Int. Cl. 7 : A01N 1/02

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k Número de publicación: k Número de solicitud: k Int. Cl. 7 : A01N 1/02 A61K 3/2 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 kfecha de presentación: k Solicitante/s: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA CTT - Camino de Vera s/n 422 Valencia, ES k 43 Fecha de publicación de la solicitud: k 72 Inventor/es: Vicente Antón, José Salvador; Lavara García, Raquel y Viudes de Castro, María Pilar k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: k 74 Agente: No consta k 4 Título: Diluyente de semen de conejo y método de inseminación artificial basado en el mismo. ES A1 7 k Resumen: Diluyente de semen de conejo y método de inseminación artificial basado en el mismo. Se describen diluyentes de semen de conejo y su método de utilización que permiten inseminaciones artificiales con resultados equiparables en fertilidad y prolificidad a los métodos descritos en el estado de la técnica pero con densidades más bajas de espermatozoides, entre 6-12 millones por dosis, y que pueden aplicarse hasta horas después de diluida la dosis de inseminación. Una de las variantes de la invención permite, además, no tener que inducir, tras la inseminación, la ovulación mediante inyección de un análogo sintético de GnRH. Ello permite que se pueda utilizar el semen de animales seleccionados para inseminar a mayor número de hembras, lo que incrementa la rentabilidad de las granjas de producción animal y elimina riesgos de transmisión de enfermedades por el uso repetido de las agujas de inyección. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Diluyente de semen de conejo y método de inseminación artificial basado en el mismo Ambito de la invención La invención está adscrita al ámbito de la producción animal a escala industrial y más concretamente a la cría de conejos con técnicas de inseminación artificial. Estado de la técnica El desarrollo y la aplicación de la técnica de inseminación artificial en conejos de producción cárnica ha estado limitada por algunos factores relacionados con las características reproductivas de la especie cunícola. En concreto, sus hembras son de ovulación inducida por el coito. La síntesis de análogos de la hormona que regula la maduración y la ovulación de los folículos ováricos (GnRH) permitió desarrollar y aplicar la técnica de inseminación en la cunicultura, solventando el problema anteriormente mencionado. En los últimos años en España se ha producido una rápida expansión de la inseminación artificial en el conejo asociada a una mejora organizativa del manejo en las explotaciones y a un incremento en el tamaño de las mismas. Esta expansión no ha conllevado ni en España,ni en otros países como Italia o Francia, substanciales avances en las técnicas de inseminación. Estas se encuentran todavía limitadas por diferentes deficiencias, entre las que podemos mencionar: una baja proporción de hembras inseminadas por macho, alta variabilidad de resultados de la aplicación del semen conservado y una deficiente relación coste-beneficio del proceso. En muy pocos casos se ha estudiado y utilizado la inseminación artificial en cunicultura para mejorar la difusión de animales seleccionados en las explotaciones y consecuentemente la productividad de las mismas. Se ha perdido así una de las principales ventajas de la inseminación artificial, la difusión genética a partir de machos seleccionados. Ello contribuiría a una mejor relación costebeneficio a la hora de aplicar la inseminación en las granjas. El desarrollo de diluyentes que incrementen el periodo de conservación útil del semen y permitan establecer dosis seminales útiles con un número bajo de espermatozoides facilitaría la utilización y difusión de semen de machos seleccionados, fundamentalmente de machos de elevada velocidad de crecimiento puesto que el objetivo de las explotaciones es la producción de carne. Tradicionalmente las dosis de semen se deben utilizar pocas horas después de su preparación (0-6 horas) y contienen entre 16- millones de espermatozoides. Con estas dosis y tiempos límite de inseminación se podrían inseminar entre y conejas a partir de la producción espermática de un macho. Cuando se incrementa el periodo de conservación del semen a temperaturas por encima de los 0 C, para inseminaciones que se va a producir entre las 24 y las 72 horas se recurre a incrementar notablemente el número de espermatozoides por dosis para mantener tasas de fertilidad y prolificidad normales (- millones, Gottardi, 1993; Alvariño et al., 1996, Perrier et al.,1998). Si bien estas dosis con alto contenido en espermatozoides incrementan las posibilidades de difusión al mejorar notablemente el radio de actuación del Centro de Inseminación, por incrementar el tiempo en que, al menos parte de los espermatozoides siguen siendo viables, sin embargo se reduce el número de dosis útiles por macho. Es decir, para inseminar al mismo número de conejas, son necesarios más machos seleccionados, o más dosis de semen de cada uno de ellos, lo que claramente resulta ser un factor limitante en la productividad de las granjas. Actualmente se comercializan en España varios diluyentes específicos de semen de conejo que garantizan una conservación eficaz del semen al menos 24 horas, por ejemplo MA-24 (Laboratorios Ovejero) y GALAP (IMV). No obstante, ninguno de ellos a fecha de hoy incluye la elaboración de dosis seminales por debajo de - millones. Un problema añadido en el proceso de inseminación artificial es que, posteriormente a la deposición del semen, se debe inyectar vía intramuscular un análogo sintético de GnRH para inducir la ovulación en la coneja. Así la técnica actual requiere de dos actuaciones independientes de un lado la deposición del semen y de otro la inducción de la ovulación. Una de las variantes del diluyente de la invención evita realizar estas actuaciones de forma independiente incorporando en su composición un análogo sintético de la GnRH y una sustancia que permite una 2

