Ligamiento y Recombinación II

Transcripción

1 Ligamiento y Recombinación II

2 Base física de la recombinación El cromosoma es la unidad de transmisión en la meiosis C. Bridges: cr. X asociado al color de los ojos de Drosophila N. Stevens ye. Wilson: determinación cromosómica del sexo en insectos

3 Experimentos de Creighton y Mc Clintock 1932: estudios de ligamiento en maíz. Evidencia física de la recombinación. Demostración de intercambio de segmentos entre cromosomas homólogos con técnicas citogenéticas

4 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Línea de maiz dihíbrida con el par de crs. 9 heteromórfico Botón de tinción densa porción de otro cr.

5 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Par 9: genes de color y tipo de grano C c wx Wx C= grano coloreado c= grano blanco wx= grano ceroso Wx= grano amiláceo

6 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Gametas esperadas: Coloreado ceroso C c wx Wx Blanco amiláceo

7 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Cromosomas resultantes del crossing-over

8 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Cromosomas resultantes del crossing-over

9 Experimentos de Creighton y Mc Clintock Cruzamiento de prueba

10 Existen entrecruzamientos entre cromátidas hermanas?

11 Demostración de entrecruzamientos entre cromátidas hermanas con técnicas de tinción diferencial: Cromosomas arlequín: 2 fases de síntesis en presencia de bromodesoxiuridina, análogo de Timina. Se tiñen los cromosomas (Giemsa + colorante fluorescente). Las cromátides con el análogo en ambas cadenas se tiñen más claro; aquellas con una hebra original y otra con BdU se tiñen más fuerte.

12 Demostración de entrecruzamientos entre cromátidas hermanas Cromosomas arlequin

13 Comprobación estadística de la existencia de ligamiento

14 Cálculo de chi cuadrado en un cruzamiento de prueba de un dihíbrido Planteo de hipótesis: H0: segregación independiente Las cuatro clases fenotípicas en la descendencia se encuentran en proporciones iguales, de ¼ cada una. Valor de chi cuadrado menor o igual al de tabla H1: no se cumple la proporción de ¼ cada clase Las proporciones observadas responden a otra causa. El valor de chi cuadrado obtenido se aparta de las probabilidades. Valor mayor al de tabla.

15 Cálculo de chi cuadrado en un cruzamiento de prueba de un dihíbrido Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E) 2 /E A- B ,25 6,28 A- bb 91 65,25 10,56 aab ,25 6,60 aabb 39 65,25 10,56 Total ,00 Grados de libertad = clases fenotípicas 1 = 4-1 = 3 Para α = 0,05 Valor de tabla = 7,8147 No se cumple H0

16 Por qué no se cumple H0? 1- hay una alteración en la segregación del gen A? 2- hay una alteración en la segregación del gen B? 3- ambos genes están ligados?

17 Cálculo de chi cuadrado para el gen A Planteo de hipótesis: H0: la segregación de los alelos del gen A responde a lo esperado según leyes mendelianas (½ cada una). Chi cuadrado menor o igual al de tabla H1: no se cumple la proporción de 1/2 cada clase, las proporciones observadas responden a otra causa. Chi cuadrado: se aparta de las probabilidades (valor mayor al de tabla).

18 Cálculo de chi cuadrado para el gen A Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E) 2 /E A = ,5 0,0421 aa = ,5 0,0421 Total 261 0,0842 Grados de libertad = clases fenotípicas 1 = 2-1 = 1 Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415 Se cumple H0

19 Cálculo de chi cuadrado para el gen B Planteo de hipótesis: H0: la segregación de los alelos del gen B responde a lo esperado según leyes mendelianas (½ cada una). Chi cuadrado menor o igual al de tabla H1: no se cumple la proporción de 1/2 cada clase, las proporciones observadas responden a otra causa. Chi cuadrado: se aparta de las probabilidades (valor mayor al de tabla).

20 Cálculo de chi cuadrado para el gen B Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E) 2 /E B = ,5 0,0038 bb = ,5 0,0038 Total 261 0,0076 Grados de libertad = clases fenotípicas 1 = 2-1 = 1 Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415 Se cumple H0

21 Chi cuadrado de ligamiento Chi cuadrado de ligamiento = Chi cuadrado total Chi del gen A Chi del gen B = 34-0,0842 0,0076 = 33, 9082 Grados de libertad = = 1 Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415 No se cumple H0 Los genes están ligados

22 Tabla de chi cuadrado

23 Análisis de una Filial 2 proveniente de F1xF1

24 F1 x F1 Fenotipos AB Ab ab ab AB Ab ab ab aabb Fenotipos Genotipos AABB + AABb + AaBB + AaBb Aabb + Aabb aabb + aabb aabb

25 Análisis de la F2 Fenotipo observado A-B- A-bb aabaabb Genotipos AABB,AABb, AaBB, AaBb AAbb, Aabb aabb, aabb aabb No se pueden identificar los 2 genotipos recombinantes

