CUANTIFICACIÓN DE ADENOSIN DESAMINASA (ADA)

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1 CUANTIFICACIÓN DE ADENOSIN DESAMINASA (ADA) PROTOCOLO ADA FUNDAMENTO DEL METODO: La adenosindesaminasa (ADA) es una enzima del catabolismo de las purinas que cataliza la conversión de la adenosina en inosina liberando amoníaco en el proceso. Se distribuye en todo el organismo, principalmente en el tejido linfoide y aumenta según el grado de diferenciación de los linfocitos, es por eso que en los derrames serosos de etiología tuberculosa la actividad de la ADA se encuentra elevada. Definición de 1 unidad de ADA: 1 unidad de ADA corresponde a 3 mmoles de amonio, liberada en la mezcla de la reacción incubada a 37 C por una hora. 1U ADA mmol amonio 50U mmol. Técnica colorimétrica de Guisti para cuantificación de ADA. El fundamento de la reacción consiste en incubar el líquido pleural problema con una solución de adenosina, luego de 60 minutos de incubación se hace reaccionar el amoníaco formado con el hipoclorito sódico y el fenol en medio alcalino para formar indofenol compuesto de color azul cuya densidad óptica se mide a 628nm. El catalizador de la reacción es el nitroprusiato sódico. Una solución de fenol nitroprusiato es utilizada para detener la reacción que cataliza el ADA (método de Berthelot modificado). ADENOSINA + AGUA ADA INOSINA + AMONIACO AMONIACO + OCL - + FENOL OH INDOFENOL Na2[Fe(CN)5NO] MUESTRA El líquido debe ser límpido, transportado lo más pronto posible al laboratorio. Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm, para la determinación enzimática usar el sobrenadante. Si no se va a realizar la determinación de la enzima ese mismo día conservarlo entre 2 y 8 º C. 1

2 NO congelar el líquido sin centrifugar, ya que los leucocitos poseen ADA, que una vez liberada en el líquido por congelación y descongelación pueden producir resultados falsamente altos. No deben procesarse muestras hemolizadas, turbias u opalescentes.es posible centrifugar las muestras y si se obtiene sobrenadante límpido puede procesarse, si continúa turbio el sobrenadante no debe realizarse la cuantificación de ADA. MATERIALES tubos de 15 ml tubos de 50 ml balanza de precisión espectrofotómetro digital pipeta automática 25 ul pipeta automática 500 ul 3 pipetas de 1, 2 y 10 ml punteros 25ul y 500 ul matraces probetas agua destilada 200ml buffer fosfato 1x standard de reacción adenosina nitroprusiato de sodio (Reactivo A) hipoclorito alcalino (Reactivo B) pescadera marcador reloj o timer 2

3 PREPARACION DE REACTIVOS Estos reactivos se pueden preparar y guardar BUFFER FOSFATO 50 Nm PH 6.5 PO 4 H 2 Na. 2 H 2 O ,365 g PO 4 H Na H 2 O ,810 g H 2 O DESTILADA ml Autoclavar 120 C 15 minutos Prepara 5 x (100 ml de agua) para conservar mejor. Guardar en heladera. SOLUCION STANDARD DE SULFATO DE AMONIO 15mM (madre) SO 4 (NH4) ,982 g H 2 O DESTILADA ml Estable en heladera por 2 años. SOLUCION DE TRABAJO DE SULFATO DE AMONIO (STANDARD DE REACCIÓN) SO 4 (NH4) 2 0,075 Nm (0,15 Nm) = 50 UI 0,5 ml de la solución madre en 100 ml de buffer fosfato 1 X Estable en heladera por 2 meses. Reactivos que se preparan en el momento de procesar las muestras SOLUCIÓN DE ADENOSINA Preparar en el momento, la cantidad necesaria de acuerdo al número de muestras que va a procesar. Pese la cantidad de adenosina indicada, en un tubo coloque la cantidad de buffer necesario y agregue la adenosina. Homogeinize bien, ponerla unos minutos en el baño de agua a 37ºC para que la disolución sea completa. 3

4 Nro. De muestras ADENOSINA mg Buffer fosfato ml PROCEDIMIENTO Usar siempre tubos nuevos y procesar cada muestra por duplicado Rotular los tubos blanco de reactivo (BR), standard (STD), blanco de adenosina (BA), muestra 1 (M1), muestra 1 duplicado (M1d), blanco de muestra 1 (BM1), M2, M2d, BM2, etc. Agregar a los tubos M y Md 500 ul de la solución de adenosina, luego agregar 25 ul de muestra y ponerlos en el baño de agua a 37º C durante 60 minutos. Buffer fosfato 1x Solución de adenosina Standard reactivo Standard adenosina muestra 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Muestra 0.5 ml 0.5 ml Muestra 25 ul 25 ul Prender el espectrofotómetro para estabilizar el equipo. REACTIVOS DE UREA COLOR (nitroprusiato de sodio, hipoclorito de sodio ) 4

