Antioxidant capacity of araza (Eugenia stipitata Mc Vaugh) during the ripening

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1 Fio A. Cuellr 1, Edn Ariz 1, Cecili Anzol 1, trici Restrepo 1, * 1 Deprtmento de Químic, Fcultd de Ciencis, Universidd Ncionl de Colomi, sede Bogotá, Crr. 30 No , Bogotá D.C., Colomi. * Autor pr correspondenci: lprestrepos@unl.edu.co. Reciido: 28 de myo de 2013 Aceptdo: 27 de junio de 2013 Revist Colomin de Químic Cpcidd ntioxidnte del rzá (Eugeni stipitt c ugh) durnte l mdurción Resumen Antioxidnt cpcity of rz (Eugeni stipitt c ugh) during the ripening Astrct Cpcidde ntioxidnte de rcá-oi (Eugeni stipitt c ugh) durnte mturção Resumo Químic Aplicd y Anlític El rzá es un fruto mzónico con uen cpcidd ntioxidnte, como otrs fruts de l región. A prtir del epicrpio y mesocrpio de l frut, en cutro estdos de mdurez (verde, pintón, mduro y soremduro), se relizó l extrcción de compuestos fenólicos utilizndo como solvente un mezcl gu:metnol (inicil 50:50; posterior 70:30); pr su nálisis se recurrió l método colorimétrico de Folin-Cioclteu. Dichos compuestos se identificron prcilmente medinte HLC en fse revers con rreglo de diodos, encontrndo los ácidos clorogénico, gálico y cféico como fenoles myoritrios responsles de l ctividd ntioxidnte. El myor contenido de polifenoles en el mesocrpio fue en el estdo verde (1200 mg/1000 g fruto BH), seguido del mduro (1100 mg/1000 g fruto BH), pintón (905 mg/1000 g fruto BH) y soremduro (550 mg/1000 g fruto BH), mientrs que en el epicrpio fue myor en los estdos mduro (170 mg/1000 g fruto BH) y verde (295 mg/1000 g fruto BH), seguidos del pintón (100 mg/1000 g fruto BH) y soremduro (50 mg/1000 g fruto BH). L cpcidd ntioxidnte se determinó usndo métodos hidrofílicos (ABTS, DH y FRA), encontrndo que en el mesocrpio l cpcidd ntioxidnte, medid por todos los métodos, fue myor en estdo verde, seguid por los estdos mduro, pintón y soremduro; en el epicrpio fue myor en los estdos mduro y verde, seguid por pintón y soremduro. L cpcidd The rz is fruit ntive of the Amzon region, like other fruits of this region hs some ntioxidnt components. It ws crried out the clssifiction of the fruits of rz in four different stges (green, pinton, mture, over-mture) using s the index of mturity, then phenolic compounds were extrcted using mixtures of solvents (methnol:wter, 50:50 initil, 70:30 finl) nd its content ws determined y the spectrophotometric method Folin-Cioclteu in the epicrp nd mesocrp. Additionlly, prtilly identified phenolic compounds y reversed phse HLC with diode rry, finding the phenolic cids such s chlorogenic, gllic nd cffeic, such s phenols responsile for the mjority of rz ntioxidnt ctivity. It ws noted tht rz mesocrp polyphenol content ws higher in the green (1200 mg/1000 g BH fruit) stge followed y mture (1200 mg/1000 g BH fruit), pinton (905 mg/1000 g BH fruit) nd over-mture (550 mg/1000 g BH fruit), while the epicrp ws greter in stges mture (170 mg/1000 g BH fruit) nd green (295 mg/1000 g BH fruit) followed y over-mture (50 mg/1000g BH fruit) nd pinton (100 mg/1000g BH fruit) stges. The ntioxidnt cpcity ws determined y three hydrophilic methods (ABTS, DH nd FRA) in the mesocrp found tht the ntioxidnt cpcity ws higher in the green stte followed y mture, pinton nd over mture, while the epicrp ws higher in mture, green, pinton nd over-mture stte. We lso determined the ntioxidnt cpcity y lipophilic method (β-crotene O rçá-oi é um fruto originário d região mzônic que, como outros frutos dest região, possui lguns componentes com cpcidde ntioxidnte que são de grnde interesse pr súde dos seres humnos pel su cpcidde de diminuir os efeitos de rdicis livres, produzidos durnte o metolismo norml d célul. Neste trlho foi relizd clssificção dos frutos de rçá-oi em qutro estádios diferentes, utilizndo como critério o índice de mturção; posteriormente, prtir do epicrpo e mesocrpo d frut nos qutro estádios de mturção (verde, pintdo, mduro e soremduro) form extrídos os compostos fenólicos utilizndo misturs de solventes (metnol, águ, 50:50) e foi determindo o seu conteúdo medinte o método espectrofotométrico de Folin-Cioclteu. Além disso, prcilmente identificdos compostos fenólicos por HLC de fse revers com mtriz de