MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

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1 MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO INGENIERIA ENBIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA

2 FICHA TECNICA FICHA TÉCNICA SEMINARIO DE BIOTECNOLOGÍA MÉDICO-FARMACÉUTICA Fecha: Nombre del catedrático: 10-Julio-2012 Eduardo Guzmán Olea Nombre de la práctica: Clave: Determinación de la concentración de ácidos nucleicos por espectrofotometría y análisis de su integridad por electroforesis. Número de práctica: 2 Duración en horas: 3 Justificación: Objetivos/Resultados de aprendizaje: La purificación de ácidos nucleicos es fundamental para la realización de diversos procesos en ingeniería genética, para ello es necesario determinar la concentración e integridad de los mismos. Determinación de la concentración e integridad de ADN y ARN obtenidos de linfocitos de sangre periférica. Laboratorio donde se desarrollo de la práctica: LAB02 Actividades a desarrollar: Determinar la concentración de ADN y ARN extraído de linfocitos de sangre periférica mediante espectrofotometría. Determinar la integridad del ARN mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Determinar la integridad del ADN mediante electroforesis en geles de agarosa. Evidencia a generar en el desarrollo de la práctica: Reporte de la práctica incluyendo el análisis de los resultados Obtención de muestras biológicas para prácticas futuras. COMPETENCIAS Determinar la concentración e integridad de ADN y ARN. HABILIDADES Determinación la concentración de ácidos nucleicos. Determinación de la integridad de ácidos nucleicos.

3 Elaboró: MCS. Eduardo Guzmán Olea Espectrofotometría de ácidos nucleicos INTRODUCCIÓN Revisó: Dr. Jesús Hernández Romano Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos (AN) absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un AN en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A260. Así, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 μg/ml de ADN doble hebra, 40 μg/ml de ARN o 33 μg/ml de fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucleótidos). En las preparaciones de AN, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de AN. Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A , y para ARN, A260/A Una vez obtenida la concentración de los ácidos nucleicos, es necesario determinar su integridad mediante un análisis electroforético, mismo que permitirá continuar con diversos ensayos como PCR. OBJETIVO Determinar la concentración e integridad del ADN y ARN purificados de linfocitos de sangre periférica. MATERIALES REQUERIDOS POR EQUIPO (Cristalería) CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES

4 1 Mechero 1 caja Puntas de 200 l (amarillas) Con Rack, estériles 4 Tubos eppendorf De 1.5 ml Estériles 1 caja Puntoas de 10 l (blancas) Con Rack, estériles 1 Contenedor para desechos líquidos y sólidos de CRETI s 1 Celda de cuarzo para espectrofotómetro 2 Probetas 1 lt 2 Probetas 100 ml NOMBRE Centrifuga Espectrofotómetro Micropipeta Micropipeta Micropipeta Vortex Cámara de electroforesis vertical Cámara de electroforesis horizontal Fuente de poder para electroforesis Fotodocumentador EQUIPO REQUERIDOS ESPECIFICACIONES Para tubos eppendorf de 1.5 ml De l De 2-20 l De l (completa) (completa) OTROS MATERIALES REQUERIDOS (No suministrados por el Laboratorio) CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES 1 ml Muestra biológica (DNA y RNA) Previamente purificados REACTIVOS REQUERIDOS

5 NOMBRE CANTIDAD S I R O Agua destilada estéril 10 ml Acrilamida/bisacrilamida al 6% 20 ml X TBE 1X: 10.8 g de Tris base 1 lt X 5,5 g de ácido bórico 4 ml de EDTA 0,5 M, ph 8,0 TEMED 5 ml X X Persulfato de amonio al 10% 10 ml X X Agarosa 5 g X TAE (Tris-acetato 40 mm, EDTA 1 mm) 500 ml X Buffer de carga 6x (0.25% xilencianol, 0.25% azul de bromofenol, 30% glicerol) Bromuro de etidio, 10μg/μL Agua destilada estéril 1 ml X 1 lt X S: Riesgo a la Salud I: Riesgo de Incendio R: Riesgo de reactividad O:especificaciones Manejo y disposición de los reactivos requeridos: Los residuos utilizados se almacenarán en un frasco y se etiquetarán como CRETI s y punzocortantes para su disposición final en los contenedores de la UPEMOR. Nombre del reactivo Datos importantes de la ficha técnica Incendio: combate, derrame Salud Ambiente Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán en el laboratorio. Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán en el laboratorio

