DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA ANEMIA FALCIFORME

Transcripción

1 GENÉTICA - 1º MEDICINA Práctica 1 y 2 DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA ANEMIA FALCIFORME Profesor: José R. Blesa

2 2 DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME Laboratorio Objetivos Comprender cómo la electroforesis separa moléculas de ADN. Estudiar las causas y la herencia de la anemia falciforme. Simular un procedimiento de test genético para determinar los genotipos de varios miembros de una familia para el rasgo de la anemia falciforme. Discutir las fortalezas y debilidades del test genético de ADN. Introducción La anemia falciforme es una patología sanguínea hereditaria que afecta a los glóbulos rojos. Las moléculas de hemoglobina de cada glóbulo rojo transportan oxígeno desde los pulmones al resto de los órganos y tejidos del cuerpo y traen de vuelta dióxido de carbono a los pulmones. En la anemia falciforme, la hemoglobina es defectuosa. Después de que las moléculas de hemoglobina entreguen su oxígeno, algunas de ellas pueden agruparse en estructuras largas tipo bastón. Estas estructuras hacen que los glóbulos rojos se endurezcan y adquieren forma de hoz (falciforme). A diferencia de los glóbulos rojos normales, que generalmente son lisos y tienen forma de donuts, los glóbulos rojos falciformes no pueden deslizarse a través de los pequeños vasos sanguíneos. Al contrario, se apilan y causan obstrucciones que deprivan a los órganos y tejidos de la sangre transportadora de oxígeno. Este proceso origina episodios periódicos de dolor y finalmente puede dañar los tejidos y órganos vitales y derivar en otros serios problemas médicos. A diferencia de los glóbulos rojos normales, que viven unos 120 días en la corriente sanguínea, los glóbulos rojos falciformes mueren después de sólo unos 10 a 20 días. Como no pueden reponerse con rapidez, la sangre tiene insuficiencia permanente de glóbulos rojos generando la enfermedad conocida como anemia. La anemia falciforme está causada por un error en el gen que le dice al organismo cómo fabricar hemoglobina. Un cambio en este gen de una única base nucleotídica da lugar a un cambio de un aminoácido en la hemoglobina. El gen defectuoso le dice al organismo que fabrique la hemoglobina anormal que da como resultado glóbulos rojos deformes. Bajo determinadas condiciones, la estructura de la hemoglobina anormal cambia y se hace más alargada, lo que deforma los glóbulos rojos y les imposibilita captar oxígeno. Para que un individuo manifieste la enfermedad, se necesitan dos copias defectuosas del gen. Los niños que heredan sólo el gen defectuoso de uno de sus padres no manifestaran la enfermedad, pero son portadores del rasgo de célula falciforme. Estos individuos, aunque no tienen síntomas, pueden pasar el gen defectuoso de la hemoglobina a sus hijos. Si cada padre porta una copia del gen defectuoso (S) y otra del gen normal (A), con cada hijo de esta pareja, hay un 25% de posibilidades de que de que el niño herede las dos copias defectuosas y desarrolle la enfermedad, un 25% de posibilidades de heredar dos genes normales y no desarrollar la enfermedad, y un 50% de posibilidades de ser un portador sano, como sus padres. Se cree que este defecto en el gen de la hemoglobina se produjo hace muchos miles de años, en personas de varias partes de África, la cuenca del Mediterráneo, el Oriente Medio y la India, como mecanismo de defensa frente a la malaria. Los estudios muestran que en zonas geográficas donde la malaria era realmente un problema, los niños que portaban glóbulos rojos falciformes tenían una ventaja de supervivencia frente a los niños que tenían los glóbulos rojos normales. Para detectar la mutación que causa la anemia facilforme, el ADN de un paciente se digiere con la enzima de restricción MstII. Esta enzima reconoce una secuencia específica en el ADN en sitios cercanos al gen de la hemoglobina. Cuando un gen normal B A y un gen defectuoso B S son cortados con MstII, se generan dos fragmentos de tamaños diferentes. Estos fragmentos de ADN se separan mediante una electroforesis y después se someten a Sourthern Blotting, donde un marcador específico o sonda diseñado para unirse específicamente a los fragmentos es utilizado para identificarlos.