3 mejor absorción de éste, el dimetilsulfóxido. Las experiencias realizadas en granjas de conejos permiten obtener resultados de fertilidad y prolificidad competitivos con la metodología convencional, pero con una rentabilidad mayor. 1 La utilización de este diluyente permite mejorar la práctica de la inseminación desde el punto de vista de aplicación (rapidez) y desde el punto de vista sanitario evitando la difusión de enfermedades en las propias granjas por el uso repetido de agujas desechables y favoreciendo aún mas la preparación y utilización de dosis seminales individualizadas. Bibliografía Alvariño, J.M.R.; Lopez, F.J.; Del Arco, J.A.; Bueno, A.; Torres, R Effect of semen concentration on rabbit artificial inseminación with fresh or 24 horas stored semen. 6th World Rabbit Congress, vol. 2: Gottardi, L Conservasione a medio-fungo periodo del materiale seminale di coniglio. Rivista di Conigliocoltura : Perrier, G., Theau-Clement, M., Poujardieu, B., Delhome, G Essai de conservación de la semence de lapin pendant 72 heures. 7émes Journées de la Recherche Cunicole en France, Lyon. Descripción de la invención 2 3 El solicitante ha desarrollado un diluyente que puede ser utilizado para preparar dosis de semen que contengan entre 6 millones Y 12 millones de espermatozoides, cuando se pretende inseminar respectivamente dentro de las 6 primeras horas o entre las 6 y las horas, después de diluido. La temperatura de conservación es de C, así como los criterios de evaluación de los eyaculados a utilizar son similares a las recomendaciones realizadas por otros diluyentes. En una variante de la invención el diluyente presentaría la una composición que comprendería un sistema tampón, tipo Tris (hidroximetil)amino metano/acido cítrico, que garantice un ph estable en el rango 6,7-7,2, una fuente de energía para el metabolismos de los espermatozoides, tipo glucosa o fructosa, un agente quelante-conservante tipo EDTA (Acido etilendiamino tetracético (sal bisódica) ) y al menos un par antibióticos que impida la difusión de agentes patógenos y que puede ser al menos uno de entre, por ejemplo, Dihidroestreptomicina sulfato, Penicilina G sódica o Penicilina G procaína. Esta variante requeriría inducir con posterioridad a la inseminación, la ovulación de la coneja. 4 En otra variante de la invención este paso ulterior de inducción de la ovulación no sería necesario, simplemente añadiendo a la composición anterior 2 nuevos componentes, a saber, un análogo sintético de la GnRH (el acetato buserilina) y el Dimetilsulfóxido. El acetato de buserilina no es necesario inyectarla porque se absorbe en la mucosa del tracto reproducíos de la coneja y el dimetilsulfóxido favorece dicha absorción. Ejemplo1DLBR El diluyente DLBR presenta la siguiente composición por litro de agua destilada: 0 Tris(hidroximetil)amino metano - Acido Cítrico Glucosa Acido etilendiaminotetracético (sal bisódica) Dihidroestretomicina sulfato Penicilina G sódica Penicilina G procaína Ejemplo2DDA 0, M M 0,00 M 0,0 mm 1, mg UI UI Unavariantedelainvención es el diluyente DDA que se ha desarrollado a partir del diluyente DLBR. Alaformulación del diluyente DLBR se ha incorporado 6 µg de acetato de buserilina y 78,13 g de dimetilsulfóxido por litro. El diluyente no sólo conserva las características diferenciales descritas para el 3

4 DLBR sino que además permite inducir la ovulación sin necesidad de realizar posteriormente esta acción post-inseminación. Ejemplo 3 El volumen de inseminación (diluyente DLBR/DDA + carga de espermatozoides) empleado preferentemente en el método de inseminación artificial de hembras de conejo, fue de 0, ml

5 REIVINDICACIONES 1. Diluyente de semen de mamíferos caracterizado por comprender por cada litro de agua destilada: 1 2 Tris(hidroximetil)amino metano Acido cítrico Glucosa Acido etilendiamino tetracético (sal bisódica) Dihidroestreptomicina sulfato Penicilina G sódica Penicilina G procaína 0,2-0,3 M M M 0.0-0,0 mm 0,-1,4 mg UI UI 2.Diluyentedesemendemamíferos de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por comprender además, por cada litro de agua destilada: Acetato de buserilina 4- µg Dimetilsulfóxído -1 g 3.Diluyente de semen de mamíferos según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el semen diluido es semen de conejo. 4. método de inseminación artificial de mamíferos caracterizado por depositar en el aparato reproductor de la hembra una dosis de semen que tenga entre 6-12 millones de espermatozoides, conservada a C hasta durante horas, en el diluyente de la reivindicación 1, tras lo cual se inyecta vía intramuscular a la hembra un análogo sintético de GnRH.. Método de inseminación artificial según la reivindicación 4 en que el mamífero a inseminar es una hembra de conejo Método de inseminación artificial de mamíferos caracterizado por depositar en el aparato reproductor de la hembra una dosis de semen que tenga entre 6-12 millones de espermatozoides, conservada a C hasta durante horas, en el diluyente de la reivindicación 2, tras lo cual no es necesario inyectar vía intramuscular a la hembra un análogo sintético de GnRH. 7. El método de inseminación artificial de la reivindicaciónola6caracterizado porque el mamífero a inseminar es una hembra de conejo. 8. Uso del diluyente de la reivindicación 1 en la fabricación de composiciones para inseminación artificial de mamíferos de aplicación en producción animal. 9. Uso del diluyente de la reivindicación 2 en la fabricación de composiciones para inseminación artificial de mamíferos de aplicación en producción animal.. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9 caracterizado porque el mamífero es un conejo. 0

6 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES k 21 N. solicitud: k 22 Fecha de presentación de la solicitud: k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 1 Int. Cl. 7 : A01N 1/02, A61K 3/2 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas Y ES A1 (UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID) , 1,3,8, todo el documento. Y US A (SEXTON) , tabla 1. 1,3,8, Y GB A (TWYFORD LAB LTD) , página 2; 1,3,8, reivindicación. A US A (RICHTER et al.) , columna 2, línea 6 - columna 3, línea 12. A OSINOWO, O. et al. Examination of some processing methods for freezing boar semen, AUSTRALIAN JOURNAL OF BIOLOGICAL SCIENCES, 1976, Volumen 29, n 4, páginas Material and methods. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página J. López Nieto 1/1