HERRAMIENTAS MOLECULARES APLICADAS A LA INVESTIGACIÓ PHYTOPHTHORA INFESTANS EN LA ESTACIÓ

Transcripción

1 HERRAMIENTAS MOLECULARES APLICADAS A LA INVESTIGACIÓ INVESTIGACIÓN DE PHYTOPHTHORA INFESTANS EN LA ESTACIÓ ESTACIÓN CIPCIP-QUITO

2 El tizón tardío de la papa causado por el hongo Phytophthora infestans continua siendo uno de los más serios problemas en el cultivo de la papa en los países en desarrollo. CIP ha puesto en marcha desde hace algunos años atrás programas con herramientas biotecnológicas, las mismas que están ayudando cada vez mas en entender el comportamiento, evolución, cambios y dinámica poblacional de este patógeno en nuestro país.

3 De las herramientas biotecnológicas desarrolladas para este tipo de estudios en Phytophthora infestans los marcadores a nivel molecular son los mas utilizados incluso mundialmente para la caracterización y mapeo de muchos organismos en general. De estos marcadores, los mas utilizados regularmente en la Estación CIP-Quito son de dos tipos: Proteínicos ADN o Acidos nucleicos

4 QUE ES UN MARCADOR GENÉTICO? Usualmente un marcador genético es un fragmento de ADN que puede ser un gen-, cuyo forma de expresión o fenotipo es fácilmente distinguible, y que debido a esta característica éste será usado para identificar o distinguir a un individuo u organismo que lo porta

5 Características mas deseables que un buen marcador molecular debería tener: ALTO COMPORTAMIENTO POLIMÓRFICO HERENCIA CODOMINANTE SER FRECUENTE EN EL GENOMA UNIFORMEMENTE DISTRIBUÍDO EN EL GENOMA COMPORTAMIENTO NEUTRAL FÁCIL Y RÁPIDA ACCESIBILIDAD ALTA REPRODUCIBILIDAD FÁCIL INTERCAMBIO DE DATOS ENTRE LABORATORIOS

6 MARCADORES PROTEÍNICOS

7 Los marcadores a base de proteínas fueron los marcadores mas usados para los estudios de genética, herencia, variabilidad, filogenia, etc. La información de dos formas protéicas en general nos permitirá diferenciar a un organismo. Isoenzimas Formas protéicas funcionalmente similares Aloenzimas Proteínas con variantes estructurales que representan a las diferentes alternativas alélicas en igual locus genético

8 Categorías de las proteínas por su estructura (número de cadenas de polipeptidos) HOMOCIGOTO HETEROCIGOTO HOMOCIGOTO Monoméricas Diméricas GPI (GLUCO FOSFO ISOMERASA ) PEP (PEPTIDASA) Triméricas Tetraméricas

9 CON LA SEPARACION DE LAS PROTEINAS PODEMOS REVELAR LOS PATRONES DE LINAGES EN Phytophthora infestans ACETATO DE CELULOSA ALMIDON DE PAPA

10 MARCADORES MOLECULARES DE ADN

11 El enfoque esencial de los marcadores de ADN se centra en el estudio del polimorfismo en la secuencia de material genético de los organismos. Dado que dicha secuencia de ADN es única para cada organismo, su información puede ser explotada para cualquier estudios de diversidad genética y la relaciones intra e interespecíficas, genética de poblaciones, etc.

12 En el estudio de Phytophthotora infestans en CIP-Quito nos ayudan esencialmente a discriminar la diversidad de linajes que se encuentran en los distintos hospederos y los nuevas variantes que pueden estarse generando. Los marcadores regular se estan usando: ADN mitocondrial (mt DNA). ADN microsatélites. RFLP`S (Fragmentos polimorficos de restricción). ISSR (secuencias inter-microsatélites).

13 MATERIA PRIMA HERRAMIENTA NATURALEZA ADN mitocondrial (mt DNA). ADN de mitocondria PCR + RESTRICCION CODOMINANTE ADN microsatélites (SSR). Secuencias de ADN repetitivas PCR CODOMINANTE RFLP`S (Fragmentos polimórficos de restricción). ADN genómico RESTRICCION CODOMINANTE ISSR (secuencias inter-microsatélites). Secuencias de ADN intermicrosatélites PCR DOMINANTE

14 GENERACION DE MARCADOR ADN MITOCONDRIAL (mtdna mtdna) HAPLOTIPOS DE P.infestans EXTRACCION DE DNA TOTAL AMPLIFICACION DE SECUENCIAS ESPECIFICAS POR PCR GENERACION DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION USANDO ENZIMAS (EcoR1 ( EcoR1) SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA) Ic Grupo brevifolium Ia Tomate árbol IIa Ec1 S.tuberosum Ib Tomate riñón

15 GENERACION DE MARCADOR ADN MICROSATELITE (SSR) Solanum paucijugum Solanum andreanum Solanum tuberosum Solanum phureja Lycopersicum sculentum EXTRACCION DE DNA TOTAL AMPLIFICACION DE SECUENCIAS MICROSATELITES POR PCR SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA, EGP)

16 GENERACION DE MARCADOR RFLP`S EXTRACCION DE DNA TOTAL DETECCION Y REVELADO DIGESTION DE ADN TOTAL CON ENZIMAS DE RESTRICCION SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA) TRANSFERENCIA DE ADN A MEMBRANA POR SHOUTERN BLOT HIBRIDACION Y MARCACION DE SONDA EN MEMBRANA

17 GENERACION DE MARCADOR ISSR (secuencias inter-microsatélites). 844 PERU PAPA CTC.TCT.CTC.TCT.CTC.TRC BOLIV PAPA ARGT PAPA KENYA PAPA R(A.G) UGAN PAPA EXTRACCION DE DNA TOTAL AMPLIFICACION DE FRAGMENTOS MEDIANTE PCR SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA) ECUA PAPA ECUA TOMAT KENYA TOMAT UGAN TOMAT

18 COMENTARIO FINAL Todas estas herramientas biotecnológicas, enmarcadas dentro de un programa de manejo integral del tizón tardío pretenden ampliar el conocimiento sobre e patógeno proporcionando soluciones prácticas al problema del tizón tardío en el Ecuador como puede ser el diseño de estrategias eficaces de control, la disminución en el uso de los funguicidas, transferencia de tecnologías y saber como combatir el tizón tardío con efectividad en nuestros campos.