El ciclo celular Normal y patológico TOMAS KOLTAI

Transcripción

1 El ciclo celular Normal y patológico TOMAS KOLTAI

2 CICLO CELULAR Se denomina ciclo celular al proceso en el que a partir de una célula en reposo se forman dos células nuevas o células hijas mediante la división celular o mitosis. La división celular o mitosis, es visible con el microscopio óptico. Es por ello que antiguamente se decía que el ciclo celular estaba compuesto por dos fases: 1) Fase de mitosis 2) Interfase, o sea el tiempo existente entre una mitosis y la siguiente. Hoy sabemos que la interfase es un período bastante más complejo de lo que el microscopio óptico permitiría detectar.

3 CICLO CELULAR El ciclo celular de los mamíferos consiste en 4 fases discretas: 1) Fase S, en la que el ADN se replica; 2) Fase M,en la cual los cromosomas se separan en dos nuevos nucleos. Estas dos fases están separadas por dos fases intermedias llamadas Gap,o G1 y G2, en las cuales la célula se prepara para el paso que le sigue: fases S y M respectivamente. Existe un punto de control ( checkpoint ) conocido como punto de restricción (Restriction point o R). Previo al punto R (restriction point), la célula depende de estímulos externos (factores de crecimiento) para progresar en la fase G1. Después de R (restriction point), la célula se hace independiente de estímulos mitogénicos externos y puede completar la división celular en forma autónoma. Las células normales se encuentran en reposo en una fase conocida como G cero, hasta que reciben estímulos mitogénicos.

4 El ciclo celular de los mamíferos

5 A comienzos del siglo XX el ciclo celular fue descripto, constando de 2 Fases: MITOSIS e INTERFASE M I T O E G0 S I M S S I N G2 G1 A T S F R E Las 4 fases del ciclo celular Punto de Restricción

6 La vía p16-ciclina D-Rb ( motor del ciclo celular)

7 El gen del retinoblastoma fue aislado en Fue el primer gen supresor de tumores identificado basado en el conocimiento de su ubicación cromosómica: cromosoma 13 banda q14. Mutaciones en el gen del retinoblastoma (Rb), predisponen a la formación de un tumor infantil del ojo: el retinoblastoma. La pérdida de Rb predispone a diversos tumores, con el osteosarcoma como el más frecuente. Pérdida de la función del Rb puede encontrarse en varios tumores espontáneos, incluyendo cáncer de pulmón, linfoma y cáncer de mama. El gen del retinoblastoma codifica una fosfoproteina de 110 kda (prb) que se encuentra expresada en casi todas las células del cuerpo humano y participa en la regulación del crecimiento. La reintroducción de un gen Rb funcionante en células de retinoblastoma produce detención de su crecimiento, indicando que la función del gen es restringir la proliferation.

8 El gen del retinoblastoma Es un gen supresor de tumores ubicado en el cromosoma 13q14 y se encuentra mutado en muchos tumores. Codifica una fosfoproteina, prb que tiene efectos inhibitorios sobre el crecimiento Cariotipo del retinoblastoma

9 La fosforilación de prb regula el ciclo celular A medida que avanza el ciclo se incrementa la fosforilación de prb hasta llegar a M

10 La protein Rb sufre una fosforilación progresiva a medida que avanza el ciclo celular. En la fase de mitosis los fosfatos son removidos del prb y el ciclo de fosforilación comienza nuevamente en la próxima fase G1. La fosforilación de prb es producida por un grupo de serina / treonina kinasas llamadas Cyclin-Dependent Kinases (CDKs). Son ciclina-dependentes porque su actividad requiere su asociación con una subunidad regulatoria llamada ciclina. En G1 temprano, se elabora ciclina D que se asociacia con CDK4 y CDK6 para formar el complejo de la ciclina activa D/CDK4 (o 6). Este complejo es responsible de la primera fosforilación de prb1 en G1.