diodos, encontrndo os ácidos fenólicos, tis como clorogênico, gálico e cfeico, tis como fenóis responsáveis pel miori ds Arz ctividde ntioxidnte. Foi oservdo que no mesocrpo do rçá-oi o conteúdo de polifenois é mior no estádio verde (1200 mg/1000 g fruto BH) seguido dos estdos mduro (1100 mg /1000 g fruto BH), pintdo (905 mg/1000g fruto BH) e soremduro (550 mg/1000 g fruto BH) enqunto que no epicrpo é mior nos estádios mduro (170 mg/1000 g fruto BH) e verde (295 mg/1000 g fruto BH) seguido dos estádios pintdo (100 mg/1000 g fruto BH) e soremduro (50 mg/1000 g fruto BH). A cpcidde Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 21

2 Cuellr, F. A.; Ariz, E.; Anzol, C.; Restrepo,. ntioxidnte tmién se evluó por un método lipofílico (decolorción del β-croteno) hllndo que en el mesocrpio fue myor en los estdos mduro (110 mg/1000 g fruto BH) y pintón (90 mg/1000 g fruto BH) seguido del soremduro (75mg/1000 g fruto BH) y verde (26 mg/1000 g fruto BH) y en el epicrpio es myor en soremduro (50 mg/1000 g fruto BH) seguido del verde (45 mg/1000 g fruto BH), mduro (55 mg/1000 g fruto BH) y pintón (25 mg/1000 g fruto BH). Se concluye que el fruto de rzá, en los estdos verde y mduro, present l myor cpcidd ntioxidnte, siendo los ácidos fenólicos, presentes en el mesocrpio y epicrpio, los principles responsles. leching) found tht in the mesocrp ws higher in stges followed y mture (110 mg/1000 g BH fruit), pinton (90 mg/1000 g BH fruit) nd green (26 mg/1000 g BH fruit) while in the epicrp ws higher in the over-mture stge (50 mg/1000 g BH fruit) followed y greeen sttes (45 mg/1000 g BH fruit), mture (55 mg/1000 g BH fruit) nd sore mture (25 mg/1000 g BH fruit). It ws concluded tht the mture nd green stges hd the highest ntioxidnt cpcity; phenolic compounds eing present in the epicrp nd mesocrp were the mjor contriutors. ntioxidnte foi determind por três métodos hidrofílicos (ABTS, DH y FRA) e foi encontrdo que no mesocrpo cpcidde ntioxidnte é mior no estádio verde seguido dos estádios mduro, pintdo e soremduro enqunto que no epicrpo é mior nos estádios mduro e verde seguido dos estádios pintdo e soremduro. Tmém se determinou cpcidde ntioxidnte por um método lipofílico (descolorção do β-croteno) e foi encontrdo que no mesocrpo é mior nos estádios mduro (110 mg/1000 g fruto BH) e pintdo (90 mg/1000 g fruto BH) seguido dos estádios soremduro (75 mg/1000 g fruto BH) e pintdo (26 mg/1000 g fruto BH) e no epicrpo é mior no estádio soremduro (50 mg/1000 g fruto BH) seguido dos estádios verde (45 mg/1000 g fruto BH), mduro (55 mg/1000 g fruto BH) e pinton (25 mg/1000 g fruto BH). Finlmente se conclui que o fruto de rçá-oi nos estádios verde e mduro present mior cpcidde ntioxidnte, sendo os compostos fenólicos os principis contriuintes. lrs clve: Arzá, cpcidd ntioxidnte, ABTS, DH, FRA, decolorción del β-croteno, mdurez. Keywords: Arz, ntioxidnt cpcity, ABTS, DH, FRA, β-crotene leching, ripening. lvrs-chve: Arçá-oi, cpcidde ntioxidnte, ABTS, DH, FRA, descolorção do β-croteno, mturção. Introducción Como prte norml del metolismo ls céluls producen compuestos con electrones lires conocidos como rdicles lires. Estos son muy rectivos y, cundo no se controln, pueden cusr dño oxidtivo ls moléculs de l célul (proteíns, ácidos nucléicos, entre otros), lo que origin un impcto negtivo sore el metolismo celulr. El exceso de rdicles lires puede llevr estrés oxidtivo que es responsle de enfermeddes como Alzheimer, cáncer, teroesclerosis, entre otrs. Los compuestos que pueden trpr los rdicles lires, neutrlizndo su efecto sore l célul se conocen como ntioxidntes ; son moléculs cpces de retrdr o prevenir l oxidción de otrs moléculs evitndo l formción de un exceso de rdicles lires y, por tnto, evitndo los efectos de éstos en l célul. El estudio de los compuestos con cpcidd ntioxidnte que provienen de fruts y verdurs es de grn interés deido que son compuestos de origen nturl y que no representn riesgos pr l slud, y que lgunos ntioxidntes sintéticos pueden presentr efectos secundrios que no son deseles. edir l cpcidd ntioxidnte de un fruto permite determinr qué tn útil puede ser pr l slud humn y los efectos positivos puede portr en l prevención de enfermeddes cusds por el estrés oxidtivo (1). El rzá (Eugeni