III.5. El espectrómetro de RMN de alta resolución.
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- Josefa Olivares Soriano
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1 III.5. El espectrómetro de RMN de alta resolución. Se suele considerar hasta cuatro generaciones de espectrómetros, habiendo aparecido la primera generación en los años , instrumentos conocidos hoy como espectrómetros de onda continua. En estos instrumentos la excitación de la muestra se realizaba mediante una señal de radiofrecuencia (40-60 MHz) mantenida en el tiempo con amplitud constante, y para excitar núcleos con diferentes desplazamientos químicos se variaba la frecuencia de esta señal o el campo magnético principal. Desde esta primera hasta la actual generación se han introducido muchas mejoras tales como aumentar la homogeneidad y estabilidad del campo, automatización de controles, etc., pero la más importante ha sido, sin lugar a dudas, el desarrollo de la modalidad de transformada de Fourier que hizo posible la implementación de las técnicas multidimensionales actuales. Los modernos espectrómetros digitales (cuarta generación) utilizan pulsos de radio frecuencia para excitar simultáneamente a todas las transiciones entre estados de espín posibles en un intervalo de frecuencias dado. La respuesta del sistema, la atenuación libre de la inducción FID (Free Induction Decay), es una señal registrada en el dominio de la variable tiempo. Como consecuencia para obtener el espectro, señal en el dominio de la frecuencia, es necesario procesar la FID mediante la Transformación de Fourier (FT). Por esta razón a los actuales instrumentos se les llama comúnmente espectrómetros FT-RMN. En la Figura III.5.1 se muestra un diagrama de bloques de un espectrómetro moderno. El tubo de muestra, representado por S en el diagrama de bloques, contiene una disolución de las moléculas bajo estudio. Este tubo se aloja en el interior de la sonda que, conteniendo las bobinas de excitación/detección (D) y opcionalmente las de generación de gradiente de campo magnético (G), se sitúa en el eje central del imán superconductor (M) representado por el bloque superior de la Figura III
2 G S Sc Sh D P Amplificador gradiente Amplificador de RF Fuente para bobinas Shim Programador de pulsos de Gradiente Detector Sensible a la fase Amplificador de RF Programador de pulsos Digitalizador Fuente de RF Ordenador Y Periféricos Figura III.5.1: Diagrama de bloques de un espectrómetro FT-RMN. M: Iman, que contiene los siguientes dispositivos: sonda P, tubo de muestra S, Bobina para detección/excitación D, bobinas para generación de gradiente de campo G, bobinas shim para homogeneizar el campo magnético Sh y solenoide superconductor para la creación del campo magnético principal Sc. 142
3 A continuación comentamos someramente las características mas relevantes de cada componente del instrumento. Imán superconductor. Es el componente básico del espectrómetro. La intensidad, la homogeneidad y la estabilidad del campo magnético que genera, determinan la sensibilidad y resolución máxima accesibles en el espectro RMN. Como se muestra en el esquema de la Figura III.5.2, consiste esencialmente en un vaso dewar de grandes dimensiones lleno de N 2 líquido (77.4 K), DE, que contiene en su interior otro vaso dewar lleno de helio liquido (4.2 K), DI, el cual, a su vez, contiene un electroimán en el que el solenoide es una bobina superconductora de aleación niobio-titanio, SC. Como el hilo semiconductor tiene una resistencia eléctrica DE DI N 2 (l) infinitesimalmente pequeña una vez establecida una corriente eléctrica en corto circuito permanece constante durante años de operación. A lo largo del eje del imán He(l) V D existe un cilindro hueco con un diámetro estándar de 52 mm (otros: 89 y 150 mm) en SC cuya parte inferior se inserta la sonda de muestra, P, que contiene la bobina de detección/excitación, D, y otros dispositivos que comentaremos posteriormente. El tubo P de muestra, insertado en una pieza ( spinner ) de cerámica o teflón u otros polímeros diseñada para rotar alrededor del eje del campo magnético, se introduce por la parte superior del cilindro (flecha). Figura III.5.2: Esquema de un imán súper-conductor. DE: dewar externo; DI: dewar interno; N 2 (l) y He(l): nitrógeno y helio líquido; V: vacío (10-6 mbar); D: bobina para detección/excitación; SC: solenoide de hilo superconductor de niobio-titanio; P: sonda. 143
4 I II Figura III.5.3. I: Aspecto general de un imán súper-conductor de un espectrómetro de 300 MHz y disposición transversal de las diferentes partes concéntricas que lo forman. II: Aspecto general de un imán de Oxford Instruments de 900 MHz. 144
5 Figura III.5.4: Imán súper-conductor de un espectrómetro real parcialmente seccionado. 145