11 En la etapa siguiente se sintetiza ciclina E que se une y activa con CDK2. Este complejo continúa con la fosforilación de prb en la fase tardía de G1. En fase S phase, se elabora ciclina A quien forma un complejo con CDK2 y adiciona nuevos fosfatos a prb. prb tiene 15 sitios de fosforilació por CDKs. En la fase de mitosis una protein fosfatase 1-like protein (PP1) remueve todos los fosfatos de prb y así se reinicia el ciclo.

12 Ciclinas dependientes de kinasas (CDKs) inactivan la proteína el retinoblastoma (prb) mediante fosforilación progresiva

13 AUSENCIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO Membrana celular Receptores inactivos Membrana nuclear prb ADN Proteina reguladora del gen CELULA EN REPOSO PROTEINA REGULADORA DE GENES VINCULADOS A REPRODUCCION ESTA BLOQUEDA POR prb EL GEN ESTA INACTIVO

14 PRESENCIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO Factor de crecimiento Membrana celular Receptores Activos y dimerizados Cadena de transducción de señales Membrana nuclear Formación del complejo ciclina-cdk que Fosforilara a prb prb ADN Proteina reguladora del gen CELULA EN FASE G1 LOS FACTORES DE CRECIMIENTO UNIDOS A SUS RECEPTORES ESPECIFICOS DESENCADENAN LA TRANSDUCCION DE SEÑALES QUE LLEVA A LA FORMACION DEL COMPLEJO CICLINA-CDK

15 PRESENCIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO Factor de crecimiento Membrana celular Receptores Activos y dimerizados Cadena de transducción de señales Membrana nuclear Formación del complejo ciclina-cdk que Fosforilara a prb P prb P TRANSCRIPCION prb FOSFORILADO CAMBIA DE CONFORMACION LIBERANDO A LA PROTEINA PROMOTORA DEL GEN Y PERMITIENDO SU ACCIONAR EN LA ESTIMULACION DE LA TRANSCRIPCION

16 EN RESUMEN: MECANISMO DE ACCION DE prb Y COMPLEJOS CICLINA-CDKs

17 RESUMIENDO: 1) La proteina prb es codificada por el gen Rb ubicado en el cromosoma 13. 2) La ausencia de la función de esta proteina (por deleción o mutación) predispone a la formación de tumores, de los cuales el retinoblastoma es el más frecuente. 3) La proteina prb impide que ciertos genes vinculados con la reproducción celular puedan ser activados por sus promotores. 4) El principal gen blanco de prb es el gen que codifica la proteina E2F. 5) La fosforilación de prb produce un cambio conformacional de la proteina que le impide continuar bloqueando la promoción de genes vinculados con la reproducción celular, en particular el gen E2F. 6) prb es secuencialmente fosforilado por kinasas que se activan por ciclinas (CDKs). 7) A medida que progresa el ciclo celular se producen diferentes ciclinas encargadas de activar y formar complejos fosforiladores con diversas kinasas. 8) Las kinasas (CDKs) están siempre presentes, pero las ciclinas, como su nombre lo indica, solo aparecen en ciertas partes del ciclo celular (ver próxima diapositiva).

18 El ciclo de las ciclinas en orden de aparición en las diversas fases En G1 de inicio aparece ciclina D. Hacia G1 avanzado y S aparecen ciclinas E y A que se Extienden hasta G2. Hacia finales de G2 y M, la ciclina B toma su lugar.