stipitt c ugh) es un fruto originrio de l región mzónic occidentl, cultivdo en píses como Brsil, erú, Ecudor, Bolivi y Colomi. L producción en Colomi se concentr en ls regiones cálids y húmeds, especilmente en el sur, donde los principles productores están en los deprtmentos de Guvire, Cquetá y, en menor proporción, utumyo. En l ctulidd existen lrededor de 1200 hectáres cultivds con estos frutles mzónicos y su explotción están vinculds muchs fmilis de l región (2, 3). El fruto de rzá se proyect dí trs dí como un fctor productivo que optimiz el perfil socioeconómico de l región mzónic occidentl; sus crcterístics orgnoléptics lo hcen petecile y sus componentes nutricionles prometen un eneficio pr l slud de ls persons que lo consumn dentro de su diet regulr (4). Grzón et l. (2012) encontrron que l pulp de rzá es un fuente importnte de vitmin C y compuestos fenólicos; por tnto l frut puede tener un excelente potencil ntioxidnte. Sin emrgo, no hy estudios sore l identidd químic de estos compuestos fenólicos en rzá (5). El ojetivo de este estudio fue determinr l cpcidd ntioxidnte e identificr los principles fenoles del epicrpio y mesocrpio del rzá en cutro etps de mdurez, con el fin de conocer cuál prte del fruto y en cuál estdo de mdurción se expres l myor cción ntioxidnte y el mejor eneficio de su consumo. teriles y métodos Clsificción y procesmiento de los frutos Los frutos fueron otenidos de lguns centrles de stos de l ciudd de Bogotá D.C. y fueron clsificdos en cutro estdos de mdurez (verde, pintón, mduro y soremduro) como criterios de selección se utilizron inicilmente el color y l prienci de los frutos. Después de desinfectdos con solución de hipoclorito de sodio (0,01%), se procedió l seprción mnul del epicrpio y el mesocrpio, en cd uno de los estdos de mdurez, pr posteriormente someterlos un proceso de liofilizción con el fin de mntener ls propieddes de cd estdo estudido; ello por cunto el rzá, por ser un fruto climtérico, lcnz rápidmente l mdurez fisiológic, dificultndo el estudio del fruto sin ser procesdo. Sore los liofilizdos otenidos se determinó directmente el índice de mdurez en los cutro estdos, midiendo l cntidd de sólidos so- 22 Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 22

3 Estudio de l cpcidd ntioxidnte del rzá (Eugeni stipitt c ugh) durnte l mdurción lules totles y l cidez titulle (6, 7). Ests mediciones se relizron por triplicdo. A prtir de ls prtes de los frutos liofilizdos, se relizron extrcciones utilizndo mezcls de solventes en un equipo Lcomco ; pr ello se pesron 1000 g de rzá liofilizdo en un tuo Flcon y se dicionron 20,0 ml de un mezcl metnol:gu (50:50), gitndo fuertemente en vórtex 50 ºC durnte 30 min. osteriormente, se centrifugó 5000 rpm durnte 20 min recogiendo el sorendnte y lmcenándolo 5 ºC en l oscuridd; sore el residuo se relizron dos extrcciones sucesivs dicionndo en cd un 10,0 ml de un mezcl ceton:gu (70:30), gitndo en vórtex durnte 30 min 50 ºC y centrifugndo 5000 rpm durnte 20 min. Finlmente, se reunieron los tres sorendntes otenidos y se lmcenron 15 ºC en l oscuridd. r cd estdo de mdurez se relizron tres extrcciones, siendo estos extrctos ls muestrs que se sometieron nálisis posteriores (8). Cuntificción de compuestos fenólicos lires r l cuntificción de los compuestos fenólicos lires se utilizó el método espectrofotométrico (espectrofotómetro Genesis ) de Folin-Cioclteu. En un tuo Flcon de 15 ml se dicionron 1500 µl del rectivo de Folin-Cioclteu diluido l 10% con gu desionizd y 200 µl de soluciones de compuestos ntioxidntes (ptrón de ácido gálico de diferentes concentrciones y extrctos de muestrs diluidos 20 veces), incundo tempertur miente por 5 min. Luego se dicionron 1500 µl de un solución de cronto de sodio (N 2 CO 3 ) l 6% en gu desionizd y se gitó fuertemente en vórtex. L mezcl se dejó en reposo durnte 90 min tempertur miente en l oscuridd y se midió l sornci 765 nm. Tods ls medids fueron relizds por triplicdo (9). Cuntificción de l cpcidd ntioxidnte totl L cpcidd ntioxidnte del fruto de rzá se determinó medinte los métodos ABTS [2,2 -zino-is-(3-etilenzotizolin-ácido-6-sulfónico)], DH (2,2-difenil-2-picrilhidrzilo), FRA (Ferric Reducing Antioxidnt ower) y decolorción del β-croteno (10). étodo ABTS