6 Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán en el laboratorio PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA 1.- Determinación de la concentración de ARN y ADN I. Hacer una dilución 1 en 100 en un volumen final de 200 μl a partir del ADN y el ARN extraído en la práctica anterior. II. Hacer un espectro de absorción entre λ=260/280 nm de las muestras de ADN y ARN. 2.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es mutagénico y cuando se manipulen soluciones que lo contienen deben tomarse las precauciones correspondientes. Usar guantes de látex. Preparación del gel: I.- Se calientan hasta ebullición la agarosa en polvo y el buffer TAE (Tris-acetato 40 mm, EDTA 1 mm). Se deja enfriar hasta 60ºC, se vierte sobre la placa previa colocación de un peine de teflón para generar los pocillos en el gel. Al enfriarse se observará la polimerización de la agarosa. Preparación de las muestras: II.- En cada tubo, poner 30 μg de la muestra correspondiente. Agregar 3 μl de "buffer de carga 6x" (0.25% xilencianol, 0.25% azul de bromofenol, 30% glicerol). Se prepararán las muestras preparadas en la clase anterior, junto a un marcador de peso molecular. Migración: III.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis. Verter buffer TAE en la cámara hasta cubrir el gel. Cargar las muestras en cada pocillo con una micropipeta en el orden de numeración de los tubos. Conectar los electrodos a la fuente de poder. Fijar el voltage en 100 V. Dejar migrar aproximadamente 60 min. Teñir en un recipiente con bromuro de etidio y observar el gel sobre un transiluminador de luz UV con protección adecuada. (ADVERTENCIA: la radiación UV altera el ADN dañando la molécula. Estos daños genéticos pueden producir cancer de piel, también daños en los ojos, especialmente la córnea produciendo cegueras temporales). 3.- Electroforesis- gel de poliacrilamida I. Preparar 10 ml de acrilamida al 6 % en TBE 1X. Atención: La acrilamida sin polimerizar es neurotóxica por lo que se debe trabajar con guantes.

7 II.- Agregar 100 l de APS al 10 % y 10 l de TEMED. Mezclar bien. III.- Verter la preparación en el molde correspondiente. IV.- Esperar 30 minutos a que polimerice; montar en la cámara para realizar la corrida. V.- Agrega buffer TBE 1X a la cámara. VI.- Agregar 3 μl de buffer de carga las muestras de RNA y cargarlas en los pocillos del gel. VII.- Dejar migrar en buffer TBE 1X, a aproximadamente 100 V, hasta que el azul de bromofenol esté saliendo del gel. La migración demora en el entorno de 1 hora 1 hora y media.se detiene la corrida. Teñir con bromuro de etidio y enjuagar el gel con agua. Observar el gel sobre un transiluminador de luz UV con protección adecuada. REPORTE DE LA PRÁCTICA El reporte deberá incluir: Diagrama de flujo de la metodología Fichas técnicas y de seguridad de los reactivos utilizados Análisis de los resultados Conclusiones Respuesta a los cuestionamientos realizados durante la práctica. Discusión Conclusiones Referencias EVIDENCIAS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE LA PRÁCTICA En este espacio se ponen las observaciones, graficas, cálculos matemáticos dibujos, datos, esquemas, tabla de datos, etc. Que se generaron durante el desarrollo de la práctica. DISCUSIÓN CONCLUSIÓN

8 BIBLIOGRAFÍA 1.- Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter Molecular Biology of the Cell. 4th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU 2.- Madriz, K Manual de Laboratorio: Biología Molecular. Editorial Instituto Tecnológico de Costa Rica. Cartago, C.R. 3.- QIAGEN plasmid mini Handbook, Marzo Sambrook, J & D, Russell Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1. Editorial CSHL. EE.UU. 4.- UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México) Bioquímica y Biología Molecular Manuales departamentales. Editorial Mc Graw-Hill. México.

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