19 MECANISMO DE ACCION MOLECULAR DE prb SU RELACION CON E2F El principal blanco de prb es el gen que codifica el factor de transcripción E2F. E2F actúa como un complejo heterodimérico asociado a la proteina DP. El complejo E2F/DP puede unirse a secuencias específicas de ADN en la zona promotora de genes que responden a E2F. En la forma hipofosforilada de prb (G1 temprano), prb se une a E2F y lo inactiva. El complejo E2F/pRb puede unirse al ADN, pero en lugar de activar la transcripción actúa como represor. La fosforilación de prb por el complejo ciclina/cdk en G1 medio o tardío hace que prb pierda afinidad y libere E2F. El factor de transcripción E2F/DP libre puede ahora activar la transcripción de los genes blanco de E2F. E2F es un potente estimulador de la célula para que ingrese al ciclo celular. La expresión de E2F en células en reposo es suficiente para inducirlas a entrar en la fase S.

20 MECANISMO DE ACCION MOLECULAR DE E2F Basicamente, tres clases de genes se hallan bajo el control de E2F: 1) Genes que actúan en la transición de G1 a S del ciclo celular. Estos genes incluyen los de la ciclina E y ciclina A, el gen c-myc gene y el gen que codifica prb y la proteina vinculada p107. 2) Genes involucrados en síntesis y replicación del ADN (tales como dihidrofolato reductasa, Cdc6, and timidina kinasa y ADN polimerasa). 3) Finalmente, E2Fs son potentes inductores de apoptosis mediante la inducción del gen que codifica p19arf.

21 Control molecular del ciclo celular. Niveles crecientes de ciclina E junto a kinasa ciclinadependiente-2 (cdk2) lleva a fosforilación de prb (P-pRb). P-pRb libera E2-F, permitiendo su unión al ADN. Junto a la ARN polimerasa inicia la transcripción de genes específicos de fase S y permite el ingreso del ciclo celular en la fase S.

22 Regulación de la actividad de E2F mediante la fosforilación de prb prb hipofosforilado reprime la actividad de E2F a nivel de genes E2F dependientes. prb fosforilado libera la actividad de E2F a nivel de genes E2F dependientes.

23 COMPLEJIDAD DE LA REGULACION DEL CICLO CELULAR CICLINA D es la primera en ser sintetizada en respuesta a señales de crecimiento. En G1, aparece la ciclin E,seguida por ciclina A en la transición de G1 a S. La Ciclina B se produce en G2 y M. La aparición cíclica de las ciclinas es solo una parte de la regulación del ciclo celular. Su desparición cíclica por proteólisis es la otra parte del mecanismo de control. Regulated proteolysis is a recurring theme in cell cycle regulation as protein breakdown gives directionality to the process: After a protein is destroyed by proteolysis, the cell cannot easily return to an earlier state in which the protein was still present. In contrast phosphorylation is easily reversible through the actions of phosphatases and is therefore not a good tool to assure that the cell cycle proceeds only in the forward direction. An important question is how mitogenic signals that are received by cell surface receptors communicate to the nuclear cell cycle machinery to induce cell division.

24 RELACION DE prb CON LOS DEMAS ELEMENTOS INVOLUCRADOS EN LA TRANSCRIPCION BLOQUEO DEL COMPLEJO CICLINA-CDK4/6 POR PABOCICLIB PABOCICLIB

25 Relación entre estímulos externos y puesta en Marcha del ciclo celular: el papel de la proteina RAS Estimulos mitogenicos Receptores La expresión de ciclina D1 occure luego de estímulos mitogenicos. Existe la noción que la ciclina D actúa como un sensor de factores de crecimiento intracelular. La activacion de Ras lleva a la inducción transcripcional de D1 por la presencia de un elemento de respuesta a Ras en el promotor del gen de la ciclina D1.

26 Relación entre estímulos externos y puesta en Marcha del ciclo celular: el papel de la proteina RAS Los receptores de factores de crecimiento tienen como uno de sus blancos a Ras que inicia una cascada de señales citoplásmicas como la vía PI3-kinasa y la delas MAP kinasas. Estas vías se conectan con la maquinaria nuclear que pone en marcha el ciclo celular.