Se prepró un solución de ABTS [2,2 -zino-is-(3-etilenzotizolinácido-6-sulfónico] 7,0 m y de persulfto de potsio (K 2 S 2 O 8 ) 2,5 m en gu desionizd y se dejó en gitción en 4 ºC en l oscuridd durnte 16 hors pr generr el ctión rdicl ABTS +. Luego l solución se diluyó cuiddosmente con metnol hst otener un sornci de 0, nm siendo est l solución de trjo (ST1). En un tuo Flcon se dicionron 2000 µl de ST1 y se incuron por 5 min 30 ºC; luego se dicionron 20 µl de ls soluciones de compuestos ntioxidntes (extrctos de muestrs diluidos 12,5 veces en metnol), gitndo en vórtex y se incuron 30 ºC, tomndo medids de sornci 734 nm cd 5 min durnte un hor hst sornci constnte. r l curv de clirción se tomron 2000 µl de ST1, se incuron por 5 min 30 ºC; continución se dicionron 20 µl de solución de Trolox (6-hidroxi- 2,5,7,8-ácido tetrmetilcromn-2-croxílico, que es un nálogo hidrosolule de l vitmin E) en metnol de diferentes concentrciones, gitndo en vórtex; se incuron por 6 min 30 ºC y se midió l sornci 734 nm. Tods ls medids se relizron por triplicdo (11). étodo DH Se prepró un solución de DH 0,1 m en metnol y se justó l sornci en nm usndo metnol (ST2). En un tuo Flcon se dicionron 1950 µl de l solución de trjo (ST2) y se incuó por 7 min tempertur miente tomndo l medid de sornci inicil 515 nm. Luego, se dicionron 50 µl de cd extrcto otenido Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), (diluido 5 veces en metnol), se mezcló en vórtex, se incuó tempertur miente y se tomron medids de sornci 515 nm cd 5 min durnte 2 hors. r l curv de clirción se tomron 1950 µl de ST2, se incuron por 7 min y se midió l sornci inicil 515 nm; luego se dicionron 50 µl de l solución de Trolox en diferentes concentrciones, se mezcló en vórtex y se incuó por 7 min tempertur miente; finlmente se midió l sornci 515 nm. Tods ls medids se relizron por triplicdo (12). étodo FRA Inicilmente se prepró el rectivo de FRA mezclndo 5,0 ml de un solución de TTZ (tripiridil-s-trizin) 10 m en ácido clorhídrico (HCl) 40 m con 5,0 ml de cloruro férrico (FeCl 3 ) 20 m en gu. Al otener un colorción zul de l mezcl se dicionron 50,0 ml de uffer cetto 300 m (ph = 3,6). En un tuo Flcon se dicionron 2700 µl del rectivo de FRA y se incuron 37 ºC por 4 min., luego se dicionron 270 µl de gu desionizd y 90 µl de los extrctos diluidos 10 veces en metnol o gu, dependiendo de l curv de clirción usd. Se relizron dos curvs de clirción utilizndo en un Trolox y en otr sulfto de hierro(ii) hepthidrtdo (FeSO 4.7H 2 O). Se tomron 2700 µl del rectivo de FRA y se incuron por 4 min 37 ºC, luego se dicionron 270 µl de gu desionizd y 90 µl de ls soluciones de Trolox o de FeSO 4.7H 2 O de diferentes concentrciones; se mezcló en vórtex incundo por 4 min 37 ºC y se midió l sornci 593 nm. Tods ls medids se relizron por triplicdo (13). Decolorción del β-croteno En este método se mide l cpcidd ntioxidnte lipofílic; por tnto, es necesrio relizr un extrcción diferente l de los métodos nteriores. r esto se pesron 0,100 g de rzá liofilizdo (epicrpio o mesocrpio) en un tuo Flcon, se gregron 4,00 ml de ceton y se gitó el tuo en vórtex; luego se centrifugó 5000 rpm por 15 min y se repitió este proceso tres veces sore el residuo con 2,00 ml de ceton. Los sorendntes otenidos se reunieron y se lmcenron 15 ºC en l oscuridd (1). En tuos Flcon se gregron 500 µl de un solución de β-croteno de concentrción 0,4 mg/ml preprd en cloroformo; luego se dicionron 20 µl de ácido linoléico, 200 µl de Tween 20 y 200 µl de solución ptrón de Trolox o de ls muestrs, según el cso. Se gitó fuertemente en vórtex y se dicionron 50 ml de gu sturd con oxígeno; se repitió l gitción y se sometió el contenido del tuo ultrsonido por 10 min. Luego se incuó 50 ºC con gitción constnte y cd 10 min se llevó ultrsonido por 2 min; se tomron medids de sornci 470 nm, repitiendo este procedimiento durnte dos hors. Tods ls medids se relizron por triplicdo. Después de otener ls medids plnteds nteriormente se relizó un prue F en ANOA pr compror si existí lgun diferenci significtiv entre ls medis de cd grupo de dtos y, por medio de un prue de rngos múltiples, se determinron quells medis que presentn diferencis estdísticmente significtivs uns de otrs con un nivel de confinz del 95%. Identificción prcil de los compuestos fenólicos por HLC Extrcción r este nálisis se pesron 200 mg de muestr (epicrpio o mesocrpio, liofilizdo) en un tuo plástico cónico, se dicionron 2 ml de un solución de metnol ciduldo (80:19:1, metnol:gu:hcl), se gitó tempertur miente en vórtex durnte 1 min y luego se sonicó durnte 1 h 40 C. Se centrifugó 6000 rpm por 15 min. El sorendnte otenido se filtró trvés de memrns DF de 13 mm de diámetro y 0,22 µm de tmño de poro y se inyectó en el cromtógrfo pr identificr y cuntificr los compuestos fenólicos. 23 RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 23