5 Prepare la solución A y B del reactivo colorimétrico de urea (método ureasa) diluídos al 1/5, 1 parte de reactivo A de Urea color 2 R concentrado + 4 partes de agua destilada y 1 parte de reactivo B de Urea color 2 R + 4 partes de agua destilada. Retire los tubos del baño y agregue para Interrumpir la reacción a cada tubo 500 ul de la solución de reactivo A y 500 ul de la solución de reactivo B. SoluciónA nitroprusiato de sodio Solución B hipoclorito alcalino reactivo Standard adenosina muestra Muestra 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Homogeneizar y poner los tubos en el baño de agua a37º C durante 10 minutos, Medir la absorbancia de todos los tubos a 628 nm de longitud de onda. Es conveniente medir la absorbancia en el siguiente orden: blanco de adenosina, blanco de reactivo, standard, blanco de control negativo, control negativo, blanco de control positivo, control positivo y luego las muestras. CÁLCULOS B = DO blanco adenosina DO blanco reactivo C = DO stdandard DO blanco reactivo Actividad ADA (U/l a 37 C) = (A B) / C X 50 Realizar los cálculos con la absorbancia de la muestra y también con la absorbancia del duplicado. Se acepta un coeficiente de variación de hasta un 7 % entre la muestra y su duplicado expresado en U/l. 5

6 En el caso que la absorbancia de alguna muestra exceda el rango de linealidad al cuantificarla con el espectrofotómetro, repetir la determinación diluyendo la muestra 1:2 en buffer. RESULTADOS ESPERADOS adenosina: 0,015-0,035 reactivo: 0,020-0,040 Standard: 0,450-0,520 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS TIPO DE MUESTRA Líquido Pleural Líquido Pericárdico Líquido peritoneal LCR PUNTO DE CORTE Positivo>40 UI/l Positivo>40 UI/l Positivo>40 UI/l Positivo >9,6UI/l Informe de los resultados : Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal < 40 UI/l: Negativo Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal > 40 UI /l Positivo. Entrecruzamiento con otras patologías linfomas, mesoteliomas.etc Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal > 70 UI /l Positivo.Altamente sugestivo de etiología tuberculosa. Liquido cefálorraquídeo > 9, 6 UI/l Positivo Liquido cefálorraquídeo < 9, 6 UI/l Negativo CONTROLES DE LA TÉCNICA CONTROL POSITIVO: Se usan muestras de: un líquido pleural con un resultado mayor de 70 U/l de ADA, un líquido pleural con un resultado mayor de 40 U/l de ADA. Alicuotarlo en tubos eppendorf, mantenerlos congelados a 20 ºC y el día antes de su uso guardarlos en heladera entre 2 8 C. CONTROL NEGATIVO: usar un líquido que haya dado menor a 20 U/l de ADA 6

7 Identificarlos como control CP y CN, es conveniente también agregar el valor en unidades de ADA de cada control para saber si el coeficiente de variación está dentro del rango aceptable. CALIBRACIÓN DE LA TÉCNICA A partir de una concentración conocida se realizan diluciones para obtener: Tubo UI/l 10 ml de buffer fosfato ul sol madre. Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 75 UI/l 37,5 UI/l UI/l 9.3 UI/l 4.6 UI/l Rotular los tubos, colocar en el tubo 1: 10 ml de buffer fosfato ul sol madre. Homogeneizar bien. Colocar en el resto de los tubos 5 ml de buffer fosfato y realizar diluciones al ½ a partir del primer tubo. Transferir 5 ml del tubo 1 al 2, homogenizar, y así sucesivamente hasta el tubo 6 y descartar 5 ml finales. De cada tubo extraer 500ul, poner en un tubo rotulado 1,2...6 y poner en baño de agua a 37ºC durante 1 hora. Agregar a cada tubo 500 ul de reactivo A y 500 ul de reactivo B (diluídos al 1/5 con agua destilada, preparado en el momento) Incubar a 37ºC durante 10 minutos. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a 628nm y luego se grafica DO y UI/l para ver la linealidad de la técnica y corroborar que la DO de Standard de reacción corresponda a 50 U/l de ADA. Graficar los resultados, densidad óptica en función de unidades de ADA. 7

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