INFLUENCIA DE LA LUZ SOLAR EN EL CRECIMIENTO Y ESPORULACIÓN DEL BIOFUNGICIDA TRICHODERMA VIRIDE

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1 INFLUENCIA DE LA LUZ SOLAR EN EL CRECIMIENTO Y ESPORULACIÓN DEL BIOFUNGICIDA TRICHODERMA VIRIDE Adriana González Morlá, Siannah M. Mas Diego, Dainelis Cabeza Pullés, Melek Campos Sofía Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado (CNEA), Universidad de Oriente Los hongos del género Trichoderma son muy utilizados como controladores de hongos fitopatógenos, responsables de muchas enfermedades agrícolas. Debido a la gran importancia que despiertan éstos como controladores biológicos, se realizó un estudio acerca de la influencia ejercida por la luz solar en el crecimiento y esporulación de Trichoderma viride, con el propósito de mejorar los procesos fermentativos sobre soporte sólido realizados con este agente y lograr mayor eficiencia del producto obtenido. Se experimentó con tres medios de cultivos diferentes, inoculados con el microorganismo en estudio. Una parte de las siembras fueron incubadas en la oscuridad y las otras crecieron expuestas a la luz solar, ambas bajo la misma temperatura de incubación. Los resultados no arrojaron grandes diferencias en el crecimiento entre las siembras incubadas en presencia de la luz como en su ausencia. Sin embargo, sí se observaron diferencias significativas en cuanto al crecimiento del Trichoderma en los medios y con respecto al M2, y además, se observó el efecto benéfico de la luz solar en el incremento de la esporulación, reportándose diferencias significativas en cuanto a la concentración de esporas. Palabras clave: luz, esporulación, Trichoderma viride. The fungi belonging to the genus Trichoderma are considered of main interest as controllers for many phytopathogenic fungi that may cause several agricultural diseases. Due to their great importance as biological controllers, it was decided to study the solar light influence on the growing and spore production of Trichoderma viride, in order to use the results in the improvement of solid-substrate fermentative processes employing this microorganism and the increment of the product yield. They were made experiences with three different culture media inoculated with the microorganism. Parts of the cultures were incubated in darkness and the others were exposed to solar light at the same incubation temperature. Results do not show significant difference for the growing of the plates with both treatments, but it was indeed significant difference for the media employed, being better the media denominated as and. A significant effect for the spore concentration on the plates exposed to solar light was reported, showing better results than those that grew in darkness. Key words: light, spore production, Trichoderma viride. Introducción Los hongos del género Trichoderma tienen gran importancia como controladores biológicos por la gran variedad de hongos fitopatógenos que atacan. En nuestro país, la obtención de los bioplaguicidas (alternativa biológica) por métodos artesanales y semiindustriales se ha convertido en una producción estable, que nos ha permitido contar con recursos propios para la protección fitosanitaria de los cultivos. Entre estos métodos se encuentran los procesos fermentativos en fase sólida, los cuales presentan las ventajas de que el hongo puede crecer en condiciones muy semejantes a las que el mismo encuentra en la naturaleza, produciendo conidios que constituyen las esporas de mayor interés para su empleo como bioplaguicidas, por su estabilidad y resistencia. Este trabajo se basa en valorar el efecto que ejerce la luz solar en el crecimiento e incremento de la esporulación del biocontrolador Trichoderma viride, para la posible aplicación de este trata- 92