6 Bobinas para homogeneizar el campo. Son conocidas como bobinas de homogeneización o de shim, diseñadas para hacer el campo magnético principal homogéneo. y pueden ser de dos tipos según se encuentren sumergidas dentro de helio líquido ( crioshims, que corrigen grandes inhomogeneidades), o estén a temperatura ambiente. Estas últimas están situadas sobre un tubo cilíndrico que rodea a la sonda propiamente dicha y cada una produce correcciones del campo en determinadas direcciones del espacio. Por ellas circulan una cierta intensidad de corriente continúa que crea un campo magnético adicional que se superpone al campo principal. Estas corrientes se ajustan para cada muestra de forma que la señal de resonancia del circuito de estabilización ( lock ) tenga intensidad máxima, situación que corresponde a un campo magnético lo más homogéneo posible. El número de bobinas de shim varía entre 15 ó 20 y están agrupadas en dos tipos, según produzcan correcciones al campo principal simétricas respecto al eje z [Z, Z 2, Z 3, Z 4, Z 5, Z 6 ] o asimétricas [X, Y], [XY, X 2 -Y 2 ], [X 3, Y 3, ZX 3, ZY 3 ], [ZX, ZY, Z 2 X, Z 2 Y, Z 3 X, Z 3 Y], [ZXY, Z(X 2 -Y 2 ), Z 2 XY, Z 2 (X 2 -Y 2 )]. Sonda de muestra. La sonda de muestra, P, es la parte del espectrómetro donde se sitúa el tubo de muestra insertado en un rotor propulsado por una corriente de aire ( spinner ) y contiene los siguientes dispositivos: la bobina de radio frecuencia para excitar y detectar la señal de respuesta de la muestra, las bobinas del sistema de estabilización del campo ( lock ), sensores de temperatura y bobinas de gradiente de campo. El propósito de la rotación del tubo de muestra, que opcionalmente se realiza en algunos experimentos, es promediar el campo que experimenta cada núcleo disminuyendo así el efecto ensanchador de las bandas espectrales producido por la falta de homogeneidad del campo en la muestra. sample tube spinner Fig III.5.5: Sonda y muestra 146
7 La Bobina de Radiofrecuencia: La bobina de RF están diseñadas para actuar como transmisor del campo B r 1 y como receptor de la energía de RF emitida por la muestra. La bobina de RF debe resonar a la frecuencia de Larmor de los núcleos bajo estudio; para ello la bobina consta del elemento inductor y un juego de componentes capacitivos. La frecuencia de resonancia de la bobina está determinada por la inductancia (L) y la capacitancia (C) del circuito completo: 1 ν = 2π LC Cuando las muestras se insertan en la sonda la conductividad y la constante dieléctrica del medio cambia, modificándose esta frecuencia de resonancia. Si ésta difiere de la frecuencia de resonancia de los núcleos disminuirá la eficacia como transmisor del campo de excitación y receptor de la señal de respuesta, obteniéndose consecuentemente una pobre relación señal/ruido. Por consiguiente la bobina ha de ser sintonizada para cada muestra específica, lo cual es posible modificando algunos componentes capacitivos que para tal fin son ajustables. Fig III.5.6: Bobina de Radio Frecuencia para transmisión del campo B r 1 y detección de la magnetización transversal. Bobinas del sistema de estabilización del campo ( lock ): Son bobinas utilizadas por el canal o subsistema de estabilización del campo que, funcionando como un espectrómetro independiente, tiene como misión mantener estable la relación campo/frecuencia. El canal de estabilización está sintonizado a la frecuencia de resonancia del deuterio y mide de forma continua con estas bobinas dicha frecuencia. La señal de deuterio proviene del disolvente usado para preparar las muestras. Cualquier alteración del campo magnético principal, debida tanto a inestabilidades propias como a perturbaciones electromagnéticas externas, se reflejará como un cambio de la frecuencia del deuterio y este cambio actúa como señal de error del sistema de control que, excepto para perturbaciones intensas muy rápidas, mantendrá constante de forma eficaz el valor del campo magnético principal. La existencia de este canal de estabilización y el origen común 147
8 (una única fuente de radiofrecuencias) de todas las radiofrecuencias en un espectrómetro, hace posible alcanzar la reproducibilidad requerida en los espectros de RMN. Bobinas de Gradiente de Campo: Opcionalmente la sonda puede contener las bobinas de gradiente de campo destinadas, como su propio nombre indica, a crear gradientes en el campo magnético principal en las direciones de los ejes X,Y,Z. La creación de dichos gradientes es necesaria para utilizar la RMN mejorada por gradientes, medidas de difusión y microscopía RMN. Los espectrómetros equipados con los dispositivos necesarios para estos fines incluyen un programador de pulsos de gradiente y el amplificador correspondiente. Detección y adquisición de datos. En los espectrómetros digitales avanzados, entre la señal que la bobina de RF recibe y la construción del espectro final media una serie de