3 Laboratorio DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME 3 A continuación se muestra la secuencia de nucleótidos del codón 5-7 en el gen de la hemoglobina (célula normal y falciforme), junto con los correspondientes aminoácidos. También se muestran los diferentes fragmentos en tamaño producidos con la enzima MstII a partir del gen normal y el de células falciformes. Para ello deciden someterse a un test genético para saber si ellos son portadores y para conocer el estado del niño no nacido. Se os facilitan muestras de ADN de los miembros de la familia. Vuestra tarea es llevar a cabo la electroforesis de las muestras para determinar el genotipo de cada individuo. En esta práctica se someterá a electroforesis ADN no humano para mostrar los fragmentos obtenidos por digestión del gen B A y B S con la endonucleasa MstII. El resultado del gel representará los fragmentos de ADN hibridados que se mostrarían en un autorradiograma al final del procedimiento de Southern Blotting, y que servirá para determinar el genotipo de cada miembro de la familia de este caso. El siguiente autorradiograma muestra los fragmentos de ADN resultantes de la digestión de un ADN normal, genotipo A/A; un individuo con el rasgo de célula falciforme, genotipo A/S; y un individuo con anemia falciforme, genotipo S/S. METODOLOGÍA - Electroforesis Durante la electroforesis, fragmentos moleculares migran a través de agarosa, una sustancia gelatinosa derivada de algas marinas, cuando se exponen a una corriente eléctrica. Los geles de agarosa sirven como un puente eléctrico ente dos electrodos sumergidos en una solución conductora. Los fragmentos largos tienen una mayor dificultad para atravesar los poros de la agarosa que los fragmentos más pequeños, por lo tanto tardan más en recorrer el gel. En este experimento se utilizará la electroforesis para separar muestras de colorantes. La documentación adjunta sobre el procedimiento y las actividades del estudiante ayudarán a clarificar este proceso. Caso Una pareja joven está esperando su segundo hijo. Saben que el rasgo de anemia falciforme está presente en ambas familias. Aunque ni ellos, ni su hija Ann de 5 años, tienen ningún síntoma de la enfermedad, quieren saber si el niño que están esperando podría estar afectado.

4 4 DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME actividades Molde o soporte del gel Peine Fundición del gel Materiales Por cada grupo Muestras de ADN (las proporcionará el profesor en el momento de cargar la electroforesis): Madre Padre Hija No nacido Micropipeta 20 l Puntas de micropipetas Guantes Materiales comunes Cubeta de electroforesis Soporte para preparar el gel de agarosa Peines Agarosa Tampón TBE 1X Microondas Balanza Vaso de precipitados Precauciones Carga de muestras o o Seguir estrictamente las instrucciones para el manejo de las micropipetas, ya sean conocidas de una práctica anterior o las explique en el momento el profesor. La fuente de alimentación utilizada para la electroforesis produce un voltaje suficiente para causar una seria descarga eléctrica si se maneja inapropiadamente. o Asegurarse de que todos los componentes eléctricos están secos antes de la carrera. Electroforesis

5 actividades DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME 5 Procedimiento 1. El profesor preparará la agarosa disolviéndola en TBE 1X por calor, hasta casi ebullición, en el microondas. Antes de verterla sobre el soporte del gel con el peine apropiado se deja enfriar por debajo de 50ºC. Una vez en el soporte se espera a que solidifique por enfriamiento durante minutos. 2. Colocarse los guantes. Las muestras de ADN las proporcionará el profesor en el momento de cargar la electroforesis. El equipo de electroforesis es común a todos. 3. Se retira el peine del gel solidificado y se procede a cargar 10 l de cada muestra en sus correspondientes pocillos. 4. Conectar la fuente y empezar la carrera electroforética, 100V. Observar las burbujas que aparecen en los electrodos de platino. 5. Dejar migrar el gel durante minutos. 6. Cuando los colorantes llegan a 2 cm de los extremos del gel, desconectar la fuente de alimentación. Levantar la tapa de la cubeta de electroforesis y desconectarla de la toma de red. 7. Retirar el gel de la cubeta con su soporte y verter el gel en una cubeta de plástico para teñirlo. 8. Teñir el gel sumergiéndolo en el colorante Neo/BLUE durante 5-10 minutos. Desteñir el gel con agua caliente durante minutos o hasta que decolore lo suficiente y las bandas sean claramente visibles. 9. Retirar el gel y observar los resultados en el transiluminador. Cumplimentar la hoja de actividades. 10. Limpiar el banco de trabajo. Desechar las puntas de micropipeta. 11. Lavarse las manos antes de salir del laboratorio. 12. Entregar el dossier cumplimentado al profesor.

6 6 DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME actividades PÁGINA EN BLANCO A PROPÓSITO

7 actividades DIAGNÓSTICO GENÉTICO ANEMIA FALCIFORME 7 PRÁCTICAS CURRICULARES LABORATORIO GENÉTICA GRUPO Apellidos y Nombre: En el siguiente cuestionario no se pueden cometer errores en las preguntas 1 y 2, de manera que cualquier error en alguna de ellas supone una puntuación total en este ejercicio de 0 puntos. Las dos primeras preguntas puntúan 0,5 puntos conjuntamente y la pregunta 3 tiene una puntuación máxima de 0,5 puntos siempre y cuando se hayan respondido correctamente la 1 y la Basándote en tus resultados. Cuál es el genotipo para el rasgo de células falciformes de los padres, su hija y el no nacido? 2. Utilizando un cuadro de Punnet determina la probabilidad de los padres de pasar el gen de la anemia falciforme a otros hijos en el futuro. 3. Cuál es la base molecular de la anemia falciforme? Por qué viste diferencias en el patrón de bandas de las muestras de ADN que sometiste a electroforesis?