2 miento en los procesos fermentativos sobre soporte sólido en aras de lograr mayores rendimientos de esporas; así como para determinar las mejores condiciones de cultivo del hongo a nivel de laboratorio. Desarrollo experimental Se trabajó con una cepa autóctona de Trichoderma viride brindada por el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Santiago de Cuba. Se realizaron siembras del hongo en forma de colonia central, empleando un total de venticuatro placas de Petri para el experimento, escogiendo ocho placas por cada uno de los tres tratamientos (, M2 y ). La mitad del número de placas sembradas para cada medio de cultivo fue incubada recibiendo la luz solar de forma indirecta, mientras que el resto se incubó en la oscuridad. Se realizaron un total de tres réplicas por tratamientos y se empleó un diseño experimental factorial 2 2, además, se realizaron experiencias en un punto fuera del diseño (M2). Cada 24 h y hasta un tiempo final de 72 h se realizaron mediciones de los diámetros de colonias y conteos de esporas, además de describirse las características culturales del cultivo. Tabla 1 Matriz de diseño experimental Experimentos X1 X2 X1 (Medios de cultivo) X2 (Luz/Oscuridad) Luz Oscuridad Luz Oscuridad Se elaboraron tres medios de cultivos (, M2 y ) los cuales se diferenciaban en la fuente de carbono ( y ) y uno que carecía de la misma (M2): Medios de cultivos empleados : Saboraud Maltosa Extracto de malta g/l Peptona... 5 g/l Agar g/l M2: Saboraud Peptona... 5 g/l Agar g/l : Saboraud - Sacarosa Sacarosa g Peptona... 5 g Agar g A todos los medios se les ajustó el ph a un valor de 5,4 y fueron esterilizados en autoclave a 121 C durante 15 min. Resultados La tabla 2 muestra los promedios de las mediciones realizadas de los diámetros de colonias cada 24 h. El análisis estadístico de los resultados arrojó diferencias significativas en cuanto a los crecimientos entre los medios y con respecto al M2, no existiendo diferencias significativas (p=0,05) entre los dos primeros, lo cual se justifica debido a la ausencia de la fuente de carbono en el M2. Del análisis para un mismo medio y a la misma hora de experimentación no resultaron diferencias significativas para el crecimiento de las colonias expuestas a la luz y a la oscuridad. 93

3 Tabla 2 Diámetros promedios de las colonias (mm) cada 24 h Tratamientos Mediciones (H-24) (H-48) (H-72) M2 (H-24) M2 (H-48) M2 (H-72) (H-24) (H-48) (H-72) Luz 19,25 62,25 N.M 10,75 33, ,75 58,87 N.M Oscuridad 18,37 61,62 N.M 13,37 31,81 41,12 17,86 59,36 N.M N.M: no medible Diámetros de colonia (mm) M2 H-24 H-48 Fig. 1 Crecimiento de T. viride a las horas 24 y 48 expuesta a la luz solar. Tal y como se muestra en los resultados, el microorganismo creció satisfactoriamente en el y el, pero se pudo observar que el mismo aprovechó mejor el extracto de malta () para su desarrollo de biomasa que la sacarosa (), debido a la presencia de un micelio más tupido. Las colonias crecieron rápido, al principio con una superficie lisa y casi translúcida o blanco acuoso, luego se hacen vellosas o con un penacho compacto, en varios tonos de verde y blanco puro. Las características culturales mostraron que para el el hongo desarrollaba un micelio más exuberante y de aspecto algodonoso (de color blanco) con respecto al y al M2. Para el se observó un rápido crecimiento micelial, pero pegado a la superficie del medio y no tan tupido como para el caso anterior, sino más bien con aspecto translúcido. Las colonias del M2 presentaron un crecimiento mucho más lento y nunca llegaron a esporular. A las 72 h no era posible realizar las mediciones de los diámetros de colonias de los tratamientos y, pues la colonia cubría toda la placa. La presencia del extracto de malta en el primer medio denota una fuente energética más 94

4 completa, la cual brinda a este microorganismo muchas facilidades para un desarrollo más exitoso, así como para la formación de esporas. Debido a que los hongos del género Trichoderma responden en forma diferente al ser expuestos a la luz, se calculó la concentración de esporas presentes a las 72 h. La concentración fue determinada realizando un conteo en Cámara de Neubauer de la dilución del contenido de esporas de la placa en 100 ml de agua estéril, a la que se añadió Tween 80. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Tabla 3 Concentración de esporas promedios a las 72 h Tratamientos Concentración (esp/ml) (H-72) (H-72) Luz 1,189 x ,13 x 10 7 Oscuridad 2,09 x ,28 x 10 7 En este momento (a las 72 h), las colonias del expuestas a la luz solar ya presentaban un gran número de esporas de color verde, no ocurriendo lo mismo para las colonias que crecieron en la oscuridad, las cuales presentaban muy pocas esporas y de color verde pálido. Este tratamiento fue el primero en comenzar el proceso. Típicamente, las colonias de T. viride tienen una 1E+11 1E E E+09 Conteo celular (esp/ml) Conteo celular (esp/ml) 1E+09 1E+08 1E+07 1E E E Luz Oscuridad Fig. 2 Influencia de la luz solar en la esporulación de T. viride. 95