4 Tl 1. Grdiente de elución de fenoles en HLC de fse revers. Cuellr, F. A.; Ariz, E.; Anzol, C.; Restrepo,. Resultdos y discusión Tl 2. Tiempo (min) (% )Agu mq ph 2,5 (%) ACN Identificción prcil por HLC en fse revers-rreglo de diodos El método pr el nálisis cromtográfico de compuestos fenólicos se desrrolló en un cromtógrfo líquido Agilent Technologies 1260 con om cuternri de presión máxim de 600 res, inyector utomático estándr 1260 Infinity pr viles de 2 ml y volumen de inyección de 5 µl. L seprción de fenoles se otuvo en un column Agilent Zorx AAA (150 x 4,6 mm, 5µm) en comprtimiento termosttizdo 1260 Infinity y detector de rreglo de diodos (DAD) 1260 Infinity. El grdiente empledo se descrie en l Tl 1. Ls demás condiciones cromtográfics se oservn en l Tl 2. Tnto el método de extrcción, como el de nálisis de fenoles por HLC, se pusieron punto pr este trjo. L identificción y cuntificción de los compuestos fenólicos se relizó usndo ptrones de ácidos cféico, clorogénico y gálico medinte comprción del tiempo de retención de los ptrones y ls longitudes de ond de máxim sorción (λ 1, λ 2 y λ 3 ) de los espectros U-IS. L cuntificción se otuvo medinte interpolción en curvs de clirción relizds con los ptrones ( mg/ml). Análisis de dtos Condiciones cromtográfics de om y DAD pr el nálisis de fenoles en HLC de fse revers. étodo Flujo T column Fenoles 1 ml/min 35 C Longitud de ond (nm) l 1 = 324 l 2 = 280 l 3 = 220 Se empleó el promedio como medid de centrlizción. r evlur ls diferencis específics entre los vlores de cd uno los prámetros evludos se usó l prue de diferencis mínims significtivs de Fisher (LSD) con un nivel de significnci de α = 0,05. Gráficmente, letrs diferentes indicn diferencis significtivs en los vlores de ls medids relizds. Clsificción y procesmiento de los frutos El índice de mdurez es un prámetro fisicoquímico de grn importnci pr l correct clsificción de los frutos en diferentes estdos de mdurción. or tnto, se midió este prámetro sore los frutos liofilizdos utilizndo un refrctómetro pr determinr l cntidd de sólidos solules totles expresdos como ºBrix y un titulción ácidose con hidróxido sodio 0,1 pr estlecer l cidez titulle (que se report como porcentje de ácido málico por cd 100 g de fruto) (Tl 3). L clsificción hech inicilmente con se en el color y prienci concuerd con los vlores otenidos pr el índice de mdurez, puesto que se oservn diferencis entre los vlores otenidos pr los diferentes estdos, vlores que vn umentndo durnte el proceso de mdurción. Este fenómeno no h sido reportdo en l litertur hst el momento, siendo más ltos que los de otrs fruts tropicles como l guy (8) y l uv (9). Cuntificción de compuestos fenólicos lires L cuntificción de fenoles totles se determinó en los extrctos otenidos de epicrpio y mesocrpio de rzá liofilizdo utilizndo el método de Folin-Cioclteu. En l Figur 1 se oserv que el contenido de fenoles es myor en el estdo verde, tnto en epicrpio como en mesocrpio, seguido por el estdo mduro, el estdo pintón y, finlmente, el soremduro. Al plicr l prue estdístic de rngo múltiple entre muestrs se encontró que en el mesocrpio del rzá los vlores otenidos pr los estdos pintón y mduro son estdísticmente igules, indicndo que el contenido de fenoles lires es igul en mos estdos pesr de l diferenci en l mdurez del fruto. Fenoles totles (mg ác. gálico/100 g muestr) erde intón duro Soremduro Estdo de mdurez Epicrpio esocrpio Figur 1. Cuntificción de compuestos fenólicos por el método de Folin-Cioclteu en el fruto de rzá. Tl 3. Índice de mdurez del fruto de rzá liofilizdo en diferentes estdos de mdurción. Estdo de mdurez Acidez titulle (% ác. málico) Sólidos solules (ºBrix) Índice de mdurez (ºBrix / % ác. málico) erde 6,82 ± 0,30 5,0 ± 0,1 0,73 ± 0,03 intón 5,55 ± 0,11 6,5 ± 0,1 1,17 ± 0,01 duro 4,64 ± 0,18 7,0 ± 0,2 1,51 ± 0,10 Soremduro 4,52 ± 0,06 7,5 ± 0,1 1,66 ± 0,05 24 Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 24