tratamientos de la señal y operaciones no triviales y de vital importancia. Lo primero que debemos considerar es que la señales emitidas por las muestras pueden considerarse compuestas de una onda portadora de frecuencia relativamente alta (centenas de MHz) que se encuentra modulada por el desplazamiento químico, de forma que todas las señales diferirán sólo en un estrecho intervalo de frecuencia (pocos miles de khz). Por otra parte las señales, analógicas en su origen, han de ser digitalizadas, es decir convertidas en datos binarios que pueda almacenar y operar el ordenador; esta tarea la realiza un dispositivo electrónico llamado conversor analógico/digital, ADC. Digitalizar señales de frecuencias en la región de MHz presenta problemas técnicos que complican considerablemente la implementación de un ADC con las características adecuadas, por lo que se recurre a un proceso de detección. Entendemos por tal al proceso de mezclar la señal emitida por la muestra, previamente amplificada, con una señal de referencia de frecuencia similar, ω 0, extraída de la fuente de RF, de forma que resulte en una señal en la que cada componente traslada su frecuencia a un valor proporcional a la diferencia de frecuencias ω i ω0. Esta operación de detección la realiza un circuito mezclador conocido como detector sensible a la fase. El ADC requerido ahora debe cubrir un rango de frecuencia de solo centenares de khz, debiendose, en todo caso, respetar el teorema del muestreo que nos impone una frecuencia de muestreo doble de la mayor frecuencia que contenga la señal a digitalizar. 148
9 Un paso más en la mejora de la sensibilidad y de gran importancia en RMN bidimensional es la detección en cuadratura. La bobina única de RF sólo detecta una componente de la magnetización en el plano XY, sea M X, lo que nos proporciona el valor absoluto δ = ω ω, pero hace indistinguible si la frecuencia detectada es mayor o i 0 menor que la de referencia; así sometida a la transformación de Fourier cada componente produciría dos picos de frecuencias ω 0 δ y ω 0 + δ y no podríamos distinguir cuál es el caso. Soluciones como excitar en un extremo del intervalo espectral deseado o utilizar dos bobinas de RF conllevan un empobrecimiento de la relación señal/ruido (al duplicar la anchura espectral añadimos ruido) y/o dificultades técnicas. La solución adoptada es la detección en cuadratura esquematizada en la Figura III.5.7.A; se utilizan dos detectores sensibles a la fase cuyas entradas se conectan a la señal amplificada de la bobina RF; la frecuencia de referencia se mezcla directamente con la señal en uno de ellos, mientras que en el otro la referencia se desfasa 90º antes de mezclarse. Las salidas de cada detector se digitalizan en conversores independientes y se almacenan separadamente en el ordenador. Combinando las componentes detectadas por ambos canales, como parte real y parte imaginaria, y haciendo uso de las propiedades de la transformada de Fourier se obtienen las dos componentes de la magnetización en el plano XY, y como consecuencia se resuelve la incertidumbre planteada. Podemos así excitar en el centro de la ventana espectral ajustada al intervalo adecuado evitando incluir ruido y, consecuentemente, mejorando la relación señal/ruido. Una implementación alternativa de la detección en cuadratura que encontramos en la mayoría de los espectrómetros y que se aplica en RMN bidimensional, es el método conocido como Redfield, en el cual la fase del receptor se incrementa 90º después de la adquisición de cada punto en el proceso de digitalización. De forma aparente este aumento de fase se traduce en una señal de mayor frecuencia. Si la anchura espectral es F el intervalo espectral abarca desde F/2 hasta F/2 y tendremos que digitalizar a una frecuencia 2F, pero un desplazamiento de 90º (1/4 de ciclo) aumenta la frecuencia aparentemente en F/2; como consecuencia el intervalo espectral abarca ahora desde 0 hasta F y el problema de las frecuencias negativas desaparece. Este procedimiento suele llamarse TPPI ( Time Proportional Phase Increment ). En la Figura III.5.7.B se muestra un esquema de una configuración adoptada en algunos instrumentos en la que se usan dos detectores y un solo ADC, conmutando entre los dos detectores se obtiene el 149
10 desplazamiento de fase de 90º y multiplicando por 1 antes de almacenar los puntos de 0º y 90º, se obtienen los desplazamientos defase 180º y 270º. A Detector sensible a la fase ADC1 Referencia Mem A Señal Cambiador de fase, 90º Mem B Detector sensible a la fase ADC2 B Detector sensible a la fase Referencia Señal Cambiador de fase, 90º ADC Mem Detector sensible a la fase Figura III.5.7: A. Detección en cuadratura. B. Una posible implementación del esquema Redfield (TPPI) para la detección en cuadratura. 150
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