5 coloración verde oscura, pero el volumen de la población puede hacer que las colonias aparezcan más claras u oscuras. El resto de los experimentos expuestos a la luz () comenzaron la esporulación más lentamente, obteniéndose una menor concentración de conidios con respecto al. En este caso se observó que la carencia de la fuente carbonada del M2 influyó para que éste inhibiera, tanto su crecimiento como la esporulación, ya que esta última no se efectuó dentro de los límites de la experimentación. Las colonias del crecidas en la oscuridad esporularon defectuosamente, obteniéndose una baja concentración de conidios y de escasa coloración. El análisis para un 95 % de confiabilidad mostró diferencias significativas entre las concentraciones de esporas para los medios y, así como para el tratamiento a la luz y la oscuridad. Para el no se reportaron diferencias significativas entre las condiciones de iluminación. La siguiente imagen muestra la esporulación del hongo T. viride expuesto a la luz solar como en la oscuridad, a las 72 h de incubación. LUZ OSCURIDAD Conclusiones Los datos experimentales permitieron reafirmar que el extracto de malta es una fuente energética muy rica, la cual es aprovechada con mucho éxito por este hongo para su desarrollo de biomasa y de esporas, por lo que se recomienda el empleo de la misma para elaborar los medios de conservación de hongos filamentosos y específicamente para el caso del género Trichoderma. La ausencia de una fuente energética en un medio inhibe tanto su crecimiento como 96

6 su esporulación. La exposición de este hongo a la luz solar no tiene una influencia significativa para el crecimiento del mismo, ocurriendo lo contrario para la esporulación, donde las colonias incubadas recibiendo la luz presentaron mayor número de esporas y de mejor calidad, resultado este de gran importancia para ser aplicado en aquellos procesos fermentativos sobre soporte sólido, donde se requiere de grandes cantidades de esporas en el más corto tiempo de fermentación. Bibliografía - Bailey, A. M.; Herrera, A.; Herrera, J. R., "Biología molecular de hongos de importancia agronómica", en Avances y Perspectivas, vol. XVI, Bernard, O., Estadística aplicada, La Habana, Editorial Científico-Técnica, Carson, R., Primavera silenciosa, Barcelona, Ed. Luis de Caralt, Chet, I., cn I. Chet(Eds)., Innovatic Approaches to Plant Disease Control, Nueva York, Wiley and Sons. - Guilarte Alba, Y.; González Pérez, Y., Estudio de la cinética de crecimiento en fermentación sumergida del hongo Trichoderma viride bajo la acción de campos electromagnéticos, Trabajo de diploma, Santiago de Cuba, Herrera Guirola, A. L., Manual de medios de cultivos, La Habana, Editorial Científico-Técnica, Herrera Estrella, A.; Carsolio, C., "Medio ambiente, control biológico y hongos parásitos", en Avances y Perspectivas, vol. XVII, México, Julio-Agosto, Martínez, S. J., Manual de prácticas de microbiología, La Habana, Editorial Pueblo y Educación, Owen Ward, P., Biotecnología de la fermentación, España, Ed. Acribias. S.A., Rifai, M. A., "A Revision of the Genus Trichoderma", en Micological Papers, No.116, Jan Roussos, S. J.; Perraud, Gaime, Fisiología y bioquímica de microorganismos utilizados en procesos de fermentación en medio sólido, E. Galindo(Ed); Fronteras en Biotecnología y Bioingeniería. Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería, A.C., Simon, F. A.; Montenegro, V., "Actualidad y perspectiva en la producción e investigación de los bioplaguicidas: Situación en Cuba "; en Libro de conferencias y resúmenes cortos. V Encuentro Nacional Científico-Técnico de Bioplaguicidas, Expo CREE, UNIVERSIDAD DE ORIENTE Facultad de Ingeniería Mecánica Cursos de superación profesional Título: Transferencia de calor industrial CURSO Contenido: Conducción uni, bi y tridimensional. Convección. Radiación. Diseño de equipos intercambiadores de calor. Profesor: Dr. René Lesme Jaén, P.T. Fecha: Marzo 2000 Total de horas: 60 Centro solicitante: Oferta 97