5 Estudio de l cpcidd ntioxidnte del rzá (Eugeni stipitt c ugh) durnte l mdurción erde intón duro Soremduro erde intón duro Soremduro Actividd ntioxidnte (µmoles TROLOX/g muestr) Epicrpio esocrpio Actividd ntioxidnte (µmoles TROLOX/g muestr) Epicrpio esocrpio Estdo de mdurez Estdo de mdurez Figur 2. edid de l ctividd ntioxidnte por el método ABTS en el fruto de rzá. Figur 3. edid de l ctividd ntioxidnte por el método DH en el fruto de rzá. Cuntificción de l cpcidd ntioxidnte totl Los distintos métodos utilizdos pr medir l cpcidd ntioxidnte se deen l lt cpcidd que tienen los polifenoles como ntioxidntes, pues cd método de medid es sensile ls distints crcterístics redox del compuesto polifenólico. Los métodos ABTS y DH ctún sore polifenoles donores de átomos de hidrógeno rdicles oxidntes, estilizándolos y disminuyendo sí su poder oxidnte; el método FRA ctú sore los polifenoles cpces de donr electrones reduciendo intermedirios oxiddos, mientrs que el método de decolorción del β-croteno ctú desloclizndo y estilizndo los electrones reciidos de un rdicl lire. or tnto, pr determinr l cpcidd ntioxidnte totl de un fruto, dee medirse l ctividd ntioxidnte medinte cd uno de estos métodos pr poder determinr, tnto el efecto de neutrlizción de rdicles lires, como su cpcidd de reducción (14). El primer método plicdo los cutro extrctos otenidos del fruto de rzá fue el método ABTS, que permite medir l cpcidd de los polifenoles, o moléculs con cpcidd ntioxidnte, de cptr rdicles lires y que se sigue espectrofotométricmente un longitud de ond de 734 nm. Los vlores de ctividd ntioxidnte otenidos por este método, utilizndo el Trolox como ptrón, se oservn en l Figur 2 y muestrn que en el epicrpio del fruto de rzá l cpcidd ntioxidnte medid es myor (y estdísticmente igul) en los estdos verde y mduro, mientrs que en el mesocrpio, l myor cpcidd ntioxidnte se present en el estdo verde, seguid de los estdos pintón y mduro que no presentn diferencis significtivs entre sí; y, finlmente, el estdo soremduro. Según estos dtos l cpcidd de cptr rdicles lires es myor en el estdo verde del fruto, lo que está relciondo con el myor contenido de fenoles. El segundo método utilizdo fue el DH (2,2-difenil-2-picrilhidrzilo). Al igul que el método ABTS, este método mide l cpcidd de cptr rdicles lires por prte de los polifenoles y demás especies con cpcidd ntioxidnte, siguiendo ls recciones por espectrofotometrí un longitud de ond de 515 nm. Al oservr los dtos otenidos (Figur 3), l cpcidd ntioxidnte en el epicrpio del rzá es myor en el estdo mduro seguid de los estdos verde, pintón y soremduro mientrs que, en el mesocrpio el myor vlor se d en el estdo verde, oservndo demás que los estdos pintón y mduro no presentn diferencis significtivs entre si y que el estdo soremduro present l menor cpcidd de cptr rdicles lires. Al comprr los métodos ABTS y DH hy concordnci en l medid de cpcidd ntioxidnte en el mesocrpio del fruto de rzá y un liger diferenci entre los vlores otenidos sore el epicrpio en el estdo mduro. Los resultdos otenidos con los métodos ABTS y DH muestrn que en tods ls medids el método DH rrojó resultdos menores, lo que indic que los ensyos relizdos con este método son menos específicos y selectivos, como se report en l litertur (9). A diferenci de los métodos nteriores, el método FRA mide l cpcidd de reducción de un ntioxidnte medinte trnsferenci de un electrón (es decir, el pso de Fe 3+ Fe 2+ en el complejo ([Fe(III) (TTZ) 2 ] 3+ ), siguiendo el proceso por espectrofotometrí un longitud de ond de 593 nm. r el método FRA se utilizron dos compuestos como ptrones, Trolox (l igul que en los métodos nteriores) y sulfto de hierro(ii) (FeSO 4 ). Utilizndo Trolox como ptrón se otuvieron los resultdos que se muestrn en l Figur 4, en l que se oserv que l cpcidd ntioxidnte en el epicrpio del rzá es myor en los estdos verde y mduro, seguid por l cpcidd de los estdos pintón y soremduro; en el mesocrpio, l myor cpcidd de reducción se present en el estdo verde, seguid por los estdos pintón y mduro (que no presentn diferencis estdísticmente significtivs entre sí) y, finlmente, el estdo soremduro. erde intón duro Soremduro erde intón duro Soremduro Actividd ntioxidnte (µmoles TROLOX/g muestr) Epicrpio esocrpio Actividd ntioxidnte (µmoles TROLOX/g muestr) Epicrpio esocrpio Estdo de mdurez Estdo de mdurez Figur 4. edid de l ctividd ntioxidnte por el método FRA en el fruto de rzá usndo Trolox como ptrón. Figur 5. edid de l cpcidd ntioxidnte por el método FRA en el fruto de rzá usndo FeSO 4 como ptrón. Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 25

6 Cuellr, F. A.; Ariz, E.; Anzol, C.; Restrepo,. Tl 4. Coeficientes de correlción linel entre el contenido de fenoles y l ctividd ntioxidnte hidrofílic en el fruto de rzá. Tl 5. Ecuciones de ls curvs de clirción empleds pr l cuntificción cromtográfíc de los compuestos fenólicos presentes en el fruto de rzá. étodo Epicrpio esocrpio ABTS 0,946 0,990 DH 0,888 0,985 FRA (Trolox) 0,993 0,998 FRA (FeSO 4 ) 0,983 0,998 Ácido Longitud de ond Curv de clirción Gálico 220nm Y=29,30X + 0,44 0,99 Clorogénico 320nm Y=14,31X - 0,16 0,99 Cféico 320nm Y=18,60X + 0,91 0,99 R 2 Actividd ntioxidnte (µmoles TROLOX/g muestr) Epicrpio esocrpio erde intón duro Soremduro Estdo de mdurez Figur 6. edid de l ctividd ntioxidnte por el método de decolorción del β-croteno en el rzá. Al relizr l medid de l cpcidd ntioxidnte por el método FRA en los cutro estdos de mdurción utilizndo como ptrón FeSO 4 (Figur 5) se oserv que l myor cpcidd ntioxidnte en el epicrpio del rzá se present en el estdo verde, seguid de los estdos mduro, pintón y siendo el menor el soremduro, mientrs que en el mesocrpio l cpcidd ntioxidnte es myor en el estdo verde, seguid de los estdos pintón y mduro (que son estdísticmente igules) y menor en el estdo soremduro. Ls diferencis en el método FRA l utilizr ptrones diferentes se deen l diferenci de los mecnismos de rección que tiene el rectivo de FRA con el Trolox y el FeSO 4. L cpcidd ntioxidnte hidrofílic determind por los métodos nteriores se dee compuestos como polifenoles, vitmins hidrosolules como el ácido scórico, y otros compuestos. Al relcionr el contenido de fenoles del rzá en sus cutro estdos de mdurez con l medid de cpcidd ntioxidnte se oserv un correlción linel con coeficientes de correlción cercnos 1,00 (Tl 4). Este comportmiento permite triuir l cpcidd ntioxidnte hidrofílic los compuestos polifenólicos presentes en el rzá, los cules no hn sido reportdos en l litertur previmente. El último método que se plicó pr relizr l comprción de l cpcidd ntioxidnte fue el de decolorción del β-croteno. En éste, se promueve l peroxidción térmic del ácido linoléico en presenci de O 2 pr formr el rdicl peroxilo; este rdicl puede ser neutrlizdo por el β-croteno ocsionndo l ruptur de su conjugción mnifestándose en el proceso de decolorción que puede ser medido espectrofotométricmente un longitud de ond de 470 nm. Entre más cpcidd ntioxidnte teng el compuesto evludo, menor será l decolorción del β-croteno. r este método se relizó un nuev extrcción utilizndo ceton en ls prtes comestiles del fruto en los cutro estdos de mdurez. En l Figur 6 se reportn los vlores otenidos pr dich ctividd; en el cso del mesocrpio del rzá el estdo soremduro, l igul que el estdo verde, presentn l myor cpcidd ntioxidnte lipofílic, seguid de los estdos mduro y pintón; en el epicrpio se oserv que el estdo mduro present l myor cpcidd ntioxidnte, seguid de los estdos pintón, soremduro y verde. Si ien no es tn mrcd l diferenci en l cpcidd ntioxidnte hidrofílic en los estdos verde y mduro, est cpcidd disminuye con el estdo de mdurez, y que los fenoles (que son los principles contriuyentes est cpcidd) se oxidn de cuerdo l proceso respirtorio del fruto durnte l mdurción. Los vlores otenidos por el método de decolorción del β-croteno son diferentes los encontrdos por los métodos ABTS, DH y FRA, y que estos últimos miden l ctividd ntioxidnte de los componentes hidrofílicos del fruto (como fenoles o lguns vitmins), mientrs que el primero cuntific l ctividd ntioxidnte de compuestos lipofílicos como los crotenoides (5). Cuntificción e identificción de los compuestos fenólicos L identificción preliminr de los compuestos fenólicos, presentes en l mesocrpio y el epicrpio del fruto de rzá en diferentes estdos de mdurción fue relizd medinte l técnic de cromtogrfí líquid de lt eficienci con detector de rreglo de diodos (HLC-DAD). r confirmr l identidd de los compuestos, se relizó el nálisis comprtivo espectrl U-IS con los compuestos ptrones de cd uno de los picos, en l cul los picos de ls muestrs presentn los mismos máximos de sorción, sí como l mism form del espectro que los ptrones correspondientes, lo que permite confirmr l identidd de los picos de ácido gálico, cféico y clorogénico, cuyos tiempos de retención fueron idénticos los de los compuestos identificdos. Un vez identificdos los ácidos fenólicos presentes en el mesocrpio y epicrpio de rzá, estos se cuntificron medinte interpolción en curvs de clirción relizds con los ptrones. Los dtos de ls curvs pr cd ácido fenólico se oservn en l Tl 5. En l Figur 7 se oserv que el ácido clorogénico en el epicrpio logr un vlor máximo en el estdo pintón, pero luego empiez decrecer; por el contrrio, en el mesocrpio este ácido ument su concentrción conforme vnz l mdurción del fruto. L concentrción del ácido cféico disminuye durnte l etp de senescenci, mientrs que l concentrción del cido gálico tuvo un tendenci umentr durnte l mdurción, tnto en el epicrpio como en el mesocrpio. Tmién se puede oservr que el ácido clorogénico es el compuesto fenólico que present myor concentrción, cerc de 500 µg/g en el estdo pintón y 500 µg/g en el estdo mduro en el epicrpio y proximdmente 115 µg/g en el estdo soremduro y 75 µg/g en el estdo mduro en el mesocrpio; sí, este compuesto podrí presentr l myor contriución l cpcidd ntioxidnte en el fruto de rzá, seguido por el ácido gálico. Ce resltr que el ácido clorogénico es el compuesto fenólico más undnte en plnts y tmién el ntioxidnte más ctivo de este grupo de compuestos (5). Se h determindo l cpcidd ntioxidnte de ls pulps de los frutos tropicles de (mor, uv, çí, guy, fres, cerol, piñ, mngo, grviol, cupuçu y mrcuyá) plicndo el método ABTS con medids 26 Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 26

7 Estudio de l cpcidd ntioxidnte del rzá (Eugeni stipitt c ugh) durnte l mdurción µg/g µg/g µg/g 258,5 7,5 515,1 8,4 c 395,7 11,1 222,5 c 3,0 c HO HO CO 2 H HO HO Ácido clorogénico O O Ácido cféico Ácido gálico O O 44,1 4,8 c 69,8 5,3 75,6 4,0 118,9 4,5 c HO 23,2 32,1 39,1 64,8 34,1 17,3 29,4 39,8 Figur 7. Cuntificción de los ácidos fenólicos por HLC-DAD extrídos del rzá en diferentes estdos de mdurción. () epicrpio; () mesocrpio. : verde; : pintón; : mduro; : soremduro. dos tiempos (1 y 7 minutos), DH (30 y 60 minutos) y DD (10 minutos). Los vlores TEAC (cpcidd ntioxidnte equivlente l Trolox) otenidos de ls pulps, osciln entre mínimos y máximos de 2,0 y 67,2 µmol/g plicndo el ensyo ABTS, 1,02 y 67,0 µmol/g plicndo DH. L cpcidd ntioxidnte otenid por los métodos ABTS y DH se encuentr correlciond con el contenido de compuestos fenólicos y ntocinos, lo que demuestr que el rzá posee un myor cpcidd ntioxidnte en el epicrpio comprdo con ls demás fruts (15). Conclusiones El rzá present un myor ctividd ntioxidnte en el estdo verde, l cul disminuye conforme vnz el grdo de mdurez, especilmente en el epicrpio. Su cpcidd ntioxidnte es principlmente de tipo hidrofílico y se dee principlmente los compuestos ácidos fenólicos, en especil, l ácido clorogénico. Rev. Colom. Quim. 2013, 42(2), Referencis 1. elioglu, Y.; zz, G.; Go, L.; Oomh, B. Antioxidnt Activity nd Totl henolics In Selected Fruits, egetles nd Grin roducts. J. Agric. Food Chem : Do Nscimento, S.; De Oliveir, D.; Wchter, O. Arz (Eugeni stipitt): Cultivo y Utilizción: nul Técnico. Ed. Secretri ro Tempore, Fernández-Trujillo, J..; Crrillo,..; Brrer, J. A.; Hernández,. S. Arzá. En: Tropicl fruit. Yhi, E.. (editor). Cmridge (UK): Woodhed ulishing. pp Hernández,.; Brrer, J.; Crrillo,. Arzá. Instituto Amzónico de Investigciones Científics. pp Grzón, A.; Nrváez, C.; Rche, E.; Kopec, A.; Brry,.; Kenneth,. Determintion of Crotenoids, Totl henolic Content, nd Antioxidnt Activity of Arz (Eugeni stipitt c ugh), n Amzonin Fruit. J. Agric Food Chem (18): RE. COLOB. QUI. ol 42 No ind 27

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