medac Asparaginase-Aktivitäts-Test MAAT Castellano 550-VPS/010512

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1 medac Asparaginase-Aktivitäts-Test MAAT Castellano 550-VPS/010512

2 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D Hamburg DISTRIBUIDOR medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Theaterstraße 6 D Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ DIRECCIÓN DE PEDIDOS Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ VPS/010512

3 medac Asparaginase-Aktivitäts-Test (MAAT) Ensayo enzimático cuantitativo para determinación de la actividad de la asparaginasa Cat. no.: 550 PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO INTRODUCCIÓN La enzima L-asparaginasa es un elemento fundamental en el tratamiento de la leucemia linfática aguda (LLA) en niños y adultos. La terapia con asparaginasa se basa en la degradación enzimática del aminoácido asparagina para dar lugar a ácido aspártico y amoniaco, con la consiguiente depleción de los niveles de asparagina en el plasma sanguíneo y el líquido cefalorraquídeo (véase también principio del ensayo, página 2). Con ayuda del presente kit de ensayo es posible medir la actividad de la asparaginasa durante el transcurso del tratamiento a fin de optimizar la terapia con asparaginasa. Los objetivos de este seguimiento de la actividad de la asparaginasa son: Control del nivel de actividad de la asparaginasa en el suero durante el tratamiento, como parámetro que refleja la depleción de asparagina. Detección de una posible inactivación silenciosa disparada por una respuesta inmunológica, con la consiguiente reducción en el periodo de eficacia del preparado de asparaginasa. Obtención de una base racional de decisión para el posible uso de un preparado de asparaginasa alternativo o una posible adaptación de la dosis. El ensayo MAAT es un ensayo homogéneo para medición de la actividad de la asparaginasa que permite cumplir plenamente los objetivos citados. 550-VPS/

4 PRINCIPIO DEL ENSAYO Asparaginasa Sustrato Hidrólisis enzimática Producto de degradación A + Producto de degradación B + Producto de degradación B Cromógeno Pigmento verde Medición de la absorción a nm La asparaginasa degrada un sustrato análogo a la asparagina dando lugar a 2 productos de degradación A y B. El producto de degradación B liberado forma, en una reacción compleja con un cromógeno, un complejo cromático verde que puede detectarse mediante medición de la absorción. La densidad óptica se mide a nm, y la actividad de asparaginasa en el suero puede determinarse a partir de una curva calibrador. 550-VPS/

5 VENTAJAS DEL ENSAYO Uso flexible gracias a los pocillos separables individualmente Manipulación sencilla al no existir pasos de lavado y centrifugado Ensayo rápido, con una duración de sólo unas 2 horas Elevada precisión de los resultados de medición con asparaginasa medac COMPONENTES DEL KIT: Cat no.: Microplaca: 6 x 8 pocillos (con el soporte, sellada al vacío en bolsa de aluminio) divisibles, forma-u, con tratamiento especial. 2. Control: 2 viales de 0,5 ml, Asparaginasa medac obtenida a partir de E. coli en suero humano, liofilizada. 3. Calibradores: 2 viales de 0,5 ml en cada caso, Asparaginasa medac obtenida a partir de E. coli en suero humano, liofilizada: 3a. Calibrador 1: 600 U/L 3b. Calibrador 2: 300 U/L 3c. Calibrador 3: 50 U/L 3d. Calibrador 4: 0 U/L 4. Diluyente de la muestra: 1 botella con 110 ml, PBS/TWEEN/BSA, ph 7,2-7,4, listo para usar, conteniendo ProClin TM 300, Xi Irritante, R 43, S Substrato: 2 viales de 0,75 ml, listo para usar, conteniendo Pro- Clin TM Cromógeno: 2 viales de 1,0 ml, concentrado, R 52/ Diluyente para cromógeno: 2 viales de 2,0 ml, listo para usar. 550-VPS/