27 Prueba del concepto de que la ciclinad1 es un mediador esencial en la señalización de RAS Usando una mutación de RAS, la señalización de esta proteina produce una detención del ciclo celular. Pero cuando se utiliza el RAS no mutado, la vía de señalización induce el ciclo celular.

28 Otro nivel de control del ciclo celular: LOS INHIBIDORES DE CDKs LAS PROTEINAS DE LA FAMILIA INK4A Se unen a CDK4 y CDK6 y previeen su unión con las ciclinas. Está integrada por 4 miembros: p16, p15, p18 y p19. LAS PROTEINAS DE LA FAMILIA CIP/KIP P21 es el representante clásico. Se une a complejos CDK/ciclina formando un complejo ternario inactivo con ciclina E/CDK y con ciclina A/CDK. No tiene igual acción sobre ciclina D/CDK.

29 Las dos clases de inhibidores de CDKs Inhibidores binarios Inhibidores TERCIARIOS

30 PALBOCICLIB Palbociclib es un inhibidor selectivo de CDK4 y CDK6, inhibiendo por lo tanto la fosforilación de prb en la fase temprana de G1 y deteniendo de esta manera el ciclo celular. Esto siprime la replicación del ADN y disminuye la proliferación celular CDK4 y CDK6 son serino/treonina kinasas que se encuentran aumentadas en muchos tumores malignos y cumplen un rol esencial en la progresión del ciclo celular Palbociclib (PD ) HCl elaborado por Pfizer se encuentra disponible en comprimidos orales y no muestra actividad contra CDK1/2/5, EGFR, FGFR, PDGFR. Está aprobado por la FDA en el tratamiento del cáncer de mama ER-positivo y HER2negativo.

31 SEÑALES QUE CONVERGEN SOBRE CDKs

32 El papel central de CDKs en la regulación del ciclo celular es claramente comprensible si se observa en la diapositiva anterior la cantidad de vías de señalización que convergen sobre estas proteinas: 1) Factores de crecimiento y señales de RAS a través de ciclina D, 2) Señales inhibitorias emanadas de TGF-β actuando sobre p15 INK4B o p27kip1 (dependiendo del tipo celular 3) Envejecimiento o senescencia lleva al incremento de p16 INK4A, 4) Daño del ADN que induce incremento de p21cip1 a traves de incremento de p53,

33 El rol central de E2F en la regulación del ciclo celular se comprende mejor si tenemos en cuenta que en el cáncer muchos de los reguladores corriente arriba de E2F estan mutados. La deleción de Rb en cancer familiar y espontáneo ya se ha mencionado. Desregulación de ciclina D1 puede resultar de translocación crromosómica (adenoma paratiroide) o por amplificación génica (frecuente en cancer de mama). p16ink4a esta codificado por un gen supresor de tumores y su inactivación es frecuente en cancer. Mutaciones en CDK4 que la vuelven insensible a la inhibición por p16ink4a se ha encontrado en melanoma.

34 Dado el frecuente hallazgo de mutaciones en cada uno de los reguladores de E2F, se piensa hoy que la mayoría de cánceres tienen desregulada la vía p16-cyclin D-pRb.

35 La vía p16-ciclina D-pRb

36 La vía p16 - ciclina D proteina Rb afectada en el cáncer

37 VIRUS Y CICLO CELULAR prb tiene un papel central en la regulación del ciclo celular. Los virus tumorales (de ADN) desarrollaron proteinas virales especializadas que se unen a prb y la inactivan. La proteina E1A de los adenovirus se une con gran afinidad a prb y desplaza E2F del complejo prb. Casos similares: HPV (proteina E7) y virus del polyoma (antigeno T). Despues de la imfección, estas proteinas virales inducen la fase S del ciclo celular para así multiplicar el genoma viral. La cancerización producida por estos virus es un daño colateral de su habilidad para inducir la fase S del ciclo celular.