26 Análisis de la F2 Parentales en repulsión (trans) ½ r ½ (1-r) ½ (1-r) ½ r AB Ab ab ab ½ r ½ (1-r) ½ (1-r) ½ r AB Ab ab ab aabb aabb es una combinación nueva (recombinante) aabb = ¼ r 2

27 Análisis de la F2 Parentales en repulsión (trans) aabb es una combinación nueva (recombinante) ¼ r 2 = aabb total r 2 = aabb x 4 total r = Ѵ aabb x 4 total

28 Análisis de la F2 Parentales en repulsión (trans)

29 Análisis de la F2 Parentales en acoplamiento (cis) ½ (1-r) ½ r ½ r ½ (1-r) AB Ab ab ab ½ (1-r) ½ r ½ r ½ (1-r) AB Ab ab ab aabb aabb es una combinación parental aabb = ¼ (1-r) 2

30 Análisis de la F2 Parentales en acoplamiento (cis) aabb es una combinación parental ¼ (1-r) 2 = aabb total (1-r) 2 = aabb x 4 total 1-r = Ѵ aabb x 4 total r = 1 - Ѵ aabb x 4 total

31 Análisis de la F2 Parentales en acoplamiento (cis)

32 Frecuencias de recombinación según las combinaciones parentales

33 Prueba de 3 puntos

34 Prueba de 2 puntos: cuando están muy alejados no se detectan dobles crossing over Pérdida de información entre ambos loci: crossing over dobles entre A y C no se perciben

35 Prueba de 3 puntos Incorporación de un gen entre A y C

36 Prueba de 3 puntos

37 Prueba de 3 puntos Fenotipos Observados triple salvaje triple mutante A-bbcc 388 aab-c- 367 A-B-cc aabbc A-bbC- 60 aab-cc Las clases recíprocas presentan frecuencias parecidas

38 Prueba de 3 puntos Fenotipos Observados triple salvaje triple mutante A-bbcc 388 aab-c- 367 A-B-cc aabbc A-bbC- 60 aab-cc 72 rec. Simples A-B rec. Simples B-C 132 dobles rec

39 Prueba de 3 puntos Distancia A-B= ( )/15.000*100= 5,91% Distancia B-C= ( )/15.000*100= 19,51% * Distancia A-C= (755*+2795*+2*132)/15.000*100=25,42%

40 Mapa de ligamiento Representación gráfica que determina el locus en posición central y establece las distancias A B C a b c 5,91cM 19,51cM 25,42cM

41 Coeficiente de coincidencia un entrecruzamiento en una determinada región favorece o impide que se den más entrecruzamientos en esa región? Obs = 132/15000 = 0,0088 Esp = 0,059 * 0,195 = 0,0115

42 Observados Fenotipos Observados triple salvaje triple mutante A-bbcc 388 aab-c- 367 A-B-cc aabbc A-bbC- 60 aab-cc dobles rec

43 Interferencia I = 1 - c + : se observan menos entrecruzamientos dobles que los esperados - : se observan más entrecruzamientos dobles que los esperados 0 : no hay interferencia

44 Técnicas de mapeo de genes

45 Mapas de ligamiento: mapeo con frecuencias de recombinación - resume toda la información: orden y distancia entre genes - constituye el mapa de un grupo de ligamiento, e incluye todos los genes que se localizan en un cromosoma particular. - se obtiene el mismo mapa genético sin importar cuál de los progenitores aportó un alelo particular, y no resultan modficados si la fase de ligamiento es en acoplamiento o en repulsión (cis o trans).

46 Mapas cromosómicos por hibridación de células somáticas Fusión in vitro de 2 líneas celulares somáticas de especies diferentes de mamíferos Línea celular somática: células tumorales o células modificadas por virus Fusión celular por tratamiento con polietilenglicol

47 Mapas cromosómicos por hibridación de células somáticas Fusión de células de humano y ratón: pérdida de cromosomas en las células híbridas. Los cromosomas que se van perdiendo pertenecen exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. En híbridos humano/roedor: se pierden los humanos

48 Mapas cromosómicos por hibridación de células somáticas Panel de líneas híbridas humano/ratón estables Línea Proteína Cr.1 Cr.2 Cr.3 Cr.4 Cr.5 Cr.6 Cr.7 Cr.8 Cr.9 Cr.10 Cr.11 Cr.12 Cr.13 Cr.14 Cr.15 Cr.16 Cr.17 Cr.18 Cr.19 Cr.20 Cr.21 Cr.22 Cr.X Cr.Y 1 sí sí no sí no sí permite asociar uno o varios fenotipos con un cromosoma particular

49 Técnicas moleculares Hibridación de sondas

50 Técnicas moleculares Secuenciación directa

51 Técnicas moleculares Secuenciación directa