6 1. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Material/Reactivo Estado Conservación Estabilidad Kit de ensayo sin abrir C hasta la fecha de caducidad Microplaca abierta C en el sobre, con desecante Control abierto, disuelto hasta la fecha de caducidad C 4 semanas Calibradores abiertos, disueltos C 4 semanas Diluyente de la muestra abierto C 8 semanas Sustrato abierto C 4 semanas Cromógeno abierto C 4 semanas Diluyente para cromógeno abierto C 4 semanas Los reactivos no deben emplearse una vez expirado el plazo de caducidad indicado. 2. OTROS REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS 2.1. Micropipetas para los volúmenes correspondientes Recipientes limpios de vidrio o plástico para diluir las muestras y el cromógeno Fotómetro para microplacas, con filtro para nm. 3. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Antes de iniciar el ensayo, todos los componentes del kit deben llevarse a temperatura ambiente. Determine el número de pocillos de microtitulación necesarios. 550-VPS/

7 3.1. Microplaca Cada vez que se extraen pocillos de microtitulación, el sobre de aluminio debe volver a cerrarse bien, junto con el desecante. En la tabla de la página 4 figuran las condiciones de conservación y el plazo de estabilidad de los pocillos de microtitulación no empleados Calibradores y control Los controles y calibradores liofilizados se reconstituyen añadiendo en cada caso 0,5 ml del diluyente de la muestra. Agite ligeramente los viales cerrados para que se disuelvan también las partículas adheridas a la tapa Solución de cromógeno El cromógeno se mezcla con diluyente para cromógeno en proporción Para 8 pocillos se reqieren 800 µl de solución de cromógeno. Ejemplos: Número de pocillos Cromógeno (µl) Diluyente para cromógeno (µl) (µl) Volumen de pipeteado necesario (µl) Nota: Al mezclarla, la solución de cromógeno aumenta de temperatura. La mezcla de cromógeno y diluyente para cromógeno no puede conservarse y debe utilizarse inmediatamente. No deben mezclarse los reactivos de un lote con reactivos de otros lotes u otros fabricantes. Para obtener resultados válidos y reproducibles es imprescindible cumplir estrictamente las instrucciones de procedimiento y emplear los reactivos específicos para el kit de ensayo. 550-VPS/

8 4. MUESTRAS 4.1. El ensayo está destinado al análisis de sueros. Las muestras de los pacientes se pueden almacenar 7 días entre 2 y 8ºC. Para un almacenamiento más prolongado conservar a -20 C. Se debe evitar la descongelación y congelación repetida Los sueros no deben someterse a un tratamiento previo como p.ej. inactivación. No deben presentar contaminación microbiana ni lipemia ni contener eritrocitos humanos Los sueros se diluyen con un factor 1:10 en diluyente de la muestra (p.ej. 20 µl de suero µl de diluyente de la muestra). Las muestras situadas fuera del intervalo de medición pueden diluirse ulteriormente tantas veces como sea necesario. 5.A. INSTRUCCIONES DE PROCEDIMIENTO 5.1. Abra el cierre ZIP del envase de la microplaca y extraiga el número necesario de pocillos de microtitulación (véase apartado 3.1) Pipetee respectivamente en los pocillos 20 µl del control, de los calibradores y de las muestras A continuación, añada 20 µl de sustrato a cada uno de los pocillos. El pipeteado de los calibradores, el control, las muestras y el sustrato debe realizarse en el plazo de 10 minutos. Agítese suavemente para mezclar los componentes de forma homogénea. A continuación, la placa debe incubarse inmediatamente Incube los pocillos de microtitulación tapados durante 60 min (± 2 min) a temperatura ambiente (22 C ± 1 C) Hacia el final del tiempo de incubación, prepare la solución de cromógeno (véase apartado 3.3) Pipetee 100 µl de solución de cromógeno en cada uno de los pocillos de microtitulación Incube los pocillos de microtitulación tapados durante 60 min (± 2 min) a temperatura ambiente (22 C ± 1 C). Agite suavemente para lograr un mezclado homogéneo de los componentes. Antes de la medición fotométrica, asegúrese de que no existen burbujas de aire en los pocillos. La medición debe realizarse inmediatamente después de finalizar el último paso de incubación. 550-VPS/