38 Varias oncoproteinas de virus conteniendo ADN tienen como blanco la proteina del retinoblastoma CELULA NORMAL prb regula la actividad de E2F CELULA TRANSFORMADA POR EL VIRUS E2F desplazada por proteinas virales: Desregulación de la actividad de de E2F

39 La mayoría de los componentes de la vía p16-cyclin D-pRb son redundantes: son codificados por una familia de genes relacionados. Cinco E2Fs actúan juntos para inducir la transición del ciclo celular de la fase G1 a S y se encuentran bajo regulación negativa de 3 proteinas retinoblastoma-like. A su vez, estas proteinas son fosforiladas por ciclina D1, 2 o 3 en complejos con CDK4 o 6. (La fosforilación inactiva a prb like). Estos complejos ciclina D/CDK son a su vez inhibidos por 4 inhibidores interrelacionados de la familia INK4A.

40 Si el ADN presenta un daño existe un mecanismo de control mediado por la proteina P53 que impide la continuación del ciclo celular hasta que se repare el daño. En caso de no repararse el ADN dañado p53 induce a la célula hacia la apoptosis. Si p53 está anulada, el ciclo celular continúa con el ADN dañado. Frecuente en cancer.

41 De manera similar, cuando los cromosomas están dañados como resultado de stress genotoxico, las células no ingresan al ciclo celular hasta que el daño haya sido reparado. Las células normales responden al daño al ADN induciendo detención del ciclo en G1 y G2. En ambos casos la acción de p53 es fundamental. Las células que carecen de p53 funcionanteson incapaces de inducir una detención del ciclo celular por daño del ADN y rapidamente acumulan mutaciones adicionales en las replicaciones subsiguientes. Por esta razón, p53 se ha denominado el guardian del genoma.

42 Activación de p53 por daño del ADN

43 La activation de p53 luego del daño del ADN es mediado por una cascada de protein kinasas. La ATM kinasa (mutada en el indrome ataxia telangiectasia) es activada en respuesta al daño del ADN, quien a su vez fosforila a la Chk-2 kinasa. Esta kinasa puede fosforilar a p53 en serinas 15 y 20, lo que elimina la interacción Mdm2-p53. Esto significa que el daño del ADN estabiliza y activa a p53 y conduce a la inducción transcripcional de los genes blanco de p53. Uno de ello es el gen de CKI p21cip1, que inhibe a la ciclin E y al complejo ciclina A/CDK produciendo una detención del ciclo celular en G1. El gen Bax es activado por p53 y la proteina Bax producida participa directamente en el proceso de apoptosis.

44 CONTROLES Las vías p53 y prb que controlan el ciclo celular están altamente interconectadas El promotor del gen de p19arf presenta sitios de unión para E2F. Por lo tanto la inactivactión de prb lleva a la activación de p53. Mdm2 no solo regula negativamente a p53 sino que también se une e inactiva a prb. La célula debe asegurarse que un único estímulo mitogénico no se transforme en múltiples replicaciones del ADN. Por esta razón existen circuitos de feedback negativos que limiten la división celular en respuesta a mitógenos. Un ejemplo es el siguiente. La activation de Ras lleva a una rápida inducción de entrada al ciclo celular mediante una cascada citoplásmica de fosforilaciones. Pero Ras también activa la transcripción de INK4A pero con una kinética más lenta, e induciendo a p16ink4a y p19arf.

45 CONCLUSIONES EL CICLO CELULAR ES UNA ACTIVIDAD COMPLEJA Y ALTAMENTE REGULADA DE LA VIDA CELULAR. SU DESREGULACION PUEDE SER CAUSA DE DIVERSAS ENFERMEDADES DE LAS CUALES LA MAS NOTORIA ES EL CANCER. EL CONOCIMIENTO DE LA BIOLOGIA MOLECULAR DEL CICLO CELULAR, HA ABIERTO LAS PUERTAS A LA CREACION DE NUEVOS TRATAMIENTOS PARA EL CANCER.