas medidas no se incluyen en el total de las 439 muestras citadas anteriormente. - Las casillas coloreadas de verde, que una representa el 0% de p-xileno, 10% de metanol y 90% de disolvente y la otra el 10% de p-xileno, 0% de metanol y 90% de disolvente, también se utilizaron anteriormente para la determinación de la apertura y de la frecuencia y por este motivo no están incluidas en el cómputo de las 439 muestras. - Las casillas en las que aparece la palabra No y coloreadas de azul, representan aquellas mezclas que no se llegaron a efectuar, ya que se creyó que las medidas realizadas eran suficientes. 30

31 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) El número de muestras que se tomaron para cada una de las mezclas efectuadas se detallan a continuación en la tabla 9. Tabla 9. Muestras realizadas para las distintas mezclas. P-XILENO (%) METANOL (%) Número de muestras Una vez conseguidos los espectros de las 439 muestras, nuestro trabajo en el laboratorio finalizó. En la figura 21 se recoge el aspecto de los 439 espectros obtenidos. Figura 21. Espectros de las 439 muestras. 31

32 Espectroscopia en el infrarrojo próximo (NIR) El siguiente objetivo del proyecto era planificar y desarrollar la red neuronal que trabajara con la información adquirida en el laboratorio. Pero antes de pasar directamente a la realización de esta red, he creído oportuno hacer una pequeña introducción sobre el mundo de las redes neuronales. 32