9 5.B. TABLA RESUMEN DE LAS INSTRUCCIONES DE PROCEDIMIENTO Calibradores Control Muestra Calibradores Control Muestra 20 µl µl µl Sustrato 20 µl 20 µl 20 µl Incubación 60 min, temperatura ambiente (22 ± 1 C) Solución de cromógeno 100 µl 100 µl 100 µl Incubación 60 min, temperatura ambiente (22 ± 1 C) Valoración fotométrica a nm 6.A. VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS (VALIDEZ) La valoración fotométrica se realiza con una longitud de onda de nm. El valor nulo se mide con aire. El intervalo de referencia del control figura en la correspondiente etiqueta. Criterios de validez La actividad del control debe encontrarse dentro del intervalo de referencia (indicado en la etiqueta correspondiente). La densidad óptica del calibrador 1 debe ser superior a 1,500. La densidad óptica del calibrador 4 debe ser inferior a 0,150. Si no se cumplen los citados criterios de validez, es necesario repetir el ensayo. Curva calibrador y cuantificación de los resultados de medición Los valores de densidad óptica de los calibradores se representan frente a la actividad. Para la curva calibrador se recomienda utilizar un ajuste por spline cúbico. A partir de los valores de densidad óptica de las muestras puede determinarse la actividad de asparaginasa en la curva calibrador. 550-VPS/

10 El intervalo de medición va de 30 a 600 U/L. Las muestras con actividades inferiores al intervalo de medición deberán valorarse como < 30 U/L. Las muestras situadas por encima del intervalo de medición deben valorarse como > 600 U/L. No deben extrapolarse, sino someterse a un nuevo ensayo con mayor dilución. Si se ha medido una muestra con una dilución superior a 1:10, la concentración determinada a partir de la curva calibrador debe multiplicarse por el factor de dilución adicional (p.ej.: dilución en en ensayo 1:40, actividad leída 250 U/L actividad real = 250 U/L x 4 = 1000 U/L). 6.B. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS / LÍMITES DEL MÉTODO Con ayuda del medac Asparaginase-Aktivitäts-Test (MAAT) puede medirse la actividad de asparaginasa en suero para todos los preparados de asparaginasa comerciales. La calibración del test se ha realizado con Asparaginasa medac, por ello, las muestras de pacientes tratados con Asparaginasa medac se pueden estudiar con precisión. La validación se llevó a cabo en comparación con el método de referencia (test AHA, ver Lanvers et al., 2002). Debido a la dependencia de la actividad enzimática con el método de estudio, los resultados de la medición de la actividad de las muestras que contienen otras preparaciones de asparaginasa pueden dar desviaciones sistemáticas. Para determinar esta desviación para Oncaspar, se ha realizado una investigación de muestras de pacientes tratados con Oncaspar en comparación con el método de referencia AHA. Los resultados mostraron una actividad elevada promedio de 24 % (DE = 10 %, N = 134). A efectos de garantía de calidad y de comprobación de la dosificación adecuada durante el tratamiento, estas desviaciones, normalmente marginales, pueden ser obviadas. Según los conocimientos científicos actuales, no existe un valor límite claro para la actividad de asparaginasa a partir del cual se logre una depleción de la asparagina del 100 %. Por ello, el valor límite debe ser definido en cada caso por el usuario o el grupo de estudio correspondiente en función del objetivo terapéutico. Sin embargo, Riccardi et al. (1981) señalan que a partir de una actividad de asparaginasa superior a 100 U/L se garantiza una depleción completa de la asparagina, por lo que cabe considerar una actividad de 100 U/L como actividad mínima razonable. Los resultados del ensayo no se ven afectados por concentraciones elevadas de hemoglobina o bilirrubina. 550-VPS/

11 7. CARACTERÍSTICAS Las siguientes características fueron determinadas en el marco de nuestra evaluación diagnóstica. 7.A. PREVALENCIA Durante las pruebas diagnósticas se analizaron 102 sueros de donantes de sangre. En estos sueros no se midió ninguna actividad de asparaginasa. La actividad de asparaginasa estuvo por debajo de 30 U/L de forma generalizada. También se midió la actividad de asparaginasa en 52 sueros de niños. Los valores también estuvieron por debajo de 30 U/L. 7.B. PRECISIÓN Muestra Variación intraensayo Muestra Variación entre ensayos media SD CV (%) n media SD CV (%) n D.O. U/L Cal. 1 2,162 0,068 3,1 22 Cont. 91,5 3,7 4,0 9 Cont. 0,530 0,006 1,1 22 Nº 3 38,2 1,7 4,5 9 Nº 1 0,254 0,006 2,5 22 Nº 4 125,5 7,5 6,0 9 Nº 2 1,380 0,021 1,5 22 Nº 5 420,3 33,7 8,0 9 Cal. = calibrador; Cont. = control; Nº = suero; D.O. = densidad óptica 7.C. RECUPERACIÓN Mediante adición de 3 actividades de asparaginasa definidas (asparaginasa medac) a 3 sueros diferentes se obtuvo una recuperación media del 93,6 % (SD = 9,9 %). 550-VPS/

12 7.D. LINEALIDAD DE DILUCIÓN La linealidad de dilución se comprobó utilizando 10 sueros de elevada reactividad, analizados realizando 4-5 diluciones sucesivas (cada una de ellas con un factor 1:2). Dil. 1 Dil. 2 Dil. 3 Dil. 4 Dil. 5 media SD CV U/L U/L U/L U/L U/L U/L U/L % Nº ,9 Nº ,6 Nº ,9 Nº ,5 Nº ,4 Nº ,3 Nº ,0 Nº ,8 Nº ,4 Nº ,4 7.E. EFECTO DE GANCHO No se observó efecto de gancho con actividades de asparaginasa de hasta U/L. 7.F. LÍMITE DE DETERMINACIÓN (LIMIT OF QUANTITATION, LOQ) El límite de determinación es de 30 U/L. INSTRUCCIONES GENERALES PARA LA MANIPULACIÓN No deben intercambiarse las tapas de los viales de reactivos, para evitar contaminaciones cruzadas. Los viales de reactivos deben cerrarse inmediatamente después de su uso, para evitar la evaporación y la contaminación microbiana. Después de su uso, los reactivos deben guardarse inmediatamente de acuerdo con las condiciones de conservación prescritas, a fin de garantizar el plazo de estabilidad indicado. Para evitar confusiones con reactivos de otros sistemas de ensayo u otros lotes, todos los componentes del kit de un envase deben guardarse juntos después de su uso en el envase original (véase tambíen el apartado 3). 550-VPS/

13 INDICACIONES DE SEGURIDAD Debe observarse la normativa nacional sobre seguridad laboral vigente en cada caso. Los reactivos de origen humano han sido analizados, sin que se haya detectado reactividad para HBsAg, Anti-VIH 1/2 y Anti-VHC. Sin embargo, tanto estos reactivos como los que conteniendon componentes de origen animal (véase Contenido del envase ) deben tratarse como si fueran potencialmente infecciosos, a fin de evitar riesgos de infección. R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel R 52/53: Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático S 24: Evítese el contacto con la piel S 37: Úsense guantes adecuados S 60: Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos ELIMINACIÓN DE RESIDUOS Generalmente, los productos químicos y preparados que aparecen como productos residuales tienen la consideración de residuos especiales. Su eliminación está sometida a las leyes y disposiciones nacionales sobre eliminación de residuos. El organismo o empresa de eliminación de residuos competente le proporcionará más información sobre la eliminación de residuos especiales. Fecha de revisión: VPS/

14 BIBLIOGRAFIA Boos et al., Monitoring of asparaginase activity and asparagine levels in children on different asparaginase preparations; European Journal of Cancer, Vol. 32 A, No. 9, pp (1996). Boos J. medac Asparaginase-Activity-Test (MAAT): A new method to measure asparaginase activity; I-BFM-Meeting, Prag (2001). Lanvers et al., Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum; Analytical Biochemistry; 309, (2002). Mueller et al., Pegylated asparaginase (Oncaspar) in children with ALL: drug monitoring in reinduction according to the ALL/NHL-BFM protocols; British Journal of Hematology, 110, (2000). Riccardi R, Holcenberg JS, Glaubinger DL, et al., L-Asparaginase pharmacokinetics and asparagine levels in cerebrospinal fluid of rhesus monkeys and humans; Cancer Res; 41: (1981). 